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Trabajo Especial de Grado presentado ante la Ilustre Universidad de Carabobo, para optar
al título de Ingeniero Químico
A mis Padres.
Naileth Bonilla y Aníbal Rosales, sin duda alguna merecen esta dedicatoria por su amor,
paciencia, confianza y apoyo. Los mejores padres del mundo, por enseñarme desde pequeña
valores y principios; y por sobre todas las cosas, a luchar y nunca darse por vencido en las metas
propuestas.
iv
APROVECHAMIENTO DEL SUERO LÁCTEO COMO FUENTE PARA LA
PRODUCCIÓN DE UN BIOPOLÍMERO BASADO EN ÁCIDO
POLILÁCTICO
RESUMEN
ABSTRACT
The whey is a by-product of chess making process, which is not adequately exploited in Venezuela. This
by-product can be used as a natural source for the production of lactic acid (LA). For this reason that in
this research, the general objective was to use the whey as a source of the production of a biopolymer base
on Poly-Lactic Acid (PLA). Then, a series of activities were carried out to determine the physicochemical
characteristics of the collected whey and thus to determine which of them represented the best option to be
used as a substrate. In addition, the best microorganism to be used during the fermentation process of the
whey for the production of LA was chosen. The conditions for the polycondensation of the purified LA
were established and the characterization of the obtained polymer was carried out. The tests made it
possible to classify the whey collected as acid type whey. Fermentation was performed for 24 hours using
the bacterium Lactobacillus casei at a temperature of (37±1) °C. The yield obtained in the production of
LA was 51%. Purification of the acid was performed by the liquid-liquid separation method with 1-
buthanol. The concentration of the purified lactic acid was 20,21 %p/v. The polycondensation process was
achieved in 8 hours. It was obtained a polymer having a melting point of 173°C, density 1,3g/mL and a
hardness of 62 Shore A. The product obtained was also characterized by infrared spectroscopy where
observed bands of polylactic acid and degradability study was carried out by hydrolysis, reaching a loss of
weight of 4,13% in the analyzed samples after 15 days. The results obtained showed that the whey
represents a suitable substrate for the production of PLA and that the obtained polymer is degradable.
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ÍNDICE GENERAL
Introducción…………………………………………………………………………………………….. 1
Capítulo I. Planteamiento del problema………………………………………………………………... 2
1.1. Descripción del problema………………………………………………………………………….. 2
1.2. Formulación del problema…………………………………………………………………………. 3
1.2.1. Situación actual……………………………………………………………………………….. 3
1.2.2. Situación deseada……………………………………………………………………………... 3
1.3. Objetivos…………………………………………………………………………………………… 4
1.3.1. Objetivo General………………………………………………………………………………. 4
1.3.2. Objetivos Específicos………………………………………………………………………….. 4
1.4. Justificación……………………………………………………………………………………….. 4
Capítulo II. Marco referencial………………………………………………………………………….. 5
2.1. Antecedentes……………………………………………………………........................................ 5
2.2. Bases teóricas……………………………………………………………………………………… 8
2.2.1. Definición y tipos de lactosuero……………………………………………………………….. 8
2.2.2. Lactosa…………………………………………………………………………………………. 8
2.2.3. Ácido láctico…………………………………………………………………………………... 9
2.2.4. Microorganismos productores de ácido láctico………………………………………............... 12
2.2.5. Fermentación……………………………………………………………................................... 13
2.2.6. Separación y purificación del ácido láctico……………………………………………………. 15
2.2.7. Polímeros………………………………………………………………………………………. 16
2.2.8. Propiedades de los polímeros………………………………………………………………….. 16
2.2.9. Ácido Poliláctico (PLA)………………………………………………………………………. 17
2.2.10. Degradación……………………………………………………………………………………. 20
Capítulo III. Marco metodológico……………………………………………………………………… 22
3.1. Tipo de investigación……………………………………………………………………................ 22
3.2. Fases metodológicas………………………………………………………………………………. 22
3.2.1. Actividades iníciales………………………………………………………………….............. 22
3.2.2. Determinación de características fisicoquímicas del suero lácteo…………………………….. 22
3.2.3. Aplicación del proceso de purificación del ácido obtenido…………………………………… 22
3.2.4. Síntesis del PLA…….……...………………………………………………………………….. 22
3.2.5. Evaluación del polímero sintetizado………………………………………………….............. 22
3.2.6. Actividades finales…………………………………………………………………………….. 22
vii
3.3. Operacionalización de los objetivos…………….…………………………………………...…….. 22
3.3.1. Determinar las características fisicoquímicas del suero lácteo………………………………... 22
3.3.2. Realizar la fermentación láctica con el microorganismo más adecuado………………………. 27
3.3.3. Emplear la alternativa más conveniente para el proceso de purificación del ácido láctico
obtenido de la fermentación del suero lácteo…………………………………………………………... 30
3.3.4. Sintetizar el polímero con el ácido láctico obtenido en el proceso de purificación……....... 34
3.3.5. Evaluar propiedades del polímero obtenido y su capacidad de degradación…………………. 36
Capítulo IV. Resultados y discusión…………………………………………………………………… 40
4.1. Determinar las características fisicoquímicas del suero lácteo……………………………………. 40
4.2. Realizar la fermentación láctica con el microorganismo más adecuado………………………….. 42
4.3. Emplear la alternativa más conveniente para el proceso de purificación del ácido láctico obtenido
de la fermentación del suero lácteo…………………………………………………………............ 45
4.4. Sintetizar el polímero con el ácido láctico obtenido en el proceso de purificación……………….. 50
4.5. Evaluar propiedades del polímero obtenido y su capacidad de degradación……………………… 51
Conclusiones…………………………………………………………………………………............... 54
Recomendaciones………………………………………………………………..................................... 55
Referencias bibliográfica……………………………………………………………………………….. 56
Apéndice A. Datos recolectados………………………………………………………………………... 61
Apéndice B. Cálculos típicos…………………………………………………………………………... 67
Anexo I. Información para la selección del microorganismo fermentador…………………………….. 82
Anexo II. Información bibliográfica……………………………………………………………………. 83
Anexo III. Métodos de purificación……………………………………………………………………. 84
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 2.1 Composición promedio del lactosuero dulce y ácido………………………………………... 8
Tabla 2.2 Propiedades fisicoquímicas del ácido láctico………………………………………………... 10
Tabla 2.3 Propiedades del ácido poliláctico y plasticos convencionales………………………………. 17
Tabla 3.1 Escala de valoración para criterios de selección…………………………………………….. 28
Tabla 4.1 Características fisicoquímicas de los sueros y cambios producidos a causa del pre-
tratamiento utilizado …………………………………………………………………………………… 40
Tabla 4.2 Matriz de Moody para la selección de la bacteria a utilizar en la fermentación láctica…….. 42
Tabla 4.3 Características del medio de cultivo inoculado con la bacteria Lb. casei y cambios
producidos a causa de la fermentación ………………………………………………………………… 44
Tabla 4.4 Parámetros de la solución fermentada antes y después del proceso de purificación………... 45
Tabla 4.5 Información sobre el proceso de polimerización……………………………………………. 50
Tabla 4.6 Caracterización del polímero obtenido………………………………………………………. 51
Tabla 4.7 Variación ocurrida en el proceso de degradación …………………………………………... 52
Tabla A.1 Datos requeridos para la caracterización del suero proveniente de la quesera familiar…….. 61
Tabla A.2 Datos requeridos para la caracterización del suero proveniente de la empresa LACSA…… 61
Tabla A.3 Datos requeridos para la caracterización del suero pre-tratado proveniente de la quesera
familiar…………………………………………………………………………………………………. 62
Tabla A.4 Datos requeridos para la caracterización del suero pre-tratado proveniente de la empresa
LACSA ………………………………………………………………………………………………… 62
Tabla A.5 Datos requeridos para la determinación de parámetros de seguimiento de la fermentación
del suero proveniente de la quesera familiar…………………………………………………...………. 63
Tabla A.6 Datos requeridos para la determinación de parámetros de seguimiento de la fermentación
del suero proveniente de la empresa LACSA…………………………………...……………………… 63
Tabla A.7 Datos tomados después de la fermentación de prueba del suero proveniente de la quesera
familiar………………………………………………………………………………………………….. 63
Tabla A.8 Datos tomados después de la fermentación de prueba del suero proveniente de la empresa
LACSA…………………………………………………………………………………………………. 64
Tabla A.9 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra antes de la adición de
carbonato………………………………………………………………………………………………... 64
Tabla A.10 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado mediante el método de
lactato…………………………………………………………………………………………………… 64
ix
Tabla A.11 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado de la fase acuosa, obtenida
por el método de extracción líquido-líquido…………………...………..……………………………… 64
Tabla A.12 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado de la fase orgánica,
obtenida por el método de extracción líquido-líquido……………………….…………………………. 64
Tabla A.13 Parámetros necesarios para determinar la densidad del ácido purificado………................. 65
Tabla A.14 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra diluida de ácido purificado……... 65
Tabla A.15 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra diluida de ácido pre-concentrado.. 65
Tabla A.16 Parámetros necesarios para el cálculo de la densidad del polímero sintetizado…………… 65
Tabla A.17 Punto de fusión del polímero sintetizado, calculado mediante el Método de Thiele……… 65
Tabla A.18 Acidez iónica de las soluciones antes y después del proceso de degradación……………... 66
Tabla A.19 Peso de las muestras antes y después del proceso de degradación………………………… 66
Tabla A.20 Valores de Dureza del polímero sintetizado……………………………………………….. 66
Tabla I.1 Información relevante respecto al uso de bacterias u hongos en el proceso fermentativo…… 82
Tabla II.1Productividad de ácido láctico en diferentes condiciones de fermentación tipo lote……..…. 83
Tabla II.2 Información teórica del ácido láctico y ácido poliláctico…………………………………… 83
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1 Molécula de lactosa……….…………………………………………………....................... 9
Figura 2.2 Estructuras del ácido L-láctico y ácido D-láctico……………………..……………………. 9
Figura 2.3 Molécula de ácido láctico vista desde diferentes perspectivas……………………………... 10
Figura 2.4 Métodos de síntesis para la obtención de PLA……………………………………………... 18
Figura 3.1 Montaje para el proceso de desnatado……………………………………………………… 23
Figura 3.2 Autoclave y suero con proteínas precipitadas………………………………………………. 23
Figura 3.3 Suero antes y después del pre-tratamiento………………………………………………….. 24
Figura 3.4 Equipo utilizado para la determinación de °Brix…………………………………………… 24
Figura 3.5 Coloración del suero antes y después de la titulación………………………………………. 25
Figura 3.6 Equipo utilizado para la determinación de pH……………………………………………… 25
Figura 3.7 Muestra calcinada del suero…………………………………………………....................... 26
Figura 3.8 Coloración del suero después de la segunda valoración……………………………………. 26
Figura 3.9 Solución a esterilizar………………………………………………………………………... 29
Figura 3.10 Proceso fermentativo con agitación y control de temperatura…………………………….. 29
Figura 3.11 Montaje para el proceso de destilación simple……………………………………………. 30
Figura 3.12 Montaje para el control de temperatura de calentamiento………………………………… 31
Figura 3.13 Mezcla suero fermentado con 1-Butanol………………………………………………….. 31
Figura 3.14 Montaje utilizado para evaluar el punto de ebullición de la solución…………………….. 32
Figura 3.15 Disposición de muestra en el refractómetro...……………………………………………... 33
Figura 3.16 Recipiente para determinar la densidad (picnómetro)…………………………………….. 33
Figura 3.17 Mezcla de ácido y agua -Prueba de miscibilidad………………………………………….. 34
Figura 3.18 Equipo para obtención de infrarrojos (espectrómetro)…………………………………… 34
Figura 3.19 Montaje usado en la síntesis del ácido poliláctico………………………………………… 35
Figura 3.20 Probeta con agua y polímero obtenido…………………………………………………….. 36
Figura 3.21 Montaje utilizado para la evaluación del punto de fusión del polímero……………...…… 37
Figura 3.22 Polímero expuesto a la llama…………………………………………………………….. 37
Figura 3.23 Equipo para la medición de dureza (durómetro)………………………………………….. 38
Figura 3.24 Exposición de la muestra polimérica al agua de chorro…………………………………… 38
Figura 4.1 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido después del proceso de purificación
mediante el método 1- Obtención de lactato (arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial
(abajo)…………………………………………………………………………………………………... 47
xi
Figura 4.2 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido de la fase acuosa- Método 2: Separación
líquido-líquido (arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial (abajo)…………………….. 48
Figura 4.3 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido de la fase orgánica- Método 2: Separación
líquido-líquido (arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial (abajo)……………………. 49
Figura 4.4 Polímero obtenido en solución……………………………………………………………… 50
Figura 4.5 Espectro infrarrojo del polímero sintetizado………………………………………………. 52
xii
INTRODUCCIÓN
La importancia de la bioconversión del suero lácteo en AL radica en la posibilidad que ofrece el ácido
para producir su polímero correspondiente (ácido poliláctico, mejor conocido por sus siglas en inglés
como PLA), un polímero biodegradable y gran competidor frente a otros plásticos de origen petroquímico
por su amplio rango de propiedades, desde el estado amorfo hasta el estado cristalino.
En este trabajo se utilizó el suero lácteo para producir un polímero basado en PLA. Para ello se realizó la
caracterización de los sueros utilizados como sustrato para el proceso fermentativo, que busca la obtención
de AL. El ácido es purificado mediante el método de separación líquido-líquido con 1-butanol y luego
polimerizado mediante policondensación directa utilizando zinc metálico como catalizador.
La información contenida en este trabajo sería un valioso aporte para investigaciones posteriores, cuyo
interés sea el de disminuir el grado de contaminación ambiental generado por el vertimiento del
lactosuero en los suelos y por el uso de plásticos de origen petroquímico.
El documento consta de cuatro capítulos, los cuales están estructurados de la siguiente manera: en el
capítulo I se presenta el planteamiento del problema, los objetivos planteados y la justificación. El
segundo contiene los antecedentes y las bases teóricas necesarias para el desarrollo de la investigación.
Por otro lado el tercero señala el tipo de investigación y abarca la metodología necesaria para el
cumplimiento de los objetivos planteados; y el último capítulo contiene los resultados obtenidos en la
investigación. Además con conclusiones y recomendaciones producto de la investigación, las referencias
bibliográficas utilizadas y apéndices con datos experimentales y cálculos típicos.
1
CAPÍTULO I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En esta sección se presenta el problema en estudio, especificándose su propósito, situación actual y
deseada, así como el objetivo general y los específicos de la investigación. Por último, se exponen las
razones que justifican la investigación y se establecen las limitaciones existentes.
