CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE Echerichia coli y Bacillus

cereus
Barona Fernández., Hernández Barona Mariana., Ramírez Andrea.
Escuela de Ingeniería de Alimentos – Microbiología de Alimentos
Universidad del Valle
Octubre 29 de 2014
Santiago de Cali

RESUMEN
El objetivo de esta práctica fue caracterizar la E. coli y B. cereus utilizando pruebas
bioquímicas de TSI, lisina descarboxilasa, citrato de Simmons, urea de Christensen,
prueba de indol, reacción del rojo de etilo, reacción de Voges Proscaver (para E. coli); y
agar leche, gelatina y almidón (para B. cereus).

INTRODUCCIÓN
Las pruebas bioquímicas permiten diferenciar las bacterias de una misma familia. Como el
caso de los géneros de la familia Enterobacteriace. También las pruebas bioquímicas
proporcionan información acerca del nicho de la especie en el ecosistema. Por ejemplo
existen pruebas bioquímicas para determinar la capacidad de fermentar un conjunto de
hidratos de carbono escogido.
Las enterobacterias Gram negativas conforman un grupo grande y diverso de
microorganismos cuyo hábitat natural es el tracto intestinal de los seres humanos y otros
animales. Todos los miembros de esta familia son oxidasa negativos. Las bacterias de
esta familia pertenecen a los géneros: Escherichia, Enterobacter, Shigella, Citrobacter y
Salmonella. Estas fermentan la lactosa para producir ácido y gas, con excepción de
Salmonella y Shigella. [1]
Dentro de las pruebas bioquímicas para la identificación de esta familia están: pruebas de
Hugh-Leiffson que permite apreciar el metabolismo oxidativo y/o fermentativo; prueba en
medio KIA (kligler-iron-agar) que permite demostrar si el microorganismo utiliza la glucosa
y/o lactosa, con o sin producción de SH2 y/o gas; prueba de indol en medio líquido
peptonado; prueba de reacción de nitratos a nitritos en caldos nitratados; prueba de la
utilización de citrato, determinación de movilidad en medio ornitin-movilidad, por ejemplo;
prueba de rojo de metilo en caldo glucosado; prueba de la determinación de la acetonina
o acetil-metil-carbinol en medio Clark y Lubs (prueba de Voges-Proskawer); y finalmente
la prueba para determinar producción de desaminasas.[2]
También es muy frecuente determinar las pruebas bioquímicas prácticamente mediante
pruebas multitest de determinación rápida, por ejemplo las tiras API; para el caso de las
enterobacterias son útiles las tiras 20E, éstas tienen 20 pruebas claves para
determinación rápida de estos microorganismos.[3]

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Las pruebas bioquímicas tiene una importancia alta en la evaluación de la calidad de un
alimento, debido que los alimentos pueden ser afectados por diferentes géneros
bacterianos, ser fuente de contaminación con sus toxinas, entre otras razones por la
cuales es importantes realizar pruebas bioquímicas, que permitan la identificación y
caracterización de una bacteria en particular. En esta ocasión se trabajo con los
microorganismos: Escherichia y B. cereus.

MATERIALES
Los materiales utilizados durante la práctica fueron:
 Una caja Petri con cultivo de E. Coli.
 Una caja Petri agar selectivo para Bacillus cereus.
 Tubos de ensayo con medios: agar nutritivo, caldo glucosa, caldo arabinosa, caldo
xilosa, urea, lisina/hierro, medio SIM, caldo MRVP (2 tubos), caldo nitrito, caldo
nitrato.
 Caja Petri con divisiones de: leche, agar almidón, agar gelatina.

