SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO DE LA LEPTOSPIRA PATÓGENA BIOFILM

Los patógenos Leptospira spp. Son el agente causal de la leptospirosis. La formación Biofilm en
leptospiras es una nueva área de estudio, y su papel en la patogenesia no se explora
completamente. Al igual que en otras bacterias biofilm, Leptospira biofilm puede desempeñar
un papel significativo en la resistencia a los antibióticos. En este estudio, la susceptibilidad
antimicrobiana de Leptospira biofilm fue investigada por el ensayo de la placa de 96-Well usando
el azul de Alamar. Leptospira biofilm demostró cinco para multiplicar por seis en resistencia en
todas las tensiones usadas. La gama de concentraciones bactericidas mínimas para la penicilina
G, ampicilina, tetraciclina y doxiciclina fue de 1, 600U/ml, 800 – 1, 600/ml, 800 – 1, 600/ml y 800
– 1, 600/ml, respectivamente. En el substrato del agar, el biofilm demostró el aumento de seis-
a séptuple en resistencia a los antibióticos comparados a la célula de plancton. El presente
estudio enfatiza la importancia de la formación de biofilm y sus patrones de susceptibilidad a
antibióticos. Esto podría allanar el camino para idear la estrategia apropiada para prevenir la
ocurrencia de la leptospirosis crónica potencial en áreas endémicas y también durante una
situación del brote.

Introducción

La leptospirosis es una zoonosis mundial causada por la espiroqueta del género leptospira. Estas
bacterias son transportadas por una variedad de especies animales en sus túbulos renales y
contaminan el medio ambiente al ser arrojados en la orina. La gente se infecta accidentalmente
cuando entra en contacto con un ambiente contaminado con Leptospira a través del tejido, el
fluido del cuerpo, o la orina de los animales portadores. La diagnosis de la leptospirosis es a
menudo difícil debido a la presentación y a las limitaciones clínicas no específicas en pruebas de
laboratorio, y la leptospirosis es tratada generalmente por la quimioterapia empírica. Los
clínicos reportan a menudo la falta de la terapia antibiótico. Hay también informes de la
detección y del aislamiento de Leptospira incluso después de terapia antibiótico prolongado en
animales y seres humanos.

Se consideró que el Leptospira era un organismo solitario hasta que se encontró que formaba
biofilm en el medio ambiente e in vitro. 5,6 estudios son indicativos de que las cepas patógenas
pueden colonizar el huésped y formar biofilm y agregados celulares en animales. Los
tratamientos antibióticos no pudieron erradicar leptospiras que colonizan ratones infectados.

La información amplia con respecto a la susceptibilidad del Leptospira contra varios agentes
antimicrobianos existe en la literatura. Sin embargo, no hay estudio con respecto a la
susceptibilidad de diferentes formas morfológicas de Leptospira, a saber, agregados y biofilm.
La consideración de todas las formas phological del MOR de los microbios sería necesaria para
un gravamen completo de su susceptibilidad antibiótico. Por lo tanto, presumimos que la
agregación de la célula y la formación biofilm pueden ser la causa de la resistencia antibiótico.
En el presente estudio, sujetamos la cepa leptoespiral de biofilm a antibióticos y comparamos
la concentración mínima bactericida (MBC) con la de su forma plancton.
MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas y ensayo de formación biofilm

Las cepas de Leptospira spp. Se recuperaron del centro regional de investigación médica (ICMR),
PortBlair, India, y se enumeran en el cuadro 1. Las cepas leptoespiral se tamizaron por su
capacidad de adherirse o formar biofilm a las paredes de los pozos en placas de 96-well. El
ensayo de formación de biofilm se realizó en medio líquido Ellinghausen – McCullough – Johnson
– Harris (EMJH), complementado con medio de enriquecimiento (albúmina sérica bovina +
interpolación 80), seguida de la metodología descrita anteriormente. Brevemente, los biofilms
fueron permitidos formar incubando en 30C por 4-7 días sin temblar. Cada 24 horas, el medio
de crecimiento se descartó y se agregó recientemente. El medio EMJH fresco se agregó a los
pozos como un control. Cada pocillo se lavó tres veces con solución salina tamponada con
fosfato (PBS) en condiciones asépticas para eliminar las bacterias no consolidadas. El
experimento se repitió para 10 cepas (cuadro 1) de Leptospira, y la capacidad de estas cepas
para formar biofilm se determinó según la metodología de tinción de violeta de cristal, descrita
por O´toole.