El suero de leche es el subproducto más abundante de la industria láctea. Es una sustancia de residuo
obtenida en la fabricación de queso. Sus características por si solas no representan una aceptación en el
mercado y no se puede comercializar como suero líquido, ya que posee bajo porcentaje de fuentes
aprovechables para la alimentación humana como lactosa (3,3-6,0%) y proteínas (0,32-0,70%). La mayor
parte del lactosuero se convierte en un efluente con alto grado de contaminación cuando se vierte en el
agua, debido a su gran demanda biológica y química de oxígeno (Urribarrí et al., 2004).
El AL (ácido 2-hidroxi-propanoico) es un ácido orgánico de alto valor, debido a sus diversas aplicaciones
en la industria de alimentos, farmacéutica, química, entre otras. Por lo tanto, la producción biotecnológica
del AL ha adquirido gran importancia industrial con respecto a la síntesis química, debido a que usa
materias primas renovables y es amigable con el ambiente. Además ofrece varias ventajas como el bajo
costo de los sustratos, bajas temperaturas de producción y bajo consumo de energía (García et al., 2010).
En este trabajo especial de grado se realizó un estudio de la factibilidad en el aprovechamiento del ácido
láctico en la síntesis de un polímero degradable basado en ácido poliláctico (PLA). Este tipo de polímero
es apropiado para sustituir a los plásticos convencionales debido al bajo impacto ambiental que producen
por su biodegradabilidad. El PLA es un biopolímero termoplástico utilizado para la producción de hilo
para sutura, implantes, cápsulas para la liberación lenta de fármacos, prótesis, producción de envases y
2
empaques para alimentos y producción de películas para la protección de cultivos en estados primarios.
Este biopolímero ha despertado el interés de investigadores, productores y procesadores, ya que fuera de
su degradabilidad, se ha encontrado que puede ser un gran competidor frente a otros plásticos de origen
petroquímico por su amplio rango inusual de propiedades, desde el estado amorfo hasta el estado
cristalino (Serna et al., 2003).
En Venezuela, aún no se cuenta con centros para la producción de plásticos a base de PLA, con lo que esta
investigación generaría un gran aporte para la iniciativa de una nueva alternativa en el mercado de
materiales que reduzca el impacto ambiental generado por los desechos lácteos de la industria quesera; y a
su vez sirva como fuente para la preservación del ambiente aprovechando la biodegradabilidad del PLA.
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1.3. OBJETIVOS
1.3.1. Objetivo General
Aprovechar el suero lácteo para su utilización como fuente de producción de un biopolímero basado en
ácido poliláctico.
1.4. JUSTIFICACIÓN
Tomando en cuenta el impacto ambiental generado por la producción de suero lácteo, se plantea
desarrollar a través de documentación bibliográfica y estudios experimentales este proyecto, con la
finalidad de obtener un polímero degradable a partir de este lactosuero, con el fin de contribuir con la
disminución de la contaminación causada por el mismo y buscar una forma de aprovechar este desecho,
creando un nuevo material en el mercado nacional. En esta investigación se busca obtener ácido láctico
del lactosuero mediante fermentación láctea. Este ácido al ser polimerizado forma el PLA, que es el
polímero de interés, el cual se consideraría comercializarlo, contribuyendo así al desarrollo económico de
la región, mejorando la calidad de vida de los ecosistemas que están siendo afectados por la
contaminación de otros polímeros sintéticos y del mismo suero lácteo. Su elaboración no generaría costos
mayores a los invertidos en la fabricación de los plásticos comunes en el mercado, ya que se requeriría
menor cantidad de energía para su procesamiento y la materia prima no tiene valor comercial alguno, lo
que proporciona una ventaja para el desarrollo de este proyecto.
Esta alternativa propone un avance en la investigación, debido a que permite ampliar el conocimiento
científico, favoreciendo el aprovechamiento de estos residuos para obtener un producto de gran utilidad,
aportando también información para la documentación de nuevas tecnologías para la obtención de
biopolímeros.
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CAPÍTULO II. MARCO REFERENCIAL
En este capítulo, se presentará la información bibliográfica que hace referencia a las investigaciones
previas realizadas y se exponen las bases teóricas que sustentan y facilitan la comprensión del estudio.
2.1. ANTECEDENTES
Medina, et al., (2014), elaboraron un trabajo sobre la obtención de ácido láctico por medio de la
fermentación del mosto del fruto de cují (Prosopis juliflora), y posteriormente realizaron una poli-
condensación con zinc metálico para transformarlo a ácido poliláctico (PLA). El objetivo principal de
esta investigación fue la obtención de ácido láctico por fermentación del mosto del fruto de cují y su
posterior poli-condensación con zinc metálico a poli (ácido láctico) (PLA). Se determinaron condiciones
óptimas de temperatura, pH y °Brix para el crecimiento óptimo de la bacteria Lactobacillus bulgaricus y
se concluyó, que el mosto de cují representa un buen sustrato para la producción del PLA por su alto
contenido de azúcares fermentables.
La principal diferencia de este trabajo con el actual es la materia prima a utilizar, por esta razón la
metodología empleada y las condiciones de operación no son necesariamente las mismas. También se
diferencian en que el objetivo final del trabajo de referencia, es la obtención del poli (ácido láctico) sin
determinar sus propiedades, mientras que en el actual, es de gran interés estudiar las características físicas
y mecánicas, así como también su degradabilidad.
La diferencia más resaltante en el trabajo de referencia es básicamente la materia prima a utilizar para la
obtención del polímero, ya que el anterior utiliza la cáscara de frutos de parchita y naranja, mientras que
en el actual se partirá del lactosuero para obtener ácido láctico y polimerizarlo a ácido poliláctico. De
igual forma la metodología empleada para la obtención del polímero no corresponde a las realizadas en
este trabajo.
5
Jiménez, et al., (2012), realizaron la síntesis y caracterización de poli (ácido L–láctico) por
policondensación directa, obtenido del fermento de desechos agroindustriales de banano (Musa
acuminata aaa variedad Cavendish cultivar Gran naine) en Costa Rica. Este trabajo describe la
síntesis del poli (ácido L–láctico) por policondensación directa del ácido láctico en tres etapas: en primer
lugar una concentración del 14 % al 77 %, una segunda etapa de oligomerización a 150 °C utilizando una
presión inicial de 850 mbar, empleando gradiente de vacío de 850 mbar a 25 mbar en 6 horas; y una etapa
final de polimerización a 170 °C, empleando octoato de estaño (II) como catalizador a 25 mbar constantes.
A pesar de aplicar el mismo método de polimerización, este se realiza bajo diferentes condiciones de
operación, es decir, diferentes temperaturas, presiones, tiempos de síntesis y catalizador. Además, el ácido
láctico utilizado para el proceso de síntesis del ácido poliláctico, proviene de los desechos agroindustriales
de banano y no del suero lácteo.
Ríos, A. (2011), realizó la caracterización del proceso de obtención y separación de ácido láctico a
partir de la fermentación de suero lácteo utilizando la tecnología de membranas. En este trabajo se
estudiaron las mejores condiciones de crecimiento para Lactobacillus casei, microorganismo necesario
para la fermentación del lactosuero. Las fermentaciones para la producción de ácido láctico se realizaron
en un proceso tipo lote a diferentes pH y se determinó que las mejores condiciones para el crecimiento de
Lactobacillus casei fueron 50 g/L de sustrato con 1% inóculo. La fermentación realizada a pH 6, logró la
mayor productividad. En este trabajo se probaron dos membranas de nano filtración para la separación de
ácido láctico. Los resultados de este trabajo sugieren que el suero lácteo es un buen sustrato para, el
crecimiento de la bacteria Lactobacillus casei y la producción de ácido láctico. Además, el trabajo
también sugiere que la tecnología de nano filtración puede ser usada para concentrar y purificar el ácido
láctico.
El trabajo realizado se relaciona con el presente estudio ya que ambos buscan obtener ácido láctico a partir
del suero lácteo, sin embargo este estudio empleó separación mediante el uso de membranas, mientras que
en la investigación actual, se empleó separación por lactato y separación líquido- líquido con 1-butanol.
Además, el trabajo anterior solo tiene el interés de caracterizar el proceso de obtención del ácido láctico,
mientras que el actual va más allá, buscándole una utilidad al ácido obtenido.
Ojeda, J. (2011), desarrolló un trabajo basado en estudios de parámetros fisicoquímicos en los diversos
productos lácteos. Se llevó a cabo la medición de sólidos totales, mediante dos métodos gravimétricos:
análisis por estufa (método normalizado) y análisis por microondas (método rápido). También se
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realizaron ensayos químicos de acidez titulable, viscosidad, °Brix e índice de homogeneidad, los cuales
son de utilidad para determinar las características fisicoquímicas del suero lácteo.
Gil, et al., (2008), realizaron una bioproducción de ácido láctico a partir de residuos de cáscara de
naranja (Citrus sinensis). Esta investigación propone un proceso para la obtención de ácido láctico a
partir de la bio-transformación de cáscara y bagazo de naranja en fase sólida con Rhizopus oryzae. Se
evaluó la viabilidad técnica de utilizar operaciones de intercambio iónico como pasos intermedios para la
reducción de impurezas. Asimismo, se evaluaron y compararon dos procesos: (a) Esterificación del ácido
láctico con 1-butanol y (b) Cristalización evaporativa de sales de sulfato de calcio, como posibles rutas de
separación secundaria y concentración.
El trabajo de referencia tenía como objetivo principal obtener ácido láctico a partir de residuos de la
cáscara de naranja y no presentan una utilidad final para el producto obtenido; mientras que en el trabajo
actual, la producción de ácido láctico se realiza utilizando el suero lácteo como materia prima y el ácido
obtenido se utiliza para obtener ácido poliláctico.
Urribarrí, et al., (2004), realizaron la obtención de ácido láctico a partir de suero de leche, utilizando
Lactobacillus helveticus en cultivo continuo. Se estudió el cultivo continuo de la bacteria Lactobacillus
helveticus en un suero de leche desproteinizado, estudiando las condiciones más adecuadas como pH y
temperatura para el crecimiento del microorganismo. Se caracterizó el suero de leche, determinando su
contenido de lactosa, nitrógeno, proteínas, fósforo y pH. Su estudio reveló y sugirió el uso potencial del
lactosuero como sustrato para bacterias homolácticas.
La diferencia más resaltante de este trabajo de investigación es el uso de la bacteria, ya que en el actual
trabajo no se escoge la bacteria de forma arbitraria si no que se realiza un estudio para escoger la más
apropiada. Este trabajo solo se basa en la obtención del ácido láctico mientras que la actual busca una
utilidad del mismo como posible materia para la producción del ácido poliláctico.
7
2.2. BASES TEÓRICAS
2.2.1. Definición y tipos de lactosuero
El lactosuero es un líquido claro de color amarillo verdoso, subproducto del procesamiento de leche,
obtenido después de la precipitación de la caseína en la elaboración de quesos. Con una producción
mundial de 82 millones de Toneladas métricas, se ha constituido en el principal residuo de la industria
láctea, donde una parte de éste es usado para alimentación animal y el resto se vierte directamente a las
aguas sin un tratamiento previo, generando un problema de contaminación ambiental debido a la materia
orgánica constituida por 4,8% de lactosa, 0,75% de proteínas y 6,2% de materia seca (García et al., 2013).
Según las propiedades fisicoquímicas, un lactosuero puede ser clasificado como ácido o dulce. En el
primer grupo, se encuentran aquellos que provienen de la fabricación de quesos frescos de pasta blanda,
obtenidos a partir de leche de vaca y/o de cabra. En ellos, la lactosa se ha transformado en ácido láctico,
siendo ricos en calcio y fósforo. En cambio un lactosuero dulce proviene de la fabricación de quesos de
pasta cocida y prensada (vaca) y quesos de ovejas. Es pobre en ácido láctico, calcio y fósforo (Callejas et
al., 2012). Otra forma de clasificarlo es mediante el método aplicado para la precipitación de la caseína,
para separar el coágulo de la leche en la elaboración de queso. El suero dulce, está basado en la
coagulación por la renina a pH 6,5; mientras el suero ácido resulta del proceso de fermentación o adición
de ácidos orgánicos o minerales para coagular la caseína (Parra, 2009). En la tabla 2.1 se muestra la
composición promedio de los distintos tipos de suero.
2.2.2. Lactosa
Es el azúcar que se encuentra en la leche, siendo específicamente un disacárido compuesto por 2
moléculas de galactosa y glucosa (monosacáridos) y son fuente principal de energía en la dieta del ser
humano, presente en el suero en un 4.99% aproximadamente. La figura 2.1 muestra la forma molecular de
la lactosa.
8
Figura 2.1 Molécula de Lactosa
Fuente: (Álvarez, 2013)
Ciertos microorganismos, bacterias y levaduras son capaces de fermentar la lactosa produciendo ácido
láctico como se muestra en la siguiente reacción:
C12H22O11 + H2O 2C6H12O6 4CH3-CHOH-COOH
Muchas veces estas fermentaciones son producidas por bacilos anaerobios, apreciándose un olor
desagradable y abundante formación de gas (Álvarez, 2013).
El ácido láctico tiene un carbono asimétrico, ver figuras 2.2 y 2.3, lo cual da lugar a actividad óptica. A
diferencia del isómero D(-), la configuración L(+) es metabolizada por el organismo humano. Tanto las
dos formas ópticamente activas, como la forma racémica, se encuentran en estado líquido, siendo
incoloros y solubles en agua. En estado puro son sólidos altamente higroscópicos de punto de fusión bajo,
9
el cual es difícil de determinar debido a la extrema dificultad de producir el ácido de forma anhidra; es por
esta razón que se manejan rangos de 18-33°C.
El punto de ebullición del producto anhidro está entre 125-140°C. Ambas formas isoméricas del ácido
láctico, así como la mezcla racémica, pueden ser polimerizadas y se pueden producir polímeros con
diferentes propiedades dependiendo de la composición (Arrellano, 2013). Las propiedades fisicoquímicas
del ácido láctico se muestran en la tabla 2.2.
Procesos de producción
El ácido láctico puede ser producido por síntesis química o biotecnológica. La producción química, está
basada en la reacción de acetaldehído con ácido cianhídrico lo cual produce un lactonitrilo que puede ser
hidrolizado a ácido láctico. Otro tipo de reacción se basa en la reacción a alta presión de acetaldehído con
monóxido de carbono y agua en presencia de ácido sulfúrico como catalizador. Este proceso es costoso
debido a que el petróleo es la base de la materia prima. Los problemas de alto costo de esta materia, así
10
como la dependencia de otras industrias para su obtención, además de la impureza del producto, hacen de
los procesos basados en fermentaciones la mejor opción para producir ácido láctico (Arrellano, 2013).