METODOLOGÍA
1. Caracterización bioquímica de E. coli

Figura 1. Cultivo de E. coli

De la colonia aislada, procedente de agar Mc Conkey de Echerichia coli se

sembraron las en las siguientes pruebas bioquímicas mostradas en la Figura 2:

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 Figura 2. Pruebas bioquímicas (TSI, Citrato de Simons y Lisina
descarboxilasa) para E. coli

 TSI

De una caja Petri con cultivo de E.coli se tomó una muestra con un asa
recta estéril y se realizó una punción en el centro del medio hasta el fondo
del tubo y luego se sembró en superficie por estrías.

 Lisina descarboxilasa

Se tomó de un cultivo de E. coli una muestra con un asa recto estéril y se

sembró por punción en agar inclinado (Lisina/hierro), después se realizó
sembrado por estría nuevamente con el asa estéril y después se tapó. Se
dejo encubar por 48 horas a 37 ºC.

 Citrato de simons

De la caja Petri con cultivo de E. coli se tomó una muestra con el asa
esterilizada y se sembró por estrías en agar inclinado (citrato), se flameó la
boquilla del tubo suavemente y se tapó. Se dejo encubar por 48 horas a 37
ºC.

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 Figura 3. Pruebas bioquímicas (reacción de Vogues Proscaver, reacción
del rojo de etilo, prueba de Indol, urea Christensen) para E. coli

 Urea de Christensen

Se tomó una muestra del cultivo de E. coli y se sembró con un asa estéril
por estría en la superficie de agar de inclinado (Figura 3). Se dejó encubar
por 48 horas a 37 ºC.

 Prueba de indol

Se tomó una muestra de un cultivo de E. coli y se sembró por punción en

un tubo de ensayo con medio SIM. Después de incubar por 48 horas a 37
ºC y después de ese tiempo se adicionó 0.1 mL de reactivo de Kovacs al
medio.

 Reacción del rojo de etilo

Utilizando un asa estéril se tomó una muestra de cultivo E. coli y se

sembró en caldo MRVP. Después de 48 horas de incubación a 37 ºC se
adicionaron 5 gotas de solución de rojo de metilo como indicador de pH
(Figura 3).

 Reacción de Vogues Proscaver

Con un asa estéril se tomó una muestra de cultivo de E. coli y se sembró

en caldo MRVP (Figura 3). Se dejo incubar por 48 horas a 37 ºC. Después
de la incubación se adiciono solución de sulfato de cobre.

2. Caracterización bioquímica de Bacillus cereus

4
 A continuación se muestra el cultivo de B. cereus.

Figura 4. Pruebas bioquímicas (reacción de Vogues Proscaver y Lisina

descarboxilasa) para E. coli

 De la caja Petri con cultivo de B. cereus se sembró con un asa estéril una
muestra en cada uno de los medios (agar almidón, agar gelatina, agar
leche) divididos en una caja Petri.
Después de incubar por 48 horas a 37 ºC se adiciono en agar almidón
solución de lugol y en agar gelatina 5 gotas de cloruro de mercurio al 15%.

En la Figura 5 se muestra inicialmente los medios de agar leche, almidón y

gelatina.

Figura 5. Medios en caja Petri dividida de agar almidón, leche y gelatina.

 Se tomó una muestra de cultivo B. cereus para caldo glucosa, caldo

arabinosa, caldo nitrito y xilosa. Se dejaron incubar por 48 horas a 37 ºC.

A continuación en la Figura 6 se muestran los caldos mencionados

anteriormente antes de sembrar el B. cereus.

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 Figura 6. Caldo glucosa, caldo arabinosa, caldo nitrito y xilosa antes de
realizar la siembra de B. cereus.
RESULTADOS
1. Caracterización química de Echerichia coli

 Pruebas bioquímicas: TSI, lisina descarboxilasa y citrato de simons.

A continuación en la Figura 7 se muestran los resultados de las pruebas de TSI,

citrato de Simons y Lisina descarboxilasa después de encubar por 48 horas a
partir de la siembra de E. coli

Figura 7. Resultados de pruebas bioquímicas de TSI, Citrato de Simons y Lisina

descarboxilasa
Prueba TSI: Positiva para E. coli

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 Lisina descarboxilasa: positiva para E. coli
Citrato de Simons: negativo para E. coli.

