INTRODUCCIÓN

Una coloración o tinción es una técnica auxiliar utilizada en microscopía con

lafinalidad de mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los
colorantesy tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en Biología y
Medicina pararesaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados
con la ayudade los diferentes tipos de microscopios.Los diferentes colorantes
pueden ser utilizados para aumentar la definición yexaminar grandes cortes de
tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares otejido conectivo), poblaciones
celulares (por ejemplo clasificando diferentes célulassanguíneas) o incluso para
resaltar organelas dentro de células individuales.En el presente informe se
detallarán las experiencias de coloración simple ycompuesta de mucosa bucal;
coloración neutra en sangre y coloración de unacélula vegetal como fue la de tallo
de geranio. Seguidas de una esquematizaciónde resultados obtenidos y discusión
de los mismos y finalizando con lasrespectivas conclusiones y recomendaciones.

Técnicas de tinción. Fundamentos

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que
la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos
pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes
celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso
llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también
puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la
fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el
protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un
portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el
proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción,
por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera
que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha
precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por
los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de
colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes
son moléculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares
cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la
fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los
colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a
menudo para revelar la localización de las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo de
colorante liposoluble es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra
sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente;
un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un constituyente celular y
lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son

suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante
simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan
intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de
bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin
teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de
las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta
china (que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante
negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste
de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de
cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que
pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o
agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones
completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan
artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos
estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Preparación de un frotis
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir
(si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una vez que el hisopo ha
tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede ser empleado para
inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estéril para transferir una pequeña
cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en
una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata
de colonias muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla
delgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciable
del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse
con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias
veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente
que moleste al tacto pero no queme.

Examen de muestras al microscopio

Según la manipulación que efectuemos sobre la muestra a observar y según los colorantes que
empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tinción.

Examen microscópico directo de las muestras

clínicas Sin Tinción

No se utiliza ningún tipo de colorante.

Es el montaje directo húmedo o examen en fresco: las

muestras se extienden directamente sobre la superficie de un
portaobjetos para su observación. El material que es
demasiado espeso para permitir la diferenciación de sus
elementos puede diluirse con igual volumen de solución salina
fisiológica estéril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material.

Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de parásitos intestinales
como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros parásitos, larvas y gusanos
adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc

En la imagen: Candida sp en un examen en fresco.

Examen microscópico de las muestras clínicas levemente modificadas

Tinción Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras

celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul
Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el
KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no
actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.

La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus),

sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece
como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede
agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.

En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta china.

Examen microscópico de las muestras clínicas muy modificadas Tinción

Diferencial

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras

celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes
que fijan de acuerdo con su propia constitución química.

Los ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM o la de Ziehl-

Neelsen

En la imagen: BGN y levaduras en una tinción GRAM

microfotografía: Daniel Val

Examen de muestras al microscopio: la tinción GRAM

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio

bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las
referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se
basan justamente en la tinción de GRAM

Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la

siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta
Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada
durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con
mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20
seg. Lavar y secar.

Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en
1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene
nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfologicos distintos
de bacterias).

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana
sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El
material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la
célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así
como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho
más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la
célula gram-negativa es peptidoglicano.

Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la

pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con algún detalle la tinción de Gram y
las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su funcionamiento.

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal
violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el
exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las grampositivas como las
gramnegativas, están teñidas de azul.

El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente

activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y
forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la
misma situación.

Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla

de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el
complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos
(grampositivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos
dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la
decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho
de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente
lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la
membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es
incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células
grampositivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y
menos lípido), no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra
los poros, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo
cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las
células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras.

Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de
la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas
permanecen azules.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram:

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por sí solo
tiene poca afinidad con las células.

2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células
grampositivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del
tiempo para obtener resultados satisfactorios.

3) Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal
violeta - yodo.

El carácter de grampositivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Algunos organismos

son más grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces
grampositivos y otras gramnegativos.

Morfología ultramicroscópica de las bacterias:

estructuras internas
Pared celular

Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas mucilaginosas, y en
la periferia de una delicada membrana que está en inmediato contacto con el citoplasma, se
encuentra la pared celular, que es una estructura rígida que da forma a la célula. Las paredes
celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales.
Constituyentes importantes de la pared celular son los aminoácidos, aminoazúcares, azúcares y
grasas. Estas sustancias (proteínas, Hidratos de carbono, grasas) están enlazadas formando el
polímero complejo que forma la pared celular.

Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-

negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-
positivas contienen menos aminoácidos que las gram-negativas; el contenido graso es mucho
más elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como
explicación del mecanismo de la reacción al gram (ver las dos imágenes juntas).

Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina)

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos
clases de ácidos teicoicos. Ácido Lipoteicoico que está en
la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y
unido a la membrana citoplásmica. Y ácido teicoico de la
pared que está en la superficie y se une sólo a la capa de
peptidoglicano. El ácido Teicoico es el responsable del
determinante antigénico del organismo.
unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La
membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y
lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la porción de
lípido está embebida en el fosfolípido y el antígeno O
polisacárido está en la superficie. El lípido se llama
Lípido A y es tóxico, pero el lipopolisacárido entero se
llama Endotoxina. La pared de la célula tiene poros
llamado Porines para el transporte de substancias de
peso molecular bajo. Entre la membrana citoplásmica y
la pared celular hay un espacio periplásmico con
enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de
antibióticos y proteínas de transporte.