Alimentaria
Es clasificado como GRAS (Generalmente Reconocido Como Seguro) para su uso como aditivo
alimentario, por lo cual es ampliamente usado en casi todos los segmentos de la industria alimenticia,
debido a su gran cantidad de funciones, como saborizante, regulador del pH, mejorador de la calidad
microbiana y fortificante mineral.
Este es un compuesto que también es usado comercialmente en las industrias de las aves de corral y de las
carnes, ya que aumenta su tiempo de almacenamiento y sabor; y también controla patógenos. Debido a su
sabor ácido, también es usado como acidulante en ensaladas, productos de panadería, bebidas, en
confiterías, no solo como saborizante, sino también como controlador del pH durante el procesamiento.
Las ventajas de usar este compuesto en la industria incluyen su bajo costo, fácil manejo y la capacidad de
producir dulces incoloros (Suárez, 2007).
Cosmética
Este es un ácido que agrega ingredientes naturales para aplicaciones cosméticas. Aunque inicialmente fue
usado como humectante y regulador del pH, posee múltiples propiedades, entre ellas la actividad
antimicrobiana, rejuvenecedora e hidratante de la piel. El efecto humectante está directamente relacionado
con la capacidad de retención de agua del lactato y el rejuvenecimiento de la piel es producido por la
supresión de la formación de tironasa. Ya que son ingredientes naturales del cuerpo humano, tanto el
11
ácido como sus sales, tienen perfecta acogida en las nuevas tendencias hacia formulaciones naturales y
seguras, con efectos que los hacen muy atractivos como ingredientes activos en los cosméticos (Suárez,
2007).
Farmacéutica
Es usado en la industria farmacéutica como electrolito en soluciones intravenosas que sirven para
aumentar los fluidos del cuerpo. Además, se emplea en una amplia variedad de productos minerales, como
tabletas, prótesis, suturas quirúrgicas y sistemas controlados de entrega de droga (Suárez, 2007).
Química
Algunos ejemplos de productos derivados del ácido láctico que han tenido una gran demanda en los
últimos años, son: termoplásticos biodegradables (ácido poliláctico), solventes verdes (etil, propil, butil) y
químicos oxigenados como el glicol de propileno (Ríos, 2011).
Adicionalmente, este puede tener conversiones hacia químicos potencialmente útiles, como el óxido de
propileno (vía hidrogenación), ácido propanoico (vía reducción), ácido acrílico (vía deshidratación),
acetaldehído (vía descarboxilación), y diláctido (vía auto esterificación) (Suárez, 2007).
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son cocos y bacilos Gram positivos, anaerobios facultativos, no
esporulados, inmóviles y catalasa negativo, pertenecientes a los géneros Lactobacillus (Lb),
Carnobacterium (Cb), Leuconostoc (Leu), Pediococcus (Pd), Streptococcus (Str), Tetragenococcus (Teg),
Lactococcus (Lc), Vagococcus (Vc), Enterococcus (Ent), Aerococcus (Ac) y Weissella (W). La mayoría de
las especies pertenecientes a estos géneros tienen alta tolerancia a pH por debajo de 5. Esta tolerancia
ácida les da ventajas competitivas sobre otras bacterias (Serna y Rodríguez, 2005).
Acorde a los productos finales de la fermentación de los hidratos de carbono, las BAL se dividen en
homofermentativas y heterofermentativas. En el metabolismo homofermentativo, se produce
predominantemente ácido láctico y las bacterias utilizan las hexosas siguiendo la vía de Embden-
12
Meyerhof. Las bacterias que tiene este tipo de metabolismo son Lb. delbruekii, Lb. helveticus, Lb.
amylovorus; Pd. acidilactici, Pd. pentosaceus, Pd. damnosus; Str. salivarius, Lc. lactis, entre otros. La
fermentación heteroláctica produce a partir de glucosa, cantidades equimolares de otros productos de
fermentación como ácido acético, etanol y dióxido de carbono. Las bacterias que tienen este tipo de
metabolismo son: Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. bifidus y todas las especies del género Leuconostoc.
Los hongos utilizados en la producción de ácido láctico son mohos y levaduras pertenecientes a los
géneros Rhizopus, Zymomonas, Saccharomyces y Kluiveromyces. La dificultad que presenta la producción
de ácido láctico con mohos es su forma física, ya que el gran tamaño de los micelios o sus agregados
puede provocar un aumento en la viscosidad del medio de fermentación, lo que causa un alto incremento
en la demanda de oxígeno y resistencia a la transferencia de masa en el proceso fermentativo, lo que a su
vez aumenta los tiempos de fermentación y los subproductos formados especialmente etanol, y disminuye
los rendimientos de conversión (Serna y Rodríguez, 2005).
2.2.5. Fermentación
Las fermentaciones se llevan a cabo en un dispositivo llamado biorreactor, también denominado
comúnmente fermentador, por medio del cual se proporciona un medio ambiente controlado que permite
la obtención de productos de interés a partir de la transformación microbiológica o enzimática de un
sustrato. Las fermentaciones a nivel laboratorio son usualmente realizadas en matraces erlenmeyer o cajas
de petri, esto debido a que son convenientes cuando se trabaja con volúmenes pequeños (Ríos, 2011).
Tipos de fermentación
Proceso semi-continuo
Un proceso semicontinuo es un cultivo en lote alimentado continuamente con sustrato, sin la remoción del
caldo de fermentación. Esta estrategia de alimentación permite que el microorganismo crezca a una
velocidad de crecimiento específica deseada, minimizando la formación de subproductos (Ríos, 2011).
13
Proceso continuo
En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva estéril se añade
continuamente al bióreactor y una cantidad equivalente de caldo de fermentación con los nutrientes y los
microorganismos, es retirada de forma continua (Ríos, 2011).
Medio de cultivo
Es una mezcla de suplementos y nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas
óptimas, permiten el crecimiento y la multiplicación de los microorganismos, tales como bacterias, hongos
y parásitos. De acuerdo a su estado físico pueden ser sólidos, semisólidos y líquidos (Nava y Núñez,
2013).
Modo de fermentación
El ácido láctico es comúnmente producido en fermentaciones tipo lote, pero existen numerosos ejemplos
de cultivo continuo y semicontinuo. Cuando se compara los modos de fermentación por lote y continuo, el
primero resulta en mayores concentraciones de ácido láctico y mejores rendimientos en la mayoría de
estudios; esto es debido a que todo el sustrato es usado. Por otro lado, el modo continuo resulta en
mayores productividades (Suárez, 2007).
pH
La concentración de iones hidrógeno es un parámetro importante que tiene un fuerte efecto en la
producción de ácidos orgánicos formados durante los procesos de fermentación, debido a que cuando se
acumulan en gran cantidad en el caldo de fermentación inhiben el crecimiento del microorganismo. Para
controlar el pH durante la fermentación se hace el uso de agentes neutralizantes. El carbonato de calcio ha
sido ampliamente usado en investigaciones a nivel matraz, así como también el carbonato de sodio y el
hidróxido de sodio (Ríos, 2011).
Temperatura
El efecto de la temperatura en la producción de ácido láctico ha sido estudiado en pocos reportes (Suárez,
2007). Generalmente este parámetro se selecciona en función del microorganismo a utilizar y su
temperatura óptima de producción. En el caso de las BAL la temperatura óptima de crecimiento varía
entre géneros y está en un rango de 20°C a 45°C (Serna y Rodríguez, 2005).
14
2.2.6. Separación y purificación del ácido láctico
El proceso de producción del ácido láctico vía fermentativa requiere el uso de un proceso de separación
económico y eficiente para recuperar el ácido láctico y aislarlo de varias impurezas en el caldo de
fermentación (Suárez, 2007).
Los métodos de recobrado del ácido láctico deben tener en cuenta: la separación de las sales de ácido
láctico de los microorganismos que la producen y la separación de las impurezas del medio de
fermentación, entre los que se encuentran: azúcares que no se consumieron totalmente, proteínas y varios
tipos de sales orgánicas (Núñez et al., 2009).
Los estudios de separación y purificación del ácido láctico han tenido un marcado interés, debido a que
por sus propiedades fisicoquímicas se hace difícil la destilación y cristalización del mismo, lo cual hace de
esta etapa del proceso una de las más complejas y costosas (Sánchez et al., 2007).
En la mayoría de los procesos, el ácido láctico es recuperado bajo la forma de lactato de calcio por la
adición de carbonato de calcio al medio de fermentación y su posterior acidificación con ácido sulfúrico.
Los tratamientos posteriores, van a depender de la pureza deseada e incluyen: esterificación, purificación
con resinas de intercambio iónico y extracción con solventes. También se han usado procesos de
membrana como ultrafiltración, nanofiltración, microfiltración, ósmosis inversa y electrodiálisis. La
electrodiálisis puede utilizarse simultáneamente a la fermentación, empleando un sistema de recirculación,
método que permite remover el ácido a medida que se produce, eliminando la necesidad de agregar
agentes neutralizantes. Recientemente se ha evaluado la utilización de Diálisis Donan como pre-
tratamiento del caldo de fermentación y electrólisis con membrana bipolar para la extracción del lactato.
Otra técnica estudiada es la fermentación extractiva, que permite la remoción continua del ácido láctico
favoreciendo el rendimiento de la reacción. Recientemente se ha estudiado un proceso que permite la
esterificación del ácido láctico y la posterior hidrólisis del lactato en una torre de destilación reactiva
consiguiéndose mayores purezas en la composición del ácido láctico final (Tejeda et al., 2007).
La esterificación es el único proceso de separación que separa el ácido láctico de otros ácidos orgánicos.
El ácido láctico de alta pureza puede ser preparado mediante la formación de un éster al reaccionar el
ácido láctico con alcohol. Posteriormente, la purificaron del éster se da mediante una hidrólisis ácida, por
destilación o extracción y luego se realiza su conversión en ácido láctico (Suárez, 2007).
15
2.2.7. Polímeros
Son macromoléculas (generalmente orgánicas) formadas por la unión de cientos de miles de moléculas
más pequeñas, llamadas monómeros, que forman enormes cadenas de formas más diversas (Nava y
Núñez, 2013).
Biopolímeros
Son macromoléculas presentes en los seres vivos y se considera que son materiales poliméricos o
macromoleculares sintetizados por los seres vivos. Existen también los llamados biopolímeros derivados,
que agrupan a los biopolímeros sintetizados artificialmente pero a partir de sustancias naturales. Estos
materiales también son denominados bioplásticos, aunque es esta categoría también se incluyan todo los
biopolímeros de origen natural (Nava y Núñez, 2013).
Polimerización
La reacción por la cual se sintetiza un polímero a partir de sus monómeros se denomina polimerización.
Según el mecanismo por el cual se produce la reacción de polimerización para dar lugar al polímero, ésta
se clasifica como "polimerización por pasos" o como "polimerización en cadena". En cualquier caso, el
tamaño de la cadena dependerá de parámetros como la temperatura o el tiempo de reacción, teniendo cada
cadena un tamaño distinto y, por tanto, una masa molecular distinta. Por esta razón se habla de masa
promedio del polímero (Nava y Núñez, 2013).
Las propiedades técnicas se refieren a la aplicabilidad que presentan los mismos en un determinado
proceso o en su uso final. Dentro de estas características se encuentran la resistencia al ataque de sustancia
químicas, resistencia eléctrica y su comportamiento frente al calor. En cambio, las propiedades mecánicas
se relacionan con el comportamiento del polímero frente a distintos procesos mecánicos. Entre estas
propiedades se encuentra la resistencia, que se relaciona con la firmeza de los polímeros frente a la presión
ejercida sobre ellos sin sufrir cambios en su estructura. La dureza, que es la capacidad de oposición a
romperse y la elongación que es la capacidad de un polímero de estirase sin romperse cuando se ejerce
una presión externa (Romero, 2014).
16
2.2.9. Ácido Poliláctico (PLA)
El PLA es un polímero termoplástico rígido que puede ser semicristalino o totalmente amorfo,
dependiendo de la pureza estereoquímica de la cadena polimérica. La peculiaridad de este polímero es que
en muchos aspectos parece tereftalato de polietileno (PET), que es también un poliéster, pero tiene un
comportamiento muy similar al polipropileno (PP), que es una poliolefina. De hecho, puede ser el
polímero con más amplio intervalo de aplicaciones debido a su habilidad para cristalizar mediante
estiramiento, o térmicamente, copolimerizar o procesar mediante la mayoría de las técnicas de procesado.
Además, tiene excelentes propiedades organolépticas y es excelente para aplicaciones en contacto con
alimentos y de embalaje (Mazarro, 2009).
El ácido poliláctico puede ser duro como el acrílico o blando como el polietileno, rígido como el
poliestireno (PS) o flexible como un elastómero. Puede formularse para obtener una variedad de
resistencias. Las resinas de PLA pueden someterse a esterilización con rayos gama y son estables cuando
se exponen a los rayos ultravioleta.
Otras propiedades de interés del ácido poliláctico son, la suavidad y resistencia al rayado y al desgaste. La
tabla 2.3 muestra algunas propiedades del PLA en comparación con otros plásticos convencionales
(Tejeda et al., 2007).
17
Este polímero puede hidrolizarse fácilmente a ácido láctico, mediante la adición de agua, para luego ser
nuevamente polimerizado. Esta sería una ventaja para el reciclaje y la biodegradación de los productos de
ácido poliláctico (Tejeda et al., 2007).
El ácido poli (L-láctico), o su homólogo poli (L, L-lactida), conocido como PLLA, es semi-cristalino y
tiene un punto de fusión de 170 – 183ºC y una temperatura de transición vítrea (Tg) de 55 a 65ºC.
Mientras que el ácido poli (D, L-láctico) o poli (D, L-lactida), conocido como PDLLA es amorfo y tiene
una Tg de 59ºC, aunque estas temperaturas pueden variar con el peso molecular. Debido a la cristalinidad
del PLLA, éste presenta unas mejores propiedades mecánicas que el PDLLA. Su densidad es de 1,25 a
1,29 g.cm-3. La solubilidad del PLA depende del peso molecular, el grado de cristalinidad y la presencia
de otros monómeros. Normalmente, el PDLLA es soluble en un mayor número de disolventes orgánicos
que el PLLA, pero ambos son insolubles en alcoholes, como el metanol y el etanol, e hidrocarburos no
sustituidos como el hexano, el heptano, entre otros (Mazarro, 2009).
18
Policondensación directa del ácido láctico
En la polimerización por condensación, la reacción toma lugar entre dos moléculas polifuncionales para
producir una gran molécula polifuncional con posible eliminación de pequeñas moléculas, como el agua.
La policondensación de ácido láctico se realiza, por lo general, en masa por destilación del agua de
condensación, con o sin catalizador, mientras el vacío y la temperatura aumentan de forma progresiva.