 Urea de christensen

A continuación en la figura 8 se presenta el resultado de la prueba de Christensen

para la E. coli.

Figura 8. Resultado de la prueba de Christesen (negativo) para la E.coli

Urea de christensen: negativo para E. coli

Pruebas bioquímicas: de indol, rojo de metilo y Voges Proskaver

A continuación en la figura 9 se presenta el resultado de las tres pruebas antes de
adicionar para la prueba de rojo de metilo el indicador de pH, para la prueba de
indol el reactivo de Kovacs y para la prueba de Voges proskaver la solución de
sulfato de cobre.

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 Figura 9. Resultados después de 48 horas de incubación a 37 ºC de E. coli para
las pruebas bioquímicas de indol, rojo de metilo y Voges Proskaver.

 Prueba de indol

En la figura 10 se muestra el resultado de la prueba de indol para E. coli después

de encubar por 48 horas a 37 ºC.

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 Figura 10. Resultado de prueba de indol para E. coli

Prueba de indol: positiva para E. coli.

 Reacción rojo de metilo

En la Figura 11 se presenta el resultado de la prueba de rojo de etilo después de

pasar por 48 horas de incubación.

Figura 11. Resultado de la prueba de Voges (positiva) Proskaver para E. coli

Reacción de rojo de metilo: positivo para E. coli.

 Prueba de Voges Proskaver

En la Figura 12 se muestra el resultado de la prueba de Voges Proskaver para la

E.coli.

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 Figura 12. Resultado de la prueba de rojo de etilo después de 48 horas de
incubación.

Prueba de Voges Proskaver: negativo para E. coli.

2. Caracterización bioquímica de Bacillus cereus

Agar leche, almidón y gelatina

A continuación en la Figura 13 se muestra el resultado de las pruebas bioquímicas

de B. cereus de agar leche, gelatina y almidón.

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 Figura 13. Formación de colonias de B. cereus en agar almidón, agar leche y agar
gelatina.

Agar leche: positivo para B. cereus

Agar almidón: negativo B. cereus
Agar gelatina: positivo B. cereus

Pruebas bioquímicas en caldo glucosa, arabinosa, xilosa y nitrito

En la Figura 14 se presenta el resultado de las pruebas bioquímicas para B.

cereus en caldo glucosa, arabinosa, xilosa y nitrito.

Figura 14. Formación de colonias de B. cereus en caldo glucosa, arabinosa, xilosa

y nitrito.

Caldo glucosa: negativa para B. cereus. No presentó cambios de color. Hay

existencia de burbujas.
Caldo nitrato: negativo para B. cereus. Después de adicionar el reactivo de Griess,
no hubo cambio de color.
Caldo arabinosa: negativa (no fermentación) para B. cereus. Existencia de
burbujas en el caldo.
Xilosa: Cambio de color a rojo y presencia de burbujas.

RESULTADOS
Caracterización bioquímica para E. coli

 Resultado prueba TSI

El agar TSI (triple azúcar hierro) es utilizado para determinar si un bacilo gram
negativo, en este caso E. coli, utiliza la glucosa, lactosa o sacarosa de forma
fermentativa y forma sulfuro de hidrogeno (H2S).