Revestimiento del sustrato

Los veinte y cinco microlitros de 2% de agar fundido (BD Difco) en agua destilada (autoclavado)
se cubrieron uniformemente en los pocillos de la placa de poliestireno 96-Well (Corning) y se
probaron como sustrato de Unión.

Preparación de soluciones de antibióticos

Las soluciones comunes de las sustancias antimicrobianas, a saber penicilina G, ampicilina,
tetraciclina, y doxiciclina (Sigmaaldrich), fueron preparadas según el Comité Nacional para el
documento de estándares clínicos del laboratorio M100-S24.

Susceptibilidad antimicrobiana de Leptospira biofilm

La susceptibilidad antimicrobiana de Leptospira biofilms fue realizada según lo descrito

previamente por Pettit et al., con la siguiente modificación. El Leptospira biofilm fue crecido en
una placa del microtitulación del cultivo de tejido de la placa del micropolio de la base de 96-
Well (placas de polivinilo) y las placas 96well del poliestireno tratado cultivo non-Tissue (cubierta
con el agar), según lo descrito arriba. Estos fueron lavados dos veces con solución PBS 250 ml.
Las diluciones dobles seriales que se extendían a partir del 1.600 a 0.02 mg/ml para los
antibióticos fueron preparadas en medio EMJH. Se añadió una muestra de 200 ml de cada
concentración a los pocillos correspondientes, y se incubaron las placas para las 24 horas en
30C. El medio EMJH sin antibiótico se agregó a los pocillos que contenían cada una de las cepas
de ensayo, que sirvieron como control. Después de la exposición, la solución fue desechada, y
los pozos eran llenados (100 ml) con PBS. La viabilidad de Leptospira en el biofilm fue
comprobado usando Alamar azul (AB), según la metodología descrita en otra parte. Brevemente,
10 ml AB se agregó a cada pocillo e incubado para 6 horas a 30°C. Después de la incubación, la
solución fue aspirada a la placa de microtitulación del cultivo de tejido plano estéril 96-well. Diez
microlitros de AB en PBS estéril fueron mantenidos como control. La densidad óptica (OD) de la
placa fue leída en 570-600. El MBC se determinó utilizando el valor OD. Otro conjunto de
experimentos se realizó para comprobar la viabilidad de leptospiras utilizando el método
convencional modificado descrito por Mataraci y Dosler. Brevemente, después de la exposición
antibiótico, los pozos fueron raspados a fondo, especialmente los bordes bien. El contenido bien
fue transferido a la solución de 1 ml PBS y sonificación en 40Hz para 30 por la conmutación
encendido y apagado para los tiempos cinco (Labsonic; Sartorius Stedim Biotech). La suspensión
bacteriana desintegrada (0.5 ml) fue inoculada en medio EMJH fresco e incubada en 30C por 1
mes. Durante este período, el crecimiento se monitoreó periódicamente. El MBC fue
considerado como la concentración más baja del antibiótico que previno el rebrote bacteriano.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