Aunque los poliésteres de alto peso molecular y buenas propiedades mecánicas son difíciles de obtener,
las propiedades de los oligómeros de ácido láctico pueden ser controladas por el uso de diferentes
catalizadores y agentes de funcionalización, o por la variación de las condiciones de polimerización.
La mayor desventaja de esta técnica de síntesis es que no produce PLA de alto peso molecular, debido a
su complicación en la eliminación de impurezas y agua. Otras desventajas de esta técnica son, la
necesidad de grandes reactores, evaporación, recuperación de disolventes y el aumento de racemización
(Castro y Vera, 2012).
Condensación azeotrópica
La deshidratación azeotrópica es un método utilizado para obtener la longitud de cadena alta sin el uso de
extensores de cadena y sus inconvenientes asociados. Un procedimiento general consiste en reducir la
presión de destilación del ácido láctico por 2-3 horas a 130°C, para eliminar la mayor parte del agua. El
catalizador y éter difenil son luego agregados y un tubo lleno de tamices moleculares se inserta en el
recipiente de reacción. El disolvente se recircula al recipiente a través de los tamices moleculares durante
30-40 horas a 130 °C. Por último, el PLA es purificado (Castro y Vera, 2012).
La polimerización por apertura de anillo utiliza como monómero el dímero cíclico del ácido láctico,
conocido como lactida (“lactide” en inglés). La lactida es obtenida por craqueo térmico de PLA de bajo
peso molecular a alta temperatura y baja presión en presencia de un catalizador. La lactida es un dímero
cíclico de seis átomos (Mazarro, 2009).
19
Aplicaciones del PLA
Por ser biodegradable y reabsorbible, el PLA encuentra múltiples aplicaciones en medicina y en industrias
como la alimentaria, la textil, de cosméticos y otras. La mayor aplicación del PLA está en la industria
biomédica, ya que éste es un termoplástico biodegradable y no es tóxico cuando se degrada. El PLA y sus
copolímeros se han utilizado en el sistema de administración de drogas, en la encapsulación y entrega de
proteínas, el desarrollo de las microesferas, hidrogeles, suturas, tornillos ortopédicos, entre otros.
En la fijación de fracturas, se utilizan dispositivos metálicos para alinear los fragmentos de huesos. Al ser
retirados estos dispositivos, pueden dejar el hueso sujeto a fracturas. Sin embargo, en el caso de los
dispositivos basados en PLA, la degradación reduce el área donde hay actividad, lo que ayuda a la
curación gradual del hueso. Después de la degradación completa, el dispositivo se absorbe de manera
completa y una segunda cirugía no es necesaria. Sin embargo, este dispositivo de PLA tiene más bajo
módulo de elasticidad que el dispositivo metálico, pero esta propiedad puede ser mejorada utilizando en el
momento de la fabricación fibras de refuerzo de alto módulo.
Puesto que las propiedades mecánicas del PLA de alto peso molecular son comparables a otros
termoplásticos como el poliestireno (PS) y el polietilentereftalato (PET), este tiene grandes oportunidades
para reemplazar estos polímeros para numerosas aplicaciones, como son el embalaje de productos
alimenticios, botellas plásticas y para artículos que requieran gran transparencia. En el sector de las fibras,
el PLA puede reemplazar al Nylon y estas prendas se sienten más cómodas, ya que sus propiedades les
dan un toque sedoso, además de ser menos inflamables que otros tipos de telas. El PLA también encuentra
aplicaciones en películas agrícolas, bolsas de basura degradables, bandejas termo-formadas de frutas y
verduras, platos y vasos desechables, juguetes, cubiertos, capas de nano-compuestos de silicato, muebles y
artículos para el hogar (Castro y Vera, 2012).
2.2.10. Degradación
Los materiales poliméricos considerados degradables deben contener grupos en la cadena principal que se
puedan romper fácilmente por la acción de agentes externos de naturaleza física o química, consiguiendo
así, el mantenimiento de las propiedades durante el periodo de utilización del biopolímero y posterior
cambio de estructura química para descomponerse en componentes compatibles con el medio ambiente.
Como consecuencia de la degradación, en un biopolímero pueden ocurrir cambios físicos o químicos. Los
cambios físicos pueden consistir en la decoloración, pérdida del brillo superficial, formación de grietas,
superficie pegajosa, erosión superficial y pérdida de propiedades como la resistencia a la tracción y el
20
alargamiento. Los cambios químicos consisten en la rotura de cadenas, cambios en grupos sustituyentes
laterales y aparición de reacciones de entrecruzamiento entre otros.
Por otra parte, es importante recalcar que cuanto más bajo sea el peso molecular de un biopolímero, la
degradación será más rápida; y para el caso los polímeros con mayor peso molecular, la combinación de
grupos funcionales fotosensibles e hidrolizables hace más efectiva la degradación medioambiental.
Entre las posibles causas de degradación se encuentran: la depolimerización, la oxidación térmica que
genera una ruptura al azar de las cadenas de polímero y las reacciones de trans-estericación inter- e intra-
moleculares que generan monómero y oligómeros de bajo peso molecular. Aunque existen numerosos
factores que pueden afectar a la degradación del polímero, como son la presencia de trazas de impurezas,
monómeros o agua, al parecer, tanto la depolimerización como las reacciones de trans-esterificación
pueden estar catalizadas por la presencia de catalizador remanente del proceso de polimerización
(Mazarro, 2009).
21
CAPÍTULO III. MARCO METODOLÓGICO
En este capítulo se delimita el tipo de trabajo científico y de investigación en que se basa el estudio, y se
presenta la metodología utilizada para llevar a cabo el logro de los objetivos planteados.
3.2.1. Actividades iníciales, se llevó a cabo la búsqueda de información bibliográfica necesaria para el
desarrollo de los objetivos planteados.
3.2.2. Determinación de algunas de las características fisicoquímicas que posee el suero lácteo utilizado
como materia prima para la investigación, realizando después una fermentación láctica con el
microorganismo seleccionado.
3.2.3. Aplicación del proceso de purificación más adecuado para la separación del ácido láctico obtenido
en el proceso de fermentación láctea.
3.2.4. Síntesis del ácido poliláctico (PLA), mediante la policondensación del ácido láctico obtenido en la
etapa de purificación.
3.2.5 Evaluación de algunas propiedades del polímero sintetizado.
3.2.6. Actividades finales, una vez de cumplidas todas las actividades planteadas, se procedió a la
redacción de este trabajo de investigación.
22
artesanal; mientras que la muestra A2, se recolectó en la empresa LACSA C.A, donde preparan queso de
manera semi-industrial. Las muestras fueron trasladadas en cuñetes plásticos al Laboratorio de Polímeros
y Derivados Petroquímicos del Centro de Investigaciones Químicas de la Facultad de Ingeniería de la
Universidad de Carabobo, en donde fueron sometidas a diferentes ensayos para su caracterización, sin
tratamientos y con tratamiento previos.
Para la desproteinización del suero, se aplicó un tratamiento térmico en la autoclave, mostrada en la figura
3.2, a 115°C y 10 psig durante 20 minutos. Luego se dejó reposar a temperatura ambiente, se centrifugó,
se decantó y se filtró el sobrenadante.
Determinación de pH
Para la determinación del pH, se utilizó un pHmetro marca ORION modelo 410A (ver figura 3.6),
empleando el procedimiento descrito en la Norma COVENIN 1315:79 (Alimentos. Determinación del pH-
Acidez iónica). Para esto, se sumergió el electrodo del equipo, previamente calibrado con soluciones
buffer de pH 4 y 7, en un vaso de precipitado que contenía el suero a analizar. Los valores reportados por
el equipo fueron tabulados una vez que los mismos no variaron en más de 0,01 unidades.
25
vidrio de reloj se enfrió en el desecador y se procedió a pesar nuevamente. Con los datos obtenidos y la
norma mencionada, se calculó el porcentaje de cenizas.
26
La cantidad de hidróxido de sodio 0,1M gastado en la segunda valoración, se multiplicó por 2,24
y el resultado se expresó como porcentaje de proteínas.
Culminado el proceso de caracterización de los sueros, se procedió al análisis de los resultados reportados,
para seleccionar el suero que representaba la mejor alternativa a utilizar como sustrato en el proceso
fermentativo para la producción de ácido láctico.
27
Se definió la escala de valoración de cada criterio, basándose en el método cualitativo por puntos,
usando la siguiente información:
Se asignó una puntuación del 1 al 5 a cada alternativa (bacteria) con cada criterio, siendo 5 la mejor
opción, según la escala de valoración mostrada anteriormente.
Luego se realizó la multiplicación del puntaje asignado a cada alternativa según el criterio de
evaluación (P) por su valor de importancia (I) y se procedió a realizar la suma de dichos valores para cada
alternativa propuesta.
La selección del microorganismo se realizó mediante el análisis de los resultados arrojados en la matriz de
selección de Moody elaborada. La alternativa escogida fue aquella en la cual se obtuvo el mayor puntaje
total.
Fermentación
El medio de cultivo preparado fue llevado al Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencia y
Tecnología (FACYT), para la inoculación la bacteria Lactobacillus casei, la cual fue extraída por un
personal especializado, a partir del yogurt comercial Alpina - presentación natural.
Después de inocular las bacterias en el medio de cultivo, los matraces fueron tapados con algodón y gasa.
Se tomó una de las soluciones para la evaluación de pH, contenido de ácido láctico y °Brix, siguiendo las
metodologías descritas en el apartado 3.3.1.
29
El resto de las soluciones se colocaron en un equipo de agitación con control de temperatura, como el
mostrado en la figura 3.10, para efectuar el proceso de fermentación durante 24 h a 37 °C y 150 rpm.
Culminado el proceso de fermentación, se tomó un matraz como muestra representativa y se procedió a
evaluar nuevamente el: pH, contenido de ácido láctico y °Brix, siguiendo las metodologías descritas en el
apartado 3.3.1.
3.3.3 Emplear la alternativa más conveniente para el proceso de purificación del ácido láctico
obtenido de la fermentación del suero lácteo
El suero lácteo de la fermentación fue filtrado, y el líquido obtenido se destiló, utilizando el montaje
mostrado en la figura 3.11, hasta el 50% de su volumen inicial. Luego se dejó enfriar a temperatura
ambiente, y se centrifugó para retirar posibles impurezas y compuestos insolubles. El líquido obtenido fue
purificado mediante la utilización de dos métodos: obtención de lactato y separación líquido-líquido.
La selección de la alternativa más conveniente para la purificación del ácido láctico, obtenido de la
fermentación del suero lácteo, se realizó mediante el análisis de las soluciones obtenidas después de la
aplicación de los procesos de purificación utilizados. Los métodos de obtención de lactato y el método de
separación líquido-líquido, se describen a continuación:
31
(9) Tanto la fase inferior, como la solución hidrolizada fueron destiladas hasta obtener un residuo de
aproximadamente 50% del volumen inicial. Los destilados y residuos obtenidos, fueron almacenados para
estudios y tratamientos posteriores.
(10) Por último se tomaron 50mL de los residuos obtenidos en las destilaciones previas, para la
caracterización del ácido purificado.
Punto de ebullición
El punto de ebullición del ácido purificado se determinó siguiendo la metodología planteada por la Norma
ASTM D 1120-72 “Boiling Temperature”. Para esto, se tomó un vaso de precipitado de 100 mL y se
colocaron 20 mL del ácido láctico purificado. La muestra se sometió a calentamiento y al observar la
aparición de pequeñas burbujas en la superficie del líquido se tomó nota de la temperatura observada en el
termómetro. El montaje utilizado se muestra en la figura 3.14.
Índice de refracción
La determinación del índice de refracción se realizó siguiendo el procedimiento descrito en la Norma
COVENIN 2450-87 (Determinación del índice de refracción y dispersión refractiva). Para esto, se utilizó
el refractómetro Bausch y Lomb tipo Abbe modelo 3L, el cual fue calibrado con agua destilada. Luego se
tomó una pequeña muestra del ácido purificado y se colocó en el equipo, tal como se observa en la figura
3.15.
32
Figura 3.15 Disposición de muestra en el refractómetro
Densidad
La determinación de la densidad se realizó siguiendo la metodología descrita por Velásquez, 2007; la cual
se fundamentó en el método del picnómetro. Para esto, se utilizó un picnómetro de 25 mL (Ver figura
3.16). Se midió la masa del picnómetro vacío, limpio y seco. Posteriormente, se llenó el picnómetro
completamente con el ácido láctico purificado y se midió la masa del picnómetro lleno. Mediante la
utilización de la fórmula adecuada y los datos recolectados, se procedió a calcular la densidad del
producto (ver Apéndice B, ecuación B.11).
Miscibilidad en agua
La miscibilidad en agua se determinó siguiendo la metodología descrita por Lozano et al., 2013; mediante
la aplicación del método básico para medir solubilidad. En un tubo de ensayo, se agregó agua destilada
(hasta 25% de la capacidad del recipiente) y luego se fue agregando ácido láctico purificado. Tras cada
adición, se agitó la solución y se tomó nota del comportamiento observado durante el proceso de mezcla.
33
En la figura 3.17 se observa el tubo de ensayo conteniendo agua destilada y ácido láctico en igual
proporción.
34
de calentamiento, un balón de 1 L con 3 bocas de fondo redondo, un embudo de adición, un termómetro y
un condensador; además de los conectores necesarios al sistema de destilación y un kitasato conectado a
una bomba de vacío. La metodología utilizada se detalla a continuación:
Pre-concentración
Se evaporó 1/3 de solución de ácido láctico purificado a una temperatura comprendida entre 40 °C y 60
°C. Luego se diluyó 2 mL de dicha solución pre-concentrada con 20 mL de agua destilada.
Posteriormente, se tomaron 2 mL de la muestra diluida y se tituló con hidróxido de sodio 0,1 M y
fenolftaleína como indicador. Para conocer la concentración %p/v se utilizó la metodología descrita en el
apartado 3.3.1 para el contenido de ácido láctico y se utilizaron las ecuaciones B.12 y B.13, mostradas en
el apéndice B.
Oligomerización
Se agregaron 200 mL de AL concentrado en el balón de 1 L y se adaptó al sistema de destilación al vacío.
Luego se procedió a calentar la solución hasta que la misma alcanzó 100 °C. Posteriormente, se aplicó
vacío hasta 635 mmHg por 45 minutos.
Polimerización
En la etapa final de la síntesis se agregó el catalizador manteniendo la temperatura de operación y bajando
la presión hasta 508 mmHg. La reacción se mantuvo en esas condiciones durante 1 hora y 30 minutos
aproximadamente. Transcurrido ese tiempo, se apagaron y se desconectaron los equipos, de forma
inmediata se transfirió el producto a moldes elaborados para su secado y los mismos se colocaron en un
desecador.