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 Después del periodo de incubación el fondo del tubo permaneció ácido a causa de
los ácidos orgánicos como resultado de la fermentación de la glucosa en
condiciones anaerobias del fondo del tubo.
Por otra parte la superficie del agar inclinada revierte el estado alcalino rojo a
causa de la oxidación de los productos fermentados (CO2 H2O, formación de
peptonas en el medio y aminas alcalinas) en condiciones aerobias en esta parte
del medio. Si además de la fermentación de la glucosa, se fermenta la lactosa o la
sacarosa, entonces los productos de fermentación formados en el medio,
neutralizan aminas alcalinas, y en exceso hacen virar la parte de medio acido
tomando un color amarillo. De forma contraria no se observa cambio.
El rojo fenol y el sulfato ferroso tienen el papel de indicadores de acidificación y
formación de H2S. El H2S se detecta ya que se crea un anillo negro cerca de la
parte superior del tubo. Sin embargo en el caso de E. coli no se detecto la
presencia de H2S.
Por lo tanto en este punto observando la Figura 5 es posible deducir que la E. coli
fermenta además de la glucosa, la lactosa o la sacarosa. Según el código de
reacciones producidas TSI E. coli es (A/A) = superficie inclinada acida/ capa
profunda acida, y se concluye que la E.coli en la prueba TSI dio negativa al no
producir H2S.[7]

 Lisina descarboxilasa

Al hacer el análisis de la lisina y el hierro se obtuvo que fuera positiva, ya que el

medio pasó de estar de color café a color violeta, junto con un crecimiento
microbiano de E.coli en la superficie.
Este medo de cultivo se utiliza para diferenciar microorganismos teniendo en
cuenta la capacidad para descarboxilar la lisina y sintetizar H2S. Si hubo
producción de este compuesto ya que se produjo un precipitado de color negro en
la superficie, y también se dio lugar a una coloración violeta, lo cual evidencia que
hubo una descarboxilación por parte de la E.coli.[4]

 Citrato de simons

El citrato de Simmons es utilizado para la diferenciación de enterobacterias, ya

que ciertos microorganismos lo usan para producir carbono y energía. En la
prueba se obtuvo que fue negativa ya que la E.coli es una enterobacteria y
además este carece de aminoácidos y es rico en sales de amonio los cuales no
son captados para este microorganismo.[5]

 Prueba de movilidad

En esta prueba se observó un crecimiento a profundidad ya que se formó un

camino de color blanco en forma vertical en el centro del agar, esto confirma que

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 el E.coli es flagelado y que además tiene buena cantidad de mitocondrias, ya que
para la movilidad de un microorganismo se requiere producir gran cantidad de
energía.[6]

 Prueba de indol

El reactivo de Kovacs es un indicador el cual resulta de la combinación entre

alcohol isoamilo, p-dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico concentrado.
Al adicionar el reactivo de Kovacs se obtuvo que la prueba de indol fuera positiva,
es decir que se formó un anillo rojo en la superficie del caldo, esto se debe a que
la E.coli tiene gran capacidad para hidrolizar y desaminar triptófano para la
producción de indol por medio de enzimas triptofanasas[8]

 Urea de christensen

Esta prueba bioquímica se realiza para la determinación de la capacidad de un

microorganismo de producir enzima ureasa, la cual hidroliza la urea. La hidrólisis
genera CO2 y amoniaco el cual alcaliniza el medio. Se identifica el cambio de pH al
pasar de un color anaranjado del medio con pH 6,8 a una coloración rojo fucsia a
pH 8,1.
Para la E.coli no se formo dicha coloración, por lo tanto se concluye que en la
prueba bioquímica de Christensen dio un resultado negativo

 Reacción de rojo de metilo

Mediante la prueba de rojo de metilo se observo un cambio de color en el medio a

rosa. Esto se debe a la aplicación de un indicador de pH (rojo de metilo) ya que
permite el cambio de color del medio en presencia de un pH menor a 4,5. [9]

Lo anterior ocurre debido a que la E. coli positivo en la prueba de rojo de metilo

acidifican el medio por causa de la fermentación acido – mixta de los
carbohidratos.

En conclusión la E. coli en la prueba de rojo de metilo es positiva.

 Prueba de Voges Proskaver

En esta prueba se da una reacción de fermentación butanodiólica que se muestra

a continuación.

Glucosa Acido pirúvico Acetína (acetil metil carbinol) 2,3

butanodiol, diacetilo

La acetoína por reducción forma 2,3 bitanodiol y por oxidación forma diacetilo.