La intensidad de la formación de biofilm varía entre las cepas y el número de pasajes. Cuando
se anotó la formación biofilm de 10 cepas leptoespiral sobre cloruro de polivinilo, cuatro cepas
clasificadas de alta y tres cepas calificaron de medio, mientras que las otras tres cepas no
demostraban cualquier formación biofilm visible hasta el día primera (cuadro 1), como se
informó anteriormente. Sin embargo, la formación del biofilm en presencia del agar del 2% era
uniforme, que proporcionó el ambiente viscoso para la agregación de leptospiras según lo
descrito por Pettit et al., para hacer el análisis tan eficaces como sea posible, el punto final más
corto posible de la reducción del AB era determinado para Leptospiras (datos no mostrados). La
susceptibilidad antimicrobiana de la leptospira de plancton fue determinada por la estimación
de MBC. MBCs son definidos como la concentración más baja de la droga, que da lugar a la
reducción del 50% de AB con un pozo purpurino, 90min después de la adición de AB. El MBCs
de las células de plancton era 25-100U/ml, 12.5-50 mg/ml, 50-100 mg/ml, y 50-100 mg/ml para
la penicilina G, ampicilina, tetraciclina, y doxiciclina, respectivamente. Para biofilm, se observó
un aumento de la resistencia de cinco a seis, y los MBCs fueron 1, 600U/ml, 800 – 1, 600/ml, 800
– 1, 600/ml y 800 – 1, 600/ml para la penicilina G, ampicilina, tetraciclina y doxiciclina,
respectivamente. Cuando el agar fue utilizado como sustrato para la formación de biofilm, la
resistencia a los antibióticos tenía valores similares de MBC. Esto mostró un aumento de uno a
doble, con > 1.600 formando biofilm sin sustrato, para todos los antibióticos y las cepas
utilizadas. Sin embargo, la resistencia fue seis-a séptuple más alta que las células de plancton
(cuadro 2). El agar de LVW fue divulgado recientemente como nuevo medio para probar la
susceptibilidad antibiótico del leptospiras. Sin embargo, ninguna diferencia significativo en
biofilm a formación o susceptibilidad antibiótica se observó cuando se usó agar/agarosa/LVW
agar Medium como sustrato (datos no mostrados). Estos conclusiones pueden correlacionarse
con otros estudios sobre Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus spp. y así sucesivamente,
que puede ser debido al rasgo multifactorial del biofilm microbiano, por el cual llegan a ser
resistentes a los antibióticos, es decir, barrera física de la sustancia extrapolimérica,
microambiente químico alterado dentro del biofilm, metabólico inactivo subpoblación en
biofilm, y la presencia de células persisten, que pueden servir para repoblar el biofilm.

Las bacterias Biofilm son una preocupación importante para los clínicos en el tratamiento de las
enfermedades infecciosas debido a su resistencia a una amplia gama de antibióticos. 17
recientemente, la investigación Leptospira se ha centrado en explorar las posibilidades de
formación de Biofilm dentro del anfitrión, así como el entorno. Se ha establecido que Leptospira,
al igual que otros microbios que forman biofilm, son capaces de adherirse a sustancias inertes
in vitro. 5,6 el presente estudio es el intento primera de estimar los patrones de susceptibilidad
en Leptospira biofilm.

Debido a la carencia del método estándar para estimar la susceptibilidad antibiótico de

Leptospira biofilm, el método del AB fue adoptado en este estudio, según lo descrito para el
estafilococo spp. Biofilm. AB se ha utilizado con éxito antes para la susceptibilidad
antimicrobiana prueba de leptospiras plancton. Este método fue encontrado para ser eficaces
en los estudios de actividades antileptospiral de extractos vegetales. Como se describió
anteriormente, los resultados fueron visualmente apreciables, a excepción de los compuestos
de color, a saber, doxiciclina y tetraciclina, donde el MBC podría determinarse por
espectrofotometría.

Se cree que la colonización de túbulos renal proximal del anfitrión mamífero por leptospires
patógeno sigue vía la formación de conjuntos de la célula y biofilm, llevando al mantenimiento
del carro crónico. En ratones C57BL/6, la representación viva de bioluminiscencia leptospires
demuestra que la colonización renal de L. las interrogantes proporciona la fuga de la cautela
del mecanismo de defensa de la sangre y antibióticos. En este estudio, el tratamiento con
antibióticos con penicilina, ciprofloxacin y doxiciclina no pudo eliminar todos los leptospiras de
los túbulos en etapa crónica. Asimismo, el presente estudio ha demostrado resistencia a los
antibióticos a través de la formación de biofilm in vitro. Estos resultados están conforme a los
datos de la literatura, que divulgan que la penicilina u otros antibióticos probaron eficaces
solamente en la etapa temprana de la infección.

En conclusión, el presente estudio enfatiza la importancia de la formación de biofilm en

leptospiras y su patrón de susceptibilidad a antibióticos. Por lo tanto, este estudio podría
facilitar la idea de estrategias apropiadas para prevenir la leptospirosis crónica potencial en
áreas endémicas y también durante una situación de brotes.