35
3.3.5 Evaluar propiedades del polímero obtenido y su capacidad de degradación
Las pruebas realizadas para la caracterización del polímero obtenido fueron: densidad, punto de fusión y
determinación de la presencia de zinc. Además de espectroscopia infrarrojo y degradación por hidrólisis.
Determinación de la densidad
Para la determinación de la densidad del polímero obtenido, se utilizó la metodología descrita por
Torrelavega, s.f; siguiendo el método de la probeta. Se tomó una pequeña muestra del plástico obtenido
del proceso de polimerización y se pesó en una balanza analítica. Luego, en un cilindro de 25 mL, se
agregó un volumen conocido de agua, se introdujo la muestra de plástico previamente pesada y se esperó
que la misma llegara al fondo de la probeta, tal y como se observa en la figura 3.20. Después, se tomó nota
del volumen final y finalmente, mediante la utilización de la fórmula B.14 (ver apéndice B), se calculó la
densidad del producto de síntesis.
36
Figura 3.21 Montaje utilizado para la evaluación del punto de fusión del polímero
Evaluación de la dureza
La prueba se realizó siguiendo la metodología indicada por la Norma ASTM D2240-15, utilizando el
Durómetro tipo A, modelo 360 L, que se visualiza en la figura 3.23. La muestra se colocó sobre una base
paralela al equipo. Luego se dejó caer el dial del equipo sobre la muestra. El equipo reportó el valor de
interés de forma directa y esta prueba se realizó por triplicado.
37
Figura 3.23 Equipo para la medición de dureza (durómetro)
Estudio de degradabilidad
Para los ensayos de degradación hidrolítica, se siguió la Norma Internacional ASTM F1635-04a. Para ello,
se tomaron 3 muestras del polímero obtenido, fueron pesadas antes de ser sumergidas cada una en 3
soluciones diferentes. La primera fue en una solución buffer de pH=4, la segunda en una solución buffer
de pH=10 y la última en agua de chorro. Las soluciones Buffer fueron tapadas con papel de aluminio,
mientras que la tercera se dejó abierta al ambiente (ver figura 3.24). Estas condiciones se mantuvieron por
un periodo de 30 días.
38
El pH de las soluciones se midió antes de la adición de las muestras, según la metodología descrita en el
apartado 3.3.1. Transcurridos los 30 días de degradación, se retiraron las muestras de las soluciones que la
contenían y se colocaron en la estufa a 30°C durante 2horas para secarlas.
Luego se procedió a aplicar nuevamente la metodología indicada en el apartado 3.3.1 para determinar el
pH final de las soluciones y también se realizó la pesada de las muestras.
39
CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En este capítulo se presenta detalladamente el análisis de los resultados obtenidos del trabajo de
investigación.
Tabla 4.1 Características fisicoquímicas de los sueros y cambios producidos a causa del pre-
tratamiento utilizado
Parámetro Suero antes del tratamiento Suero después del Diferencia obtenida por el
tratamiento tratamiento
Suero A.1 Suero A.2 Suero A.1 Suero A.2 Suero A.1 Suero A.2
Acidez iónica 4,53 4,31 4,37 3,91 - 0,16 - 0,40
(pH±0,01)Adim
Contenido de 8,3 4,9 8,4 5,0 + 0,1 + 0,1
azúcar
(°Brix±0,1)°Brix
Contenido de 5,76 3,59 5,63 3,52 - 0,13 - 0,07
cenizas
(C±0,02)%p/p
Contenido de ácido 11,99 12,93 12,18 13,89 + 0,19 + 0,96
láctico
(CAL±0,05)gAL/Lsuero
Cantidad de 15,0 15,3 12,5 14,6 - 2,5 - 0,7
proteínas (P±0,1)%
Suero A.1: suero proveniente de la quesera de propiedad familiar, suero A.2: Suero proveniente de la empresa LACSA, C.A.
En la tabla 4.1 se presentan las características de los sueros utilizados en la investigación. Los parámetros
analizados fueron obtenidos tanto de los sueros sin tratar como de los sueros luego del tratamiento
realizado. En este sentido, se encontró que la acidez iónica de los sueros presenta un valor de pH por
debajo de 5, y se observa que después del tratamiento de desnatado y desproteinizado, estos valores bajan
en 0,16 unidades para el suero proveniente de la quesera de propiedad familiar y en 0,40 unidades para el
suero proveniente de la empresa LACSA. Los valores de acidez iónica, encontrados en los sueros
evaluados, se encuentran dentro del rango establecido por Callejas et al., (2012) como valor promedio en
sueros de tipo ácidos, en donde se indica que todo lactosuero que posea un pH<5 clasifica como suero
ácido. La disminución del pH después del tratamiento concuerda con el comportamiento reportado por
Urribarrí et al., (2004), debido a que hubo eliminación de agua y aumentó la concentración de ácido.
En cuanto al contenido de azúcar, se observa en la tabla 4.1 que el suero proveniente de la quesera familiar
tiene mayor contenido de azúcares fermentables, en comparación con el suero proveniente de la empresa
LACSA, tanto en los sueros sin tratar como en los sueros luego del tratamiento realizado. También se
40
observa que los sueros después de ser tratados, presentan un leve aumento en el contenido de azúcar. Los
valores reportados para este parámetro, según la información reportada por García et al., (2013), indican
que los sueros en estudio son un buen sustrato para la fermentación con microorganismos, ya que los
mismos consumen los azucares presentes en la solución. El cambio observado en el contenido de azúcar
de las soluciones, una vez efectuado el pre-tratamiento, se debe a que parte del agua presente en los sueros
se evaporó a causa de los tratamientos térmicos aplicados, concentrando así las soluciones, tal y como lo
explican García et al., (2013).
En relación al contenido de ácido láctico (AL), se encontró que el suero proveniente de la empresa
LACSA tiene más ácido presente en la solución en comparación con el suero de la quesera de propiedad
familiar. Después de la aplicación del tratamiento, se aprecia un aumento de 0,19 y 0,96 unidades para
este parámetro, observándose el mayor cambio (0,96 unidades) en el suero proveniente de la empresa
LACSA. Siguiendo la definición propuesta por Álvarez (2013), los sueros evaluados se clasifican en los
sueros de tipo ácido, por presentar un contenido de AL mayor a 2 gramos por cada litro de solución. El
aumento de este parámetro, a causa del tratamiento aplicado concuerda con el comportamiento reportado
por García et al., (2013), y es debido a la evaporación de parte del agua presente en la solución por causa
de los tratamientos térmicos aplicados.
En tanto, que para la cantidad de proteínas, se encontró que el suero proveniente de la empresa LACSA
presentó un valor más alto en comparación con el suero de la quesera de propiedad familiar y que después
del tratamiento aplicado se mantuvo este comportamiento. En la tabla 4.1 también se observa que el
cambio más significativo obtenido por el tratamiento, se presenta en el suero de la quesera de propiedad
familiar en este parámetro. La cantidad de proteínas, encontrada en los sueros evaluados fue superior a la
reportada por Álvarez, (2013); Callejas et al., 2012; Parra, (2009), los cuales indican este valor en un
41
rango de (6 – 12) % respectivamente, por ello resultó necesario la aplicación de un proceso de
desproteinización el cual resultó efectivo, por disminuir la cantidad de proteínas presentes en la solución,
como lo indicó Urribarrí et al., (2004).
En virtud a los resultados analizados anteriormente, se establece que los sueros del presente estudio son de
tipo ácido y que el tratamiento aplicado resultó efectivo para disminuir las impurezas presentes en ellos,
como son las cenizas y proteínas. Además, se determinó que el suero tratado, proveniente de la quesera de
propiedad familiar, fue la mejor opción a utilizar como sustrato, para la aplicación de un proceso
fermentativo mediante el uso de microorganismos, por poseer un mayor contenido de azúcares
fermentables y menor cantidad de proteínas (consideradas impurezas del proceso) en comparación al suero
proveniente de la empresa LACSA.
Tabla 4.2 Matriz de Moody para la selección de la bacteria a utilizar en la fermentación láctica
Criterio Importancia Bacterias propuestas
(I)
Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus
helveticus bulgaricus casei
P PxI P PxI P PxI
Necesidad de suplementos 10 3 30 5 50 5 50
Producción de biomasa 5 1 5 3 10 3 15
Formación de sub-productos 5 1 5 3 10 3 15
En la tabla 4.2 se muestran los criterios utilizados para la selección del microorganismo más adecuado
para llevar a cabo la fermentación del suero lácteo. El costo de la bacteria está relacionado directamente
con la facilidad de adquisición de la misma, por ello es el parámetro de mayor importancia para la
selección de la bacteria, ya que de no poder adquirir la bacteria no se podría realizar la fermentación del
suero.
42
El tiempo de fermentación, se considera el tiempo óptimo necesario para que la bacteria logre producir la
mayor cantidad de ácido láctico; y la cantidad de parámetros a controlar, es un criterio a considerar por la
limitante de los equipos que se disponen para el estudio. Estos criterios tienen cada uno, un 20 % de
importancia al momento de realizar la selección de la bacteria, por la ventaja que representaría realizar un
proceso en el menor tiempo posible sin gran cantidad de aplicación de controles.
La necesidad de suplementos, involucra la cantidad, variedad y tipos de suplementos necesarios para que
se dé una fermentación efectiva, tienen un 10 % de importancia ya que, si bien es posible la fermentación
sin su uso, como lo demuestran García et al., (2013) y Ríos (2011), los mismos también recomiendan su
uso para mejorar la eficiencia del proceso.
Los microorganismos analizados fueron bacterias del género Lactobacillus, tales como: Lactobacillus
helveticus, Lactobacillus bulgaricus y Lactobacillus casei.
En la tabla 4.2 se observa que la bacteria Lactobacillus helveticus presentó el menor de los valores totales
reportados en la matriz de selección de Moddy. Esto se debe a que fue la bacteria más costosa, que
requiere mayor cantidad de suplementos y produce mayor cantidad de biomasa y formación de sub-
productos, en comparación a las otras opciones.
En cuanto a la bacteria Lactobacillus bulgaricus se observa que esta presentó un valor medio entre los
totales reportados por las otras bacterias a considerar; por tanto, se considera que su uso es mejor
alternativa frente al uso de la bacteria Lactobacillus helveticus pero no lo es frente a la bacteria
Lactobacillus casei por necesitar mayores tiempos de fermentación.
En la tabla 4.2 se puede apreciar que la bacteria Lactobacillus casei tiene la mayor puntuación reportada
en la matriz de selección de Moody. Esto se debe a que, en comparación a las otras dos alternativas
propuestas, es una bacteria de bajo costo, con poca cantidad de parámetros a controlar y requerimientos de
suplementos de uso común en las laboratorios.
43
En virtud de los criterios analizados anteriormente, se estableció que el microorganismo que presenta las
mejores condiciones para ser empleado en la fermentación de los sueros lácteos, fue la bacteria
Lactobacillus casei.
Tabla 4.3 Características del medio de cultivo inoculado con la bacteria Lb. casei y cambios
producidos a causa de la fermentación
Parámetro Antes de la Después de la Cambios
fermentación fermentación producidos
Acidez iónica (pH±0,01)Adim 6,00 5,24 0,76
Contenido de azúcar (°Brix±0,1)°Brix 10,0 8,4 1,6
Contenido de ácido láctico (CAL±0,05)gAL/Lsuero 1,38 7,73 6,35
En la tabla 4.3 se muestran las características del medio de cultivo inoculado con la bacteria Lb. casei. Las
características del medio fueron determinadas antes y después del proceso fermentativo, con el fin de
visualizar los cambios producidos por el mismo. En este sentido, se encontró que la acidez iónica de la
solución se encontraba inicialmente en un valor de pH igual a 6 y disminuyó en 0,76 unidades, producto
del proceso fermentativo, obteniéndose un valor final de pH igual a 5,24. El pH inicial del medio se debe a
la adición de carbonato de calcio, álcalis que neutraliza el ácido láctico presente en la solución mediante la
formación de lactato, según lo indican Núñez et al., (2009), y la disminución de este parámetro por la
fermentación, concuerda con el comportamiento reportado por García et al., (2013) cuando existe
producción de ácido en el proceso.
En cuanto al contenido de azúcar, se observó una disminución de 10,0 a 8,4°Brix por el proceso
fermentativo, que se interpreta como una disminución de 1,6 unidades en este parámetro. El contenido de
azúcares fermentables presente en la solución se debe a la lactosa y el extracto de levadura que contiene
dicha solución, (Álvarez, 2013; Ojeda, 2011), mientras que la disminución de este parámetro durante el
proceso de fermentación concuerda con el cambio reportado por Sánchez et al., (2012), donde justifica
que la bacteria colabora con la producción de ácido láctico, mediante el consumo de azucares
fermentables presentes en la solución.
Por su parte, el contenido de ácido láctico aumentó de 1,38 a 7,73 gramos por cada litro de suero, lo cual
representa una producción del ácido de interés de 6,35 gramos por cada litro de solución. Si se compara la
cantidad de ácido láctico producido en el presente trabajo, con los valores reportados por Ríos (2011), que
realizó una fermentación bajo las mismas condiciones (ver tabla II.1, anexo II), se tiene que el porcentaje
de rendimiento del proceso de producción de ácido láctico en este trabajo fue del 51%.
44
La cantidad de ácido obtenido, producto de la fermentación, fue mayor que la reportada por García et al.,
(2013) utilizando la misma bacteria pero con diferentes suplementos, y a la obtenida por Sánchez et al.,
(2007) y García et al., (2013), utilizando Lb. bulgaricus y Lb. helveticus con el sustrato sin suplementar
(ver tabla II.1, anexo II).
En virtud del análisis de resultados de este apartado, se obtuvo que la mejor alternativa para la
fermentación del suero lácteo es la bacteria Lb. casei, por ser una bacteria de bajo costo y que no requiere
de grandes controles operacionales para que trabaje eficientemente en la producción de ácido láctico.
Además se comprueba que el suero seleccionado para el proceso de fermentación, en conjunto con
suplementos tales como: carbonato de calcio, extracto de levadura, fosfato mono-potásico, fosfato di-
potásico, sulfato de magnesio y sulfato de manganeso, forma un medio de cultivo adecuado para la
producción de ácido láctico mediante una fermentación tipo lote de 24horas a 37°C y 150 rpm.