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 Esta prueba muestra la capacidad de un microorganismo (E. coli) de producir un
compuesto llamado diacetilo en presencia de oxigeno atmosférico y álcali, que
genera un compuesto coloreado al añadir la solución de sulfato de cobre.

En conclusión debido a que no se formo una coloración roja como se observa en

la Figura 8 se concluye que la prueba de Voges Proskaver para la E. coli negativa.

Caracterización bioquímica de Bacillus cereus

 Agar leche, almidón y gelatina

Agar almidón
La prueba de hidrólisis de almidón es negativa para B. cereus ya que al adicionar
las 5 gotas de la solución de lugol, no hubo tinción de color azul, la cual indicaría
que hubo reacción.

Agar gelatina
La prueba de agar gelatina en B. cereus es positiva ya que al adicionar 5 gotas de
cloruro de mercurio al 15%, 5 minutos después se observó una zona clara
alrededor de la estría de la colonia.

Agar leche
En el agar leche se observó que la prueba fue positiva debido a la presencia de
una capa clara, la cual indica que se degrado la caseína presente en la leche, esta
clase de bacterias degradan las fosfoproteínas de la caseína, para su nutrición.

El Bacillus cereus tiene una gran capacidad para metabolizar varios tipos de
nutrientes, ya que en la mayoría de las pruebas anteriores se obtuvieron positivas,
esto evidencia que este microorganismo se puede encontrar en casi cualquier
alimento, puede reproducirse y nutrirse con mucha facilidad.[6]

 Caldo glucosa, arabinosa, xilosa y nitrato

Caldo glucosa
No hubo fermentación debido a que no cambio de color, sin embargo si hubo
producción de gas detectada por la existencia de burbujas en el medio.

Caldo arabinosa
No hubo fermentación ya que no se observaron cambios de color en el medio. Se
produjo gases detectado por la existencia de burbujas.

Xilosa
Si hubo fermentación ya que el medio cambio a rojo. Además se produjo gas por
presencia de burbujas.

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 Caldo nitrato
No hubo cambio de color en el medio a rojo, lo cual no reconoce al B. cereus
como reductor de nitratos.

CONCLUSIONES

 La E. coli es fermentadora de glucosa, almidón o sacarosa como se pudo

evidenciar en la reacción de rojo de metilo (acidez por fermentación de
carbohidratos) y la prueba TSI.
 De la caracterización de la E. coli, es posible decir que presenta flagelación y por
otra parte tiene la capacidad de hidrolizar triptófano para la producción de indol.
 El B. cereus presente en diversos alimentos presenta la capacidad de reducir
nitratos y crecen fácilmente en agar almidón, gelatina y leche.

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
[1] TORTORA, G., et al. Introducción a la microbiología. 9 ed Madrid, España :
Editorial Medica Panamericana. 2007. p 293, 294.
[2] GRANADOS, P; VILLAVERDE, C. Microbiología, Vol 1: Bacteriología.
Características y clasificación bacteriana. Virología, Caracterización y técnicas
bioquímicas.1 ed Madrid, España: Ediciones Paraninfo, S.A. 2003. p 294.
[3] Ibíd., p 294
[4] Op cit., Granados, R. p 293
[5] MACFADDIN, J. F. Pruebas bioquímicas para la identificación de Bacterias
de importancia clínica. 2 ed Editorial médica Panamericana. 2003.p
[6] ] Sonnenwirth A. C. Datos sobre enterobacterias procedentes de Differentintion
of Enterobacteriaceae by biochemical tesis. USPHS Center for Disease Control,
Atlanta. 1973.
[7] BILEY; SCOTT. Diagnóstico microbiológico: 12ª edición Editorial panamericana:
Argentina. 2009. p 245
[8] Op cit., GRANADOS. P 129, 133
[9] Ibíd., p 134, 136

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