FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE
CHIHUAHUA

PRACTICA No. 4 “Amplificación de ADN

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)”

BIOLOGÍA MOLECULAR
M.C. Edward Alexander Espinoza Sánchez

Luis Andres Carrillo Quezada 291921

Brenda Guiterrez Dominguez 291810
Karen Elizabeth Fernandez Monreal 291699
Karla Zuleem Jarmillo Sotelo 282348
Ana Cristina Gonzalez Gonzalez 271832
Ivonne Ahudey Gomez Varela 288327
Resumen
Se llevó a cabo una amplificación del gen 16S de procariota por el método de
reacción en cadena de la polimerasa y posteriormente se confirmó su
presencia por medio de electroforesis.

Objetivo.
Obtener una amplificación del gen 16S de una procariota.

Objetivo específico.
Conocer la diferencias que hay en la extracción de ADN cromosomal y
plasmídico, así como saber el papel que juega cada reactivo.

Introducción

La Reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR p, es una

técnica de biología molecular, cuyo objetivo es obtener un gran número de
copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo. Esta
técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificación,
resulta mucho más fácil identificar genes particulares como es el caso de 16S,
que es un componente de la subunidad pequeña 30S de los ribosomas
procariotas.

La comparación de las secuencias de los ARNr 16S permite establecer las

relaciones filogenéticas existentes entre los organismos procariotas, se usa
ampliamente para la identificación de cepas bacterianas como mínimo a nivel
de género, y muchas veces a nivel de especie y en microbiología clínica la
identificación molecular basada en el ADNr 16S se utiliza fundamentalmente
para bacterias cuya identificación mediante otro tipo de técnicas resulta
imposible, difícil o requiere mucho tiempo ya que el 16S es diferente para cada
una con pequeñas alteraciones.

MATERIALES y REACTIVOS
 ADN de diferentes cepas bacterianas.
 Iniciadores para el gen 16 S del rARN:
 8F (5’-GCG GAT CCG CGG CCG CTG CAG AGT TTG ATC CTG GCT
CAG-3’) y 1492R (5’-GGC TCG AGC GGC CGC CCG GGT TAC CTT
GTT ACG ACT T-3’) (Relman, 1993).
 Mezcla de desoxirribonucleótidos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
 Cloruro de magnesio (MgCl2).
 Amortiguador (Buffer PCR).
 Enzima Taq Polimerasa.
 H2O inyectable.
 Agarosa
 Amortiguador TAE 1X
 SYBR® Safe ADN gel stain
  Amortiguador de muestra (Azul de bromofenol y glicerol)
 Marcador de peso molecular (100 pb ladder)

METODOLOGÍA
1. En un tubo de 0.2 mL para PCR se colocan todos los reactivos
(mantener los reactivos y la mezcla de reacción en hielo) (dNTP, MgCl2,
buffer PCR, primer 8F, primer 1492R, Taq polimerasa, ADN digerido
previamente).
2. Mezclar los reactivos con micropipeta, cerrar bien el tubo de 0.2 mL y si
es necesario dar un spin en la microcentrífuga para llevar la mezcla de
reacción al fondo del tubo. Luego se colocan los tubos en el
termociclador con el siguiente programa: 1 ciclo de desnaturalización
inicial a 94 ºC por 5 minutos, 35 ciclos de desnaturalización 94 ºC por 1
minuto, alineamiento 55 ºC por 1 minuto, extensión 72 ºC por 1 minuto y
1 ciclo de Extensión final a 72 ºC por 5 minutos.
3. Al final de la amplificación, se mantienen las muestras en el
termociclador a una temperatura de 4 ºC, pero se recomienda sacarlas
en el menor tiempo posible y guardarlas a una temperatura de -20 ºC
hasta su uso.
4. Para visualizar el producto de PCR se realiza una electroforesis en gel
de agarosa al 1.5% con amortiguador TAE 1X, a 80 V durante 80
minutos. En cada pozo se cargan 3 µl del producto amplificado
(amplicón) mezclados con su correspondiente amortiguador de carga. El
tamaño del fragmento esperado es de 1500 pb, por lo que se
recomienda utilizar el marcador de peso molecular 100 bp Ladder.

Resultados

Discusión reacción en cadena de la polimerasa

De una digestión parcial de un ADN procariótico, se va a amplificar el gen 16S,

obtentiendo multiples copias de este. Este ADN es colocado en un tubo con
varios reactivos que actuaran a la vez para poder comenzar la replicación de
ADN y asi poder obtener las copias de este gen.

Se agrega al tubo el buffer de PCR, el buffer es necesario en la reacción ya que

va a mantener el pH estable en el medio, las polimerasas que son agregadas
posteriormente son sensibles a cambios de pH cuando se trata de su eficiencia
y especificidad en la síntesis de ADN. Este buffer normalmente está formado
por Tris-HCl, KCl y MgCl2. En la reacción de PCR se añaden los cuatro dNTPs
que son desoxirribonucleótidos que conforman la secuencia de ADN, estos
nucleótidos libres son nucleósido trifosfatos que contienen iones de fosfato en
una solución con iones de hidrogeno libres, estos iones interactúan y forman
ácido fosfórico e incrementan la acidez de la solución de PCR, aquí es donde el
buffer Tris-HCl actúa para mantener el pH estable entre 8 a 9.5 para la reacción
de polimerasa, Tris-HCl también se puede encontrar en el buffer de Taq.
El KCl facilita la unión de los iniciadores o primers de la hebra molde por su
unión a los grupos fosfatos de las hebras de ADN, una vez estabilizada la
carga, el primer y la hebra molde no se repelen por cargas eléctricas.

Conclusiones

La relación obtenida de la extracción ADN cromosomal fue menore a 1.8, este

ADN se considera que no es puro y pose contaminación con proteínas. La
relación que se obtuvo de la extracción de ADN plasmídico también resulto ser
menor a 1.8, sin embargo es más puro que la extracción de ADN cromosomal.

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