Tabla 4.4 Parámetros de la solución fermentada antes y después del proceso de purificación
Parámetros Solución fermentada Solución purificada
(Sin purificar) Método 1 Método 2
Fase Acuosa Fase Orgánica
Miscibilidad en agua Miscible Miscible Miscible Miscible
Acidez iónica 5,24 4,20 3,79 3,45
(pH±0,01)Adim
Índice de refracción 1,3580 1,3850 1,4460 1,4445
(Nd±0,0005)Adim
Densidad 1,1342 1,1580 1,1916 1,2017
(ρ±0,0001)g/mL
Punto de ebullición 100 118 118 118
(Te±1)°C
Concentración 6,95 7,53 18,53 21,90
(CAL±0,03)%p/v
Método 1: Obtención de lactato Presión ambiente: (712,60 ± 0,05) mmHg
Método 2: Separación líquido-líquido con 1-butanol Temperatura ambiente: (31,0± 0,5) °C
En la tabla 4.4 se presentan los parámetros evaluados en las soluciones de suero lácteo fermentado, antes y
después de la aplicación de distintos procesos de purificación. Los métodos para purificar dicha solución
fueron mediante la obtención de lactatos y mediante un proceso de separación líquido-líquido con 1-
butanol. En este sentido, se encontró que la aplicación de los distintos métodos de purificación evaluados
45
permitió la obtención de un ácido miscible en agua. El resultado obtenido concuerda con lo esperado y
reportado por Munilla y Blanco (2005), en donde se indica que el ácido láctico es miscible en agua.
En cuanto a la acidez iónica, se observa que inicialmente la solución tiene un pH de 5,24 y que después de
la aplicación de los distintos métodos de purificación, el valor de este parámetro disminuye. También se
evidencia que el menor valor reportado para este parámetro se encontró al aplicar el método 2, en la
solución de ácido láctico obtenida de la fase orgánica. La disminución del pH en la solución concuerda
con los cambios reportados por Gil et al., (2008) como indicativo de un proceso de purificación efectivo.
La disminución de pH se da en mayor proporción en el método 2, ya que la adición de 1-butanol a la
solución permitió la precipitación de los azucares remanentes que no se consumieron durante el proceso
fermentativo permitiendo así una mayor purificación de la solución, de esta forma lo indican Gil et al.,
(2008).
Por su parte, también en la tabla 4.4, se observa que el índice de refracción de la solución evaluada es
inicialmente de 1,3580 y que luego de la aplicación de los procesos de purificación su valor aumentó a
1,3850 en el método 1, mientras que el aumento en el método 2 fue mayor, reportando valores de 1,4460
para la solución obtenida de la fase acuosa y 1,4445 para la fase orgánica. El cambio observado en este
parámetro concuerda con lo esperado, debido a la concentración del ácido en la solución. Al comparar los
valores obtenidos después de la purificación, con el índice de refracción del ácido láctico comercial (ver
tabla II.2, Anexo II) se tiene que la solución purificada con el índice de refracción más cercano al valor
teórico es la solución obtenida de la fase orgánica del método de purificación 2.
En relación a la densidad, se tiene que este valor aumentó después de la aplicación de ambos métodos de
purificación, y que el menor cambio observado se presentó en la solución que se purificó mediante la
aplicación del método 1, el cual reportó un valor de 1,1580 g/mL. Si se compara el valor de la densidad
teórica del ácido láctico (ver tabla II.2, Anexo II) con las densidades reportadas en la tabla 4.4, se tiene
que la solución purificada que reporta el valor más cercano al teórico, fue la solución de ácido obtenida de
la fase orgánica de la aplicación del método 2. Los cambios observados concuerdan con los reportados por
Gil et al., (2008), debido a la capacidad del 1-butanol en precipitar los azucares que no se consumieron en
la fermentación (comportamiento que no ocurre mediante la aplicación del método 1), y a su vez formar
un éster para luego recuperar el ácido de la fase orgánica mediante un proceso de hidrólisis (Ver anexo III,
método 2).
46
Con respecto al punto de ebullición de la solución, se observa que el mismo aumentó, en todos los casos,
de 100 a 118°C. Estos valores son indicativos de que la solución fermentada (sin purificar) está compuesta
mayormente por agua, cuyo punto de ebullición es de 98,17°C a las condiciones de presión presentes en el
laboratorio al momento de realizar la evaluación de esta propiedad, mientras que el valor de las soluciones
purificadas se asemeja más al valor teórico del ácido láctico (Ver tabla II.2, Anexo II), por tanto, es
evidencia de que el proceso de purificación resultó efectivo, tal y como lo indica Arellano, (2013).
Por último, en la tabla 4.4 se observa que la concentración de ácido láctico en la solución sin purificar fue
de 6,95 %p/v y que luego de la aplicación del método 1, este valor aumentó a 7,53 %p/v, mientras que en
el método ,2 este parámetro reportó 18,53 %p/v para la solución obtenida de la fase acuosa y 21,90 %p/v
de la fase orgánica. Los resultados concuerdan con el comportamiento reportado por Arellano, (2013) y
Gil et al., (2008) debido a la eliminación de parte del agua presente en las soluciones por destilación y en
el caso del método 2, por la eliminación de impurezas como parte del azúcar remanente en la solución.
Ahora bien, además de la caracterización de las soluciones purificadas mediante la determinación de los
parámetros mostrados en la tabla 4.4, se realizó un análisis de los espectros infrarrojos emitidos por cada
solución final obtenida de los procesos de purificación evaluados, los cuales se presentan a continuación:
Figura 4.1 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido después del proceso de purificación mediante el método 1-
Obtención de lactato (arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial (abajo).
47
En la figura anterior (arriba), se observan bandas en 1649 y 1719 cm-1 correspondientes a estiramientos
C=O, 2956 cm-1 del estiramiento OH proveniente del alcohol y 3398 cm-1 del estiramiento OH debido al
ácido carboxílico. Dichas bandas señalan la existencia de ácido láctico en la solución; sin embargo, la
longitud de los picos difiere respecto a las longitudes de ondas visualizadas en el ácido láctico comercial
(abajo). Dicha variación se debe principalmente a que el producto obtenido no posee la misma pureza del
ácido comercial.
Figura 4.2 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido de la fase acuosa- Método 2: Separación líquido-líquido
(arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial (abajo).
En la figuras 4.2 (arriba), se observan bandas en 1645 y 1720 cm-1 correspondientes a estiramientos C=O,
2939 cm-1 del estiramiento OH proveniente del alcohol y 3438 cm-1 del estiramiento OH debido al ácido
carboxílico. Si se compara el espectro obtenido con el espectro del ácido láctico comercial (abajo), se
tiene que el comportamiento del mismo es muy similar, a pesar de que las bandas se encuentren un poco a
la izquierda con respecto a sus valores.
48
Figura 4.3 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido de la fase orgánica- Método 2: Separación líquido-líquido
(arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial (abajo).
Por otro lado, en la figura 4.3 (arriba), se observan bandas en 1649 y 1721 cm-1correspondientes a
estiramientos C=O, 2938 cm-1del estiramiento OH proveniente del alcohol y 3301 cm-1del estiramiento
OH debido al ácido carboxílico. Estas bandas son similares a las obtenidas por el análisis del ácido láctico
comercial (abajo), donde destacan bandas en 1709 y 1753 cm-1estiramientos C=O, 2990 cm-1 estiramiento
OH proveniente del alcohol y 3370 cm-1estiramiento OH debido al ácido carboxílico.
En virtud de los resultados analizados anteriormente, se estableció que los métodos de purificación
evaluados resultaron efectivos para aumentar la concentración del ácido láctico presente en la solución,
además de mejorar las propiedades fisicoquímicas del mismo. Sin embargo, el método que dio los mejores
resultados para la purificación del ácido láctico obtenido por medio de la fermentación del suero lácteo,
fue el método 2 (separación líquido-líquido con 1-butanol), ya que éste permitió la precipitación de parte
de los azúcares remanentes en la solución logrando así una mayor purificación y mayor acercamiento a las
propiedades características del ácido láctico, en comparación con el método 1 (obtención de lactato).
También se estableció que la muestra obtenida de la fase orgánica del método 2, fue la que presentó los
valores más parecidos a las propiedades teóricas del ácido láctico, por lo tanto, se realizó la purificación
49
del resto de la solución fermentada con el método de separación líquido-líquido con 1-butanol y se extrajo
el ácido de la fase orgánica.
En la tabla 4.5 se presenta información sobre el proceso de policondensación aplicado al ácido láctico
purificado. En dicha tabla se puede evidenciar que la concentración de la solución era inicialmente de
21,90 %p/v y que una vez culminado el proceso de pre-concentración este valor aumento hasta 25 %p/v.
Este aumento en la concentración, concuerda con el comportamiento reportado por Jiménez et al., (2012),
los cuales indicaron que la concentración de la solución aumentaba debido a la eliminación, por
evaporación, de parte del agua presente en la solución; por tanto se consideró evidencia de un proceso de
pre-concentración efectivo.
En cuanto al proceso de oligomerización, se observa que comenzó con 200 mL y culminó en 120 mL de
solución. La disminución del volumen de la solución concuerda con lo reportado por Jiménez et al.,
(2012), ya que dicho proceso permitió la deshidratación de la solución y la misma se da mediante la
eliminación de agua por destilación.
En virtud de los resultados analizados, se estableció que el método de policondensación, utilizando como
catalizador zinc metálico, efectuado en tres etapas (pre-concentración, oligomerización y polimerización)
resultó efectivo para aumentar la concentración inicial del ácido a polimerizar y obtener un polímero como
capa en la superficie del líquido.
En la tabla 4.6 se muestran las características del producto obtenido al culminar el proceso de
policondensación del ácido láctico. En este sentido, se encontró que el polímero posee una densidad de
1,3g/ml. Dicho valor se encuentra dentro del rango establecido por Mazarro (2009) para el PLA, ver tabla
II.2, anexo II.
En cuanto al punto de fusión del material obtenido, la prueba realizada indicó que fue de 173°C, valor que
se encuentra dentro del rango establecido por Mazarro (2009), el cual indica que para este parámetro el
PLA posee un valor entre 170 y 183 °C.
Con respecto a la dureza del material, el polímero presentó un valor de 62 Shore A. Este valor difiere del
valor reportado por Figueira (2008), en donde se menciona una dureza de 83 Shore A para el PLA, pero el
valor reportado resulta igualmente aceptable como lo mencionan Aponte y Villazón (2001), pues el valor
indica que el material evaluado presenta resistencia a ser rayado o penetrado por otro cuerpo sólido. El
hecho de que el material de referencia indique un valor de dureza mayor al reportado en este estudio, solo
indica que el material de referencia tiene mayor resistencia al rayado y a la penetración en comparación
con el material en estudio.
51
Finalmente, en la tabla 4.6 se muestra que la prueba de ensayo de la llama indicó que el polímero obtenido
no contiene trazas de Zinc. Este resultado difiere de lo reportado por Estupiñan et al., (2007) donde se
demostró la presencia de zinc en la matriz principal del polímero obtenido, mediante un estudio de
microscopía electrónica de barrido y energía dispersiva de rayos X. Sin embargo, en este trabajo se
considera el resultado obtenido como satisfactorio, ya que el zinc utilizado en la polimerización tenía
como único objetivo el de funcionar como catalizador, y por tanto no debía estar presente en el producto
final.
En la figura 4.5 se muestra el espectro del material obtenido por la polimerización del ácido láctico. El
pico que se presenta en 1.744,38 cm-1 indica la presencia del grupo C=O. Otro pico en 2.990,35 cm-1 es
debido al grupo C-H y entre 1.000 y 1.200 cm-1 se encuentra otro pico sobresaliente que indica la
presencia de un enlace C-C en el polímero. El comportamiento del espectro obtenido indica una absorción
característica del PLA y se asemeja al resultado obtenido por Medina et al., (2014), quienes sintetizaron el
ácido poliláctico mediante policondensación del ácido láctico obtenido de la fermentación del fruto de
cují.
En cuanto al peso de las muestras también se evidenció que el mismo descendió en todos los casos
evaluados, pero la mayor variación de este parámetro se observó en la muestra que fue sumergida en la
solución buffer 1 (de pH 4). La disminución del peso concuerda con el comportamiento reportado por
Mazarro (2009), y resulta indicativo de que se ha producido degradación, debido a la ruptura de las
cadenas poliméricas.
53
CONCLUSIONES
3. El suero tratado proveniente de la quesera de propiedad familiar fue la mejor opción a utilizar como
sustrato, para la aplicación de un proceso fermentativo mediante el uso de microorganismos.
4. La mejor alternativa para la fermentación del suero lácteo fue la bacteria Lb. casei.
5. El suero lácteo pre-tratado y suplementado con carbonato de calcio, extracto de levadura, fosfato
mono-potásico, fosfato di-potásico, sulfato de magnesio y sulfato de manganeso, forma un medio de
cultivo adecuado para la producción de ácido láctico mediante una fermentación tipo lote de 24 horas a 37
°C y 150 rpm.
7. El método que dio mejores resultados para la purificación del ácido láctico obtenido por medio de la
fermentación del suero lácteo, fue el método de separación líquido-líquido con 1-butanol.
9. La policondensación del ácido láctico, obtenido de la fermentación del suero lácteo, utilizando como
catalizador zinc metálico, resultó efectiva para obtener un polímero con las características propias del
PLA.
10. El polímero obtenido mediante la fermentación del suero lácteo fue degradable mediante procesos de
hidrólisis.
54
RECOMENDACIONES
1. Realizar procesos de destilación al vacío durante el proceso de purificación para evitar degradación y
concentración de azúcares remanentes en la solución.
2. Evaluar otros métodos de purificación del ácido, por ejemplo: mediante el uso de membranas de
intercambio iónico.
55
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60
APÉNDICE A. DATOS RECOLECTADOS
Tabla A.1 Datos requeridos para la caracterización del suero proveniente de la quesera familiar.
Prueba Valor experimental Muestra/ Valor 1 Valor 2 Valor 3
Condición
Tabla A.2 Datos requeridos para la caracterización del suero proveniente de la empresa LACSA.
Prueba Valor experimental Muestra/ Valor 1 Valor 2 Valor 3
Condición
61
Tabla A.3 Datos requeridos para la caracterización del suero pre-tratado proveniente de la quesera
familiar.
Prueba Valor experimental Muestra/ Valor 1 Valor 2 Valor 3
Condición
Tabla A.4 Datos requeridos para la caracterización del suero pre-tratado proveniente de la empresa
LACSA.
Prueba Valor experimental Muestra/ Valor 1 Valor 2 Valor 3
Condición
62
Tabla A.5 Datos requeridos para la determinación de parámetros de seguimiento de la fermentación
del suero proveniente de la quesera familiar.
Condición Acidez iónica (pH±0,01)Adim Volumen de NaOH gastados Contenido de azúcar
(VNaOH±0,05)mL * (°Brix±0,1)°Brix
Valor 1 Valor 2 Valor 3 Valor 1 Valor 2 Valor 3 Valor 1 Valor 2 Valor 3
Puro 4,46 4,46 4,46 12,80 14,45 12,70 8,4 8,4 8,4
Con bacteria 4,85 4,87 4,89 12,80 12,80 12,70 8,4 8,4 8,4
Con bacteria y 6,16 6,15 6,14 0,40 0,80 0,60 8,4 8,4 8,4
pHinicial=6
Con bacteria + 4,89 4,87 4,90 12,75 12,75 12,70 10,0 10,0 10,0
suplementos
Con bacteria + 6,00 6,01 6,00 1,40 1,60 1,60 10,0 10,0 10,0
suplementos y
pHinicial=6
*: valor requerido para determinar contenido de ácido láctico.
Tabla A.7 Datos tomados después de la fermentación de prueba del suero proveniente de la quesera
familiar.
Condición Acidez iónica (pH±0,01)Adim Volumen de NaOH gastados Contenido de azúcar
(VNaOH±0,05)mL * (°Brix±0,1)°Brix
Valor 1 Valor 2 Valor 3 Valor 1 Valor 2 Valor 3 Valor 1 Valor 2 Valor 3
Puro 4,37 4,37 4,37 14,50 15,00 15,00 7,6 7,6 7,6
Con bacteria 4,51 4,50 4,52 14,60 15,20 14,85 7,6 7,6 7,6
Con bacteria y 6,00 5,99 6,01 1,40 1,30 1,30 8,0 8,0 8,0
pHinicial=6
Con bacteria + 4,73 4,71 4,71 14,10 14,00 14,20 9,0 9,0 9,0
suplementos
Con bacteria + 5,24 5,24 5,23 8,50 8,65 8,60 8,4 8,4 8,4
suplementos y
pHinicial=6
*: valor requerido para determinar contenido de ácido láctico.
63
Tabla A.8 Datos tomados después de la fermentación de prueba del suero proveniente de la empresa
LACSA.
Condición Acidez iónica (pH±0,01)Adim Volumen de NaOH gastados Contenido de azúcar
(VNaOH±0,05)mL * (°Brix±0,1)°Brix
Valor 1 Valor 2 Valor 3 Valor 1 Valor 2 Valor 3 Valor 1 Valor 2 Valor 3
Puro 3,91 3,91 3,91 15,60 15,30 15,40 5,0 5,0 5,0
Con bacteria 4,17 4,18 4,17 15,30 15,30 15,40 4,5 4,5 4,5
Con bacteria y 5,93 5,95 5,94 2,90 2,80 2,80 5,0 5,0 5,0
pHinicial=6
Con bacteria + 4,49 4,49 4,49 15,20 15,25 15,40 6,0 6,0 6,0
suplementos
Con bacteria + 5,58 5,58 5,57 7,30 7,20 7,30 6,0 6,0 6,0
suplementos y
pHinicial=6
*: valor requerido para determinar contenido de ácido láctico.
Tabla A.9 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra antes de la adición de carbonato.
Prueba Valor Experimental Muestra/ Valor 1 Valor 2 Valor 3
Condición
Acidez titulable Volumen de NaOH gastados (10 ± 1) mL 9,80 9,85 10,00
(VNaOH±0,05) mL
Tabla A.10 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado medianteel
Método de lactato.
Prueba Valor experimental Muestra/ Valor 1 Valor 2 Valor 3
Condición
Acidez iónica pH (pH±0,01) Adim 50 mL de suero 4,20 4,21 4,20
Índice de Refracción Nd (Nd±0,0005) Adim Alícuota 1,3850 1,3850 1,3850
Tabla A.11 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado de la fase acuosa, obtenida
por el método de extracción líquido-líquido
Prueba Valor Muestra/ Valor 1 Valor 2 Valor 3
experimental Condición
Acidez iónica pH 50 mL de suero 3,77 3,80 3,81
(pH±0,01)Adim
Índice de Nd Alícuota 1,4460 1,4460 1,4460
refracción (Nd±0,0005)Adim
Tabla A.12 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado de la fase orgánica,
obtenida por el método de extracción líquido-líquido.
Prueba Valor Muestra/ Valor 1 Valor 2 Valor 3
experimental Condición
Acidez iónica pH 50 mL de suero 3,47 3,44 3,43
(pH±0,01)Adim
Índice de Nd Alícuota 1,4445 1,4445 1,4445
refracción (Nd±0,0005)Adim
64
Tabla A.13 Parámetros necesarios para determinar la densidad del ácido antes y después de
purificar.
Masa picnómetro lleno (m2±0,0001)g
Valor 1 Valor 2 Valor 3
Solución inicial 51,8452 51,9457 51,9479
Ácido de lactato1 52,5072 52,5080 52,5086
Ácido fase acuosa2 53,3465 53,3454 53,3498
Ácido fase orgánica2 53,5998 53,6003 53,6005
Masa del picnómetro vacío (m1±0,0001) g: 23,5568
Volumen picnómetro: 25mL
1 2
y : se refieren al método de purificación aplicado; obtención de lactato y separación líquido-líquido respectivamente.
Tabla A.14 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra diluida de ácido purificado.
Volumen de NaOH utilizado (VNaOH±0,05)mL
Valor 1 Valor 2 Valor 3
Ácido de lactato1 1,50 1,60 1,45
Ácido fase acuosa2 3,80 3,65 3,75
Ácido fase orgánica2 4,40 4,35 4,50
Volumen de ácido purificado: (2,0 ± 0,5) mL
Volumen de muestra diluida: (20,0 ± 0,5) mL
Volumen alícuota valorada: (2,0 ± 0,5) mL
Tabla A.15 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra diluida de ácido pre-concentrado
Volumen de NaOH utilizado (VNaOH±0,05) mL
Valor 1 Valor 2 Valor 3
5,00 5,30 5,20
Volumen de ácido purificado: (2,0 ± 0,5) mL
Volumen de muestra diluida: (22,0 ± 0,5) mL
Volumen alícuota valorada: (2,0 ± 0,5) mL
Tabla A.16 Parámetros necesarios para el cálculo de la densidad del polímero sintetizado.
Muestra Peso de la muestra Volumen de agua Volumen de agua +
(m±0,0001) g (V1±0,2) mL muestra (V2±0,2) mL
1 2,5278 10,0 12,0
2 2,5276 10,0 12,0
3 2,5280 10,0 12,0
Tabla A.17 Punto de fusión del polímero sintetizado, calculado mediante el Método de Thiele.
Muestra Punto de fusión experimental (Pf±1) °C
1 170
2 175
3 175
65
Tabla A.18 Acidez iónica de las soluciones antes y después del proceso de degradación.
pH inicial (pHi ± 0,01)Adim pH final (pHf ± 0,01)Adim
Solución Valor 1 Valor 2 Valor 3 Valor 1 Valor 2 Valor 3
Buffer 1 4,02 4,04 4,02 4,01 4,00 4,00
Agua de 7,32 7,30 7,30 7,20 7,24 7,18
chorro
Buffer 2 10,07 10,09 10,07 10,07 10,05 10,05
Buffer 1: solución de pH=4.
Buffer 2: solución de pH=10.
pH: acidez iónica.
Tabla A.19 Peso de las muestras antes y después del proceso de degradación.
Peso inicial (Pi ± 0,0001)Adim Peso final (Pf ± 0,0001)Adim
Solución Valor 1 Valor 2 Valor 3 Valor 1 Valor 2 Valor 3
Buffer 1 0,2758 0,2756 0,2760 0,2602 0,2602 0,2602
Agua de 0,2588 0,2589 0,2587 0.2502 0,2502 0,2502
chorro
Buffer 2 0,2740 0,2742 0,2744 0,2650 0,2650 0,2650
Buffer 1: solución de pH=4.
Buffer 2: solución de pH=10.
pH: acidez iónica.
66
APÉNDICE B. CÁLCULOS TÍPICOS
(Walpole, 1999)
Donde:
X: valor promedio del parámetro de interés.
Xi: valor “i”.
n: número de mediciones, (Adim).
Sustituyendo los datos suministrados en la tabla A.1 (Apéndice A) para el cálculo de °Brix, se obtuvo que
el contenido de azúcares presentes en el suero lácteo proveniente de la quesera familiar, antes del
pretratamiento, resultando ser de:
8,3 + 8,3 + 8,3
°𝐵𝑟𝑖𝑥 = = 8,3 °𝐵𝑟𝑖𝑥
3
Cálculo del error:
Aplicando el método de derivadas parciales, se obtuvo que:
𝜕𝑋
∆𝑋 = ∑𝑛𝑖=1 (| | . ∆𝑋𝑖 ) (B.2)
𝜕𝑋𝑖
(Walpole, 1999)
Donde:
∆:error asociado a la variable en estudio.
Al sustituir, se obtiene:
0,1 0,1 0,1
∆°𝐵𝑟𝑖𝑥 = ( + + ) = 0,1
3 3 3
Por tanto, el valor del contenido de azúcar presente en el suero, se expresa de la siguiente manera:
°𝐵𝑟𝑖𝑥 = (8,3 ± 0,1) °𝐵𝑟𝑖𝑥
Para determinar el valor de este parámetro, después de aplicar el pre-tratamiento, se aplican las mismas
formulas, sustituyendo en esta ocasión la información contenida en la tabla A.3.
De igual forma, se procedió con el suero proveniente de la empresa LACSA, cuya información de interés
se encuentra en las tablas A.2 y A.4.
67
Determinación del contenido de ácido láctico presente en el suero
Según la Norma COVENIN 658:1997, se establece que una de las formas de expresar los resultados es
indicando que por cada 1mL de NaOH 0,1N gastados en el estudio se tienen 0,009 g de ácido láctico, en
los 10 mL de muestra.
Adaptando dicha relación para reportar los resultados en gramos de ácido láctico por cada litro de suero,
se obtuvo que:
𝐶𝐴𝐿 = 𝐹1. 𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 (B.3)
(COVENIN 658:1997)
Donde:
CAL: cantidad de ácido láctico contenido en 1 litro de suero, (g/L).
F1: constante de valor 0,9 gAL/(Lsuero. mLNaOH)
VNaOH: volumen de hidróxido de sodio 0,1M utilizados en la valoración del suero, (mL).
Sustituyendo los datos suministrados en la tabla A.1 (Apéndice A), se obtuvo que la cantidad de ácido
láctico presente en 1Litro de suero lácteo proveniente de la quesera familiar, antes del pre-tratamiento, es:
0,9𝑔𝐴𝐿 𝑔𝐴𝐿
𝐶𝐴𝐿 = . 12,80𝑚𝐿𝑁𝑎𝑂𝐻 = 11,52
𝐿𝑠𝑢𝑒𝑟𝑜 . 𝑚𝐿𝑁𝑎𝑂𝐻 𝐿𝑠𝑢𝑒𝑟𝑜
De la misma forma, se procedió a calcular con el resto de los datos y se calculó un promedio, según la
ecuación B.1, con la cual se obtuvo:
𝑔𝐴𝐿
𝐶𝐴𝐿 = 11,985
𝐿𝑠𝑢𝑒𝑟𝑜
Calculando el error de la medición aplicando el método de derivadas parciales:
𝜕𝐶𝐴𝐿 𝑔𝐴𝐿
∆𝐶𝐴𝐿 = | | . ∆𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 = |𝐹1|. ∆𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 = 0,9.0,05 = 0,045 ≅ 0,05
𝜕𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 𝐿𝑠𝑢𝑒𝑟𝑜
Entonces, el contenido de ácido láctico presente en el suero, antes del pre-tratamiento, se expresa de la
siguiente manera:
𝑔𝐴𝐿
𝐶𝐴𝐿 = (11,99 ± 0,05)
𝐿𝑠𝑢𝑒𝑟𝑜
68
El cálculo de este parámetro para el mismo suero, después del pre-tratamiento, se calculó con los datos
recolectados en la tabla A.3 y para el suero proveniente de la empresa LACSA antes y después del
tratamiento, con información de las tablas A.2 y A.4 respectivamente.
La tabla A.3 muestra información para el mismo suero después de ser tratado y las tablas A.2 y A.4 para el
suero proveniente de la empresa LACSA antes y después del tratamiento.
(COVENIN 368:1997)
Donde:
C: porcentaje de cenizas, (%p/p).
M1: masa del vidrio de reloj vacío, (g).
M2: masa del vidrio de reloj con 1mL de muestra, (g).
M3: masa del vidrio de reloj con las cenizas, (g).
De la misma forma, se procedió a calcular el porcentaje de cenizas para el valor 2 y 3; luego se calculó un
promedio, según la ecuación B.1, con la cual se obtuvo:
𝐶 = 5,7564 %𝑝/𝑝
Aplicando el método de las derivadas parciales a la ecuación B.4, se obtuvo el error, el cual se expresa de
la siguiente manera:
𝜕(𝐶) 𝜕(𝐶) 𝜕(𝐶) 0,02
∆𝐶 = | | . ∆(𝑀1) + | | . ∆(𝑀2) + | | . ∆(𝑀3) = = 0,019 ≅ 0,02
𝜕(𝑀1) 𝜕(𝑀2) 𝜕(𝑀3) 𝑀2 − 𝑀1
Como el cálculo se realizó por triplicado, se aplicó la ecuación B.1 para obtener la media del valor, siendo
esta:
𝑃 = 15,0453 %
Cálculo del error:
Aplicando el método de derivadas parciales
𝜕𝑃
∆𝑃 = | | . ∆𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 ∗ = 2,24 × 0,05 = 0,112 ≅ 0,1
𝜕𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 ∗
70
Por tanto, la cantidad de proteínas presentes en el suero fueron:
𝑃 = (15,0 ± 0,1) %
Dicho valor es para el suero proveniente de la quesera familiar antes de tratamiento térmico aplicado; para
conocer su valor después de dicho tratamiento, se utilizó la tabla A.3. Para el suero proveniente de la
empresa LACSA, se utilizaron las tablas A.2 y A.4.
Sustituyendo los datos reportados en las tablas 4.1 y 4.2, se logró visualizar los cambios producidos por el
pre-tratamiento aplicado a los sueros. Ejemplo: para determinar el cambio de la cantidad de proteínas
presentes en el suero de la quesera familiar, se obtuvo que:
𝑉𝑃 = |12,5% − 15,0%| = 2,5%
Para el suero proveniente de la quesera familiar suplementado y con la bacteria, según información
contenida en la tabla A.5 del apéndice A, se obtuvo que:
Las tablas A.5, A.6, A.7 y A.8 contienen información para el cálculo de este parámetro antes y después de
la fermentación de prueba, según el tipo de suero utilizado.
Por tanto, el contenido de azúcar presente en dicha solución, se expresa de la siguiente manera:
°𝐵𝑟𝑖𝑥 = (6,0 ± 0,1) °𝐵𝑟𝑖𝑥
0,9𝑔𝐴𝐿 𝑔𝐴𝐿
𝐶𝐴𝐿 = . 14,50𝑚𝐿𝑁𝑎𝑂𝐻 = 13,05
𝐿𝑠𝑢𝑒𝑟𝑜 . 𝑚𝐿𝑁𝑎𝑂𝐻 𝐿𝑠𝑢𝑒𝑟𝑜
De la misma forma se procedió a calcular con el resto de los datos y se calculó un promedio, según la
ecuación B.1, con la cual se obtuvo:
𝑔𝐴𝐿
𝐶𝐴𝐿 = 13,35
𝐿𝑠𝑢𝑒𝑟𝑜
72
Reportando el valor con su error asociado, se obtuvo:
𝑔𝐴𝐿
𝐶𝐴𝐿 = (13,35 ± 0,05)
𝐿𝑠𝑢𝑒𝑟𝑜
La información de interés para este cálculo se encuentra contenida en las tablas A.5, A.6, A.7 y A.8
Donde se indica que 2 moles de AL deben reaccionar con 1 mol de carbonato para producir el lactato; por
tanto, para determinar la cantidad de carbonato a adicionar, se utilizó la siguiente ecuación:
𝐶𝑏 .𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 1 𝑚𝑜𝑙 𝐶𝑎𝐶𝑂3
𝑔𝐶𝑎𝐶𝑂3 = . 𝑉𝑆𝐸 . . 𝑃𝑀𝐶𝑎𝐶𝑂3 (B.7)
𝑉𝐴 2 𝑚𝑜𝑙 𝐴𝐿
(Propio)
Donde:
gCaCO3: Cantidad de carbonato de calcio, (g).
Cb: concentración de la base utilizada, mol/L. (Valor conocido MNaOH=0,1 mol/L)
VA: Volumen alícuota de solución titulada, mL. (Valor reportado en tabla A.9)
VSE: volumen de solución a tratar, (L).
PMCaCO3: peso molecular del carbonato de calcio, g/mol. (Valor teórico= 100,087g/mol)
73
Sustituyendo los valores, se obtuvo que:
0,1𝑀. 𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 (𝑚𝐿) 1 𝑚𝑜𝑙 𝐶𝑎𝐶𝑂3 100,087𝑔 𝐶𝑎𝐶𝑂3
𝑔𝐶𝑎𝐶𝑂3 = . 𝑉𝑆𝐸 (𝐿). .
10𝑚𝐿 2 𝑚𝑜𝑙 𝐴𝐿 1𝑚𝑜𝑙 𝐶𝑎𝐶𝑂3
Resolviendo y simplificando:
𝑔𝐶𝑎𝐶𝑂3 = 0,5. 𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 . 𝑉𝑆𝐸 (B.8)
Para la prueba de obtención del lactato, se utilizaron 0,1L de solución y el volumen de base gastada
durante la titulación, se obtuvo al promediar los valores reportados en la tabla A.9 (según la ecuación B.1).
La cual indica que para la producción de 2 moles de AL es necesaria la adición de 1 mol de ácido
sulfúrico; por tanto, para determinar la cantidad de H2SO4 a añadir, se utilizó la siguiente ecuación:
𝐶𝑏 .𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 1 𝑚𝑜𝑙 𝐻2𝑆𝑂4 1
𝑉𝐻2𝑆𝑂4 = . 𝑉𝑆𝐸 . . 𝑃𝑀𝐻2𝑆𝑂4 . (B.9)
𝑉𝐴 2 𝑚𝑜𝑙 𝐴𝐿 𝜌𝐻2𝑆𝑂4
Donde:
VH2SO4: volumen de ácido sulfúrico, (mL).
PMH2SO4: peso molecular del ácido sulfúrico, (g/mol). (Valor teórico= 98,079 g/mol)
ρH2SO4: densidad del ácido sulfúrico, (g/mL). (Valor teórico= 1,84 g/ml)
74
Resolviendo y simplificando:
𝑉𝐻2𝑆𝑂4 = 0,2665. 𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 . 𝑉𝑆𝐸 (B.10)
De igual forma para la aplicación del método de obtención de lactato, se obtuvo que:
1
𝑉𝐻2𝑆𝑂4 = 0,2665 . 9,88 𝑚𝐿. 0,1𝐿 = 0,26 𝑚𝐿 ≈ 0,5 𝑚𝐿
𝐿
Nota: cuando el valor es muy pequeño, se aproxima al mínimo que pueda ser medible en el instrumento a
utilizar.
De igual forma, se procedió al cálculo de la acidez de las soluciones resultantes del método de separación
líquido-líquido con 1-butanol, utilizando la información contenida en las tablas A.11 y A.12.
Cálculo del error: se aplicó la ecuación B.2 relacionada al método de derivadas parciales, y al simplificar y
sustituir los valores, se obtuvo que:
0,0005 0,0005 0,0005
∆𝑁𝑑 = ( + + ) = 0,0005
3 3 3
75
Por tanto, el valor a reportar fue de:
𝑁𝑑 = (1,3850 ± 0,0005) 𝐴𝑑𝑖𝑚
Con información contenida en las tablas A.11 y A.12, se procede a realizar los cálculos necesarios para
determinar este parámetro en el caso del la purificación con 1-Butanol.
(Chang, 2010)
Donde:
ρ: densidad de la solución a analizar, (g/mL).
m1: masa del picnómetro vacío, (g).
m2: masa del picnómetro lleno, g.
v: volumen del picnómetro, mL.
El cálculo del valor promedio de m2 se realizó mediante la utilización de la ecuación B.1, y los datos
reportados en la tabla A.13. Al sustituir el resto de los valores (también suministrados en la tabla antes
referida) para el método 1, se obtuvo que:
52,5079 − 23,5568
𝜌= = 1,158044 𝑔/𝑚𝐿
25
Entones,
𝜌 = (1,1580 ± 0,0002)𝑔/𝑚𝐿
Entonces, para determinar la concentración del ácido diluido y titulado con NaOH 0,1M obtenido del
método 1 de purificación, se tomaron los datos suministrados en la tabla A.14 y se obtuvo que:
𝑚𝑜𝑙
0,1 × 1,50𝑚𝐿
𝐿
𝐶𝐴𝐿,𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑑𝑜 = = 0,075 𝑚𝑜𝑙/𝐿
2𝑚𝐿
Aplicando el método de derivadas parciales para la obtención del error, se obtuvo que:
𝑚𝑜𝑙
𝐶𝑏 0,1 𝐿
∆𝐶𝐴𝐿,𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑑𝑜 = × ∆𝑉𝑏 = × 0,05𝑚𝐿 = 0,0025𝑚𝐿 ≈ 0,003𝑚𝐿
𝑉𝑎 2𝑚𝐿
De igual forma, se procedió al cálculo de la concentración diluida del ácido purificado, mediante el
método de separación líquido-líquido.
Para reportar el valor en %p/v, es necesario la transformación de unidades, por lo que es utilizado el peso
molecular del ácido y un factor de conversión, como se muestra a continuación:
77
𝑝 𝑚𝑜𝑙 𝑔 1𝐿
% = [𝐶𝐴𝐿 ( ) . 𝑃𝑀𝐴𝐿 ( ). ] . 100
𝑣 𝐿 𝑚𝑜𝑙 1000𝑚𝐿
Donde:
%p/v: concentración del ácido en unidades peso/volumen, (%).
PMAL: peso molecular del ácido láctico, (g/mol). (Valor teórico: 90,08g/mol)
De igual forma, se procedió con el resto de los valores reportados, utilizándose el valor promedio,
mediante la utilización de la ecuación B.1. Tomando en cuenta el error, se tiene:
Donde:
ρpol: densidad del polímero sintetizado, (g/mol).
m: masa de la muestra en estudio, (g).
V1: Volumen de agua, (mL).
V2: Volumen de agua más muestra, (mL).
Si se toman los valores reportados en la tabla A.16 correspondientes a la muestra 1, se obtuvo que:
2,5278 𝑔
𝜌𝑝𝑜𝑙 = = 1,2639 𝑔/𝑚𝐿
(12,0 − 10,0) 𝑚𝑙
Realizando el cálculo del error asociado a la medida, mediante el método de derivadas parciales:
1 𝑚 𝑚
∆𝜌𝑝𝑜𝑙 = . ∆𝑚 + 2
. ∆𝑉2 + . ∆𝑉3 = 0,2
𝑉2 − 𝑉1 (𝑉2 − 𝑉1 ) (𝑉2 − 𝑉1 )2
79
De igual forma, se procedió a calcular las muestras 2 y 3. El valor promedio de densidad fue calculado
mediante los valores de densidad puntual obtenidos para cada muestra y la ecuación B.1.
80
Ejemplo: el peso de la muestra polimérica sumergida en la solución buffer 1 antes del proceso de
degradación fue de:
𝑃𝑖1 + 𝑃𝑖2 + 𝑃𝑖3 (0,2758 + 0,2756 + 0,2760)𝑔
𝑃𝑖 = = = 0,2758 𝑔
3 3
Donde:
Pi: peso inicial de la muestra, (g).
1,2 y 3: valores individuales medidos con el equipo.
Por ser la misma medición el valor a reportar debe poseer el mismo error del equipo, es decir ± 0,0001g.
De igual forma se procedió para las distintas muestras, antes y después del proceso en estudio.
Cálculo del porcentaje de variación de los parámetros analizados en la degradación del polímero
Se utiliza la siguiente ecuación:
𝑉𝑖−𝑉𝑓
%𝑉 = 𝑉𝑖
× 100 (B.14)
Donde:
%V: porcentaje de variación del parámetro a evaluar.
Vf: Valor final.
Vi: Valor inicial.
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ANEXO I. INFORMACIÓN PARA LA SELECCIÓN DEL MICROORGANISMO
FERMENTADOR
Tabla I.1 Información relevante respecto al uso de bacterias u hongos en el proceso fermentativo
Característica Bacteria Hongo
Viscosidad del medio Baja Alta
Formación de burbujas No -
Formación de subproductos Poca Si, especialmente el etanol
Aprovechamiento de azúcares Alto Disminuye según la viscosidad
Demanda de oxigeno No es necesario controlar Alta
Requerimiento de fuentes de Necesario Innecesario
nitrógeno
Proceso de separación del medio Involucra varios estudios Sencillo
Variedad de géneros * Alta -
Estudios relacionados** Varios Ninguno
*: Se refiere a la cantidad de microorganismos antes utilizados y posiblemente útiles para el proceso fermentativo
**: Se refiere a la cantidad de estudios encontrados en los cuales aplica el microorganismo para fermentar suero lácteo
-: No se tiene información.
Fuente: (García et al., 2010; Munilla y Blanco, 2005; Ríos, 2011).
82
ANEXO II. INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA
Tabla II.1 Productividad de ácido láctico en diferentes condiciones de fermentación tipo lote
Sustrato Microorganismo Suplementos Condiciones de Ácido Fuente
fermentación láctico
(g/L)
Lactosuero diluido Lb. helviticus y Ninguno 37 °C 4,1 y 3,9 García et al.,
36 g/L Lb. bulgaricus 150 rpm 2013
Lactosuero Lb. casei Lactosa 37°C; pH=6,5 1,1
pasteurizado y MnSO4 21 h ;150 rpm
Desproteinizado
Suero Lb. casei E.L; KH2PO4; 37°C; 150 rpm 12,45 Ríos, 2011
desproteinizado K2HPO4; MgSO4 y 24 h
MnSO4
Lb. bulgaricus Ninguno 43°C y 125rpm 3 Sánchez at
pH= 6,5 al., 2007
Lactosuero Lb. casei E.L; KH2PO4; 37°C y 150rpm 6,35 Trabajo
desnatado y K2HPO4; MgSO4 y 24 h actual
desproteinizado MnSO4
Lb: Lactobacillus; E.L: Extracto de levadura
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ANEXO III. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN
Método 1: Formación de lactato
El método se realiza con la adición de carbonato de calcio (CaCO3). La formación del lactato se da por la
reacción del carbonato con el ácido láctico presente en la solución, según se muestra a continuación:
También se produjo lactato de calcio durante la fermentación; ya que durante la misma, el ácido láctico
inicialmente generado por las bacterias, reaccionó con el CaCO3 añadido inicialmente para la regulación
del pH de la solución.
La regeneración del ácido se dio mediante la adición de ácido sulfúrico (H2SO4), como lo indica la
siguiente reacción:
Durante esta mezcla se dio la formación de un precipitado marrón grisáceo, el cual según la reacción
anterior, vendría siendo el sulfato de calcio que resulta como producto secundario. Gil et al., 2008 reporta
la producción de dicho precipitado al realizar la misma mezcla.
Las cantidades de reactivos a añadir fueron determinadas por estequiometría, tal y como se puede observar
en el apéndice A; sin embargo, resultó importante aclarar que, en el caso de agregar carbonato de calcio en
exceso esto no fuera generado grandes cambios en los resultados, ya que como se indica en la siguiente
estequiometría, el exceso reaccionaría con el H2SO4 para la formación de más sales de sulfato, que pueden
ser retiradas por filtración.
84
calor pero no se observó gran formación de precipitado. El aumento de temperatura se debió a que la
reacción entre el agua contenida en la solución y el ácido sulfúrico es exotérmica.
Según Gil et al., (2008), la adición de 1-butanol a la solución de ácido láctico produce la siguiente
reacción:
Según la reacción anterior la mezcla de 1-butanol y el ácido láctico, permitió la formación de un ester
(lactato de 1-butilo) y agua. Este producto es visualizado, tal y como lo indican Gil et al., (2008), por la
formación de dos fases, ya que los esteres no se mezclan con agua.
También, producto de la experimentación, se observó que al dejar en reposo esta mezcla, precipitaba parte
de los azúcares que no fueron consumidos por los microorganismos en el proceso de fermentación. Esto
representa una ventaja ante el método de obtención de lactato pues se estaría cumpliendo con uno de los
objetivos de la purificación que es la eliminación de azúcares remanentes. En este caso, la precipitación de
los azúcares se debió a la presencia del alcohol en la solución (Gil et al., 2008).
La hidrólisis del ester formado, permitió la siguiente transformación (Gil et al., 2008):
Con el proceso de destilación se logró obtener el ácido purificado como residuo y aparte el alcohol
recuperado como destilado.
A pesar que la información bibliográfica indica que mediante este método la mayor cantidad de ácido
láctico está contenida en la fase orgánica; también se sabe que el ácido láctico es miscible en agua (Serna
y Rodríguez, 2005). Por esto, en el presente trabajo de investigación, se partió del supuesto de que en la
fase acuosa también había presencia del ácido de interés. Al realizar la destilación de dicha fase se asumió
que el residuo obtenido era ácido láctico purificado y concentrado.
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