También existen diferencias en la composición de la pared entre las células de las diversas
especies.

Membrana Citoplásmica (citoplasmática o protoplasmática)

Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o envoltura, que se
denomina membrana citoplásmica o protoplásmica y está formada por una bicapa de fosfolípido
integral y proteínas periféricas empotradas. La membrana citoplásmica tiene una significación
funcional de suma importancia. Se trata de una membrana semipermeable, selectiva, que
controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la célula y la salida de los productos de
desecho. Tiene enzimas respiratorias y durante la división celular el cromosoma se une a la
membrana de la célula en el sitio llamado Mesosoma.

Citoplasma

El material celular contenido dentro de la membrana citoplásmica puede dividirse en tres partes,
región citoplásmica, de apariencia granular, la cual es rica en RNA, región nuclear o cromatínica,
que es rica en DNA, y la parte líquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. El RNA,
combinado con proteínas, forma partículas o corpúsculos macromoleculares, de unos 200 A de
diámetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma. Estas partículas de
RNA-proteína se denominan ribosomas, y son el equivalente en las bacterias de los microsomas,
o partículas que se encuentran en las células animales y vegetales.

Estructuras Citoplasmáticas

Nucleoide (cuerpo cromatínico)

Las células bacterianas no contienen el núcleo característico de las células de las plantas y
animales superiores. Sin embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como
una estructura nuclear, el ADN de la célula bacteriana se encuentra confinado en este espacio,
es único y circular, doble hélice sin proteínas. Como no se trata de un núcleo discreto, se ha
sugerido que se dé a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatínico, nucleoides,
equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. Se demuestra con el método de tinción
de Feulgen, específico para el DNA, y por microscopia electrónica, porque la sustancia nuclear es
menos densa que el citoplasma cincundante.

Ribosomas

Tienen estrecha relación con la síntesis de proteínas (30S y 50S para formar un complejo 70S).

Plásmidos

Lazos extracromosómicos de ADN, algún código para la resistencia a drogas, toxinas y otros
factores.

Endosporas

Algunas bacterias pueden transformarse en pequeños ovoides o esferas, que son formas
celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen
intracelularmente. Todos los organismos de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan,
en parte, por su propiedad de producir esporas. También tienen esta propiedad otros géneros de
bacterias verdaderas, pero sólo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden
crecer y reproducirse en forma de células vegetativas durante muchas generaciones. Sin
embargo, en cierto período del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce,
dentro del citoplasma, la síntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.

Tinción GRAM: Morfología Bacteriana

Ya hemos visto que la tinción de GRAM aporta dos ideas básicas para la deficinión
"taxonómica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tinción y la forma que presentan las
células bacterianas.

En lo relativo a la coloración, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de

microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y de Gram
negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.

Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción GRAM:

Cocos

Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por
pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos
irregulares, a veces de gran tamaño

División a lo largo del mismo plano,

forma División a lo largo de 3 planos
formando cadenas cortas División a lo largo
esféric
de 2 planos
a: se
2 cocos diferentes:
llama 4 - 20 en cadenas: regularmente: irregularmente:
juntos: Tétradas
Coco Estreptococos Sarcinas Estafilococos
Diplococos

Bacilos

grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

 Empalizadas, Bacilos
Forma de vara: Dos bacilos juntos: Cadenas de bacilos:
lado con lado o en
se llaman Bacilos Diplobacilos Estreptobacilos
figuras en X, V o Y

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Forma espiral rígida se Si la espiral es flexible y ondulada se

llama: Espirilo llama: Espiroqueta

Utilizamos el término Pleomorfismo para referirnos a la adopción de diferentes formas en una

misma especie.

Tinción GRAM: Bacterias Gram-Positivas

Cocos Gram-positivos

Racimos: forma típica de Staphylococcus sp,

como S. aureus

Cadenas: forma típica de Streptococcus sp,

como S. pneumoniae, Streptococcus grupo B
Tetradas: forma típica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos

Gruesos: forma típica de Clostridium sp, como C.

perfringens, C. septicum

Finos: forma típica de Listeria sp

Ramificados: forma típica

de Actinomycetes y Nocardia, como A.
israelii
gráficos obtenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

Tinción GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Cocos Gram-negativos

Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N.

meningitidis

También Moraxella sp y Acinetobacter

sp aparecen con morfología de diplococos.

Acinetobacter puede ser pleomórfico, y a veces

aparece como coco Gram-positivo.

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp,

que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo, y,
a menudo, Gram-variable.

Bacilos Gram-negativos

Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae,

como E. Coli
Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp,
como H. influenzae

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V.

cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni

Forma de aguja fina: forma usual

de Fusobacterium sp

Otras tinciones de uso habitual

RODAMINA-AURAMINA

Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los
fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de
color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio,
empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-
alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser
reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el
fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos
pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la
diferenciación morfológica.

NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o

desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia
puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado
como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si
está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen
viable se inactivará poco tiempo después de la tinción.

El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido
ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción
de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la
detección inicial de hemocultivos positivos.

ZIEHL-NEELSEN (BAAR)

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos)
de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se
denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y
los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-
alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el
colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Se ha desarrollado una coloración de ácido-alcohol resistencia modificada que diferencia las

especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen
ácidos-grasos de unos 50 átomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no
ácido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla ácido-alcohol estándar
pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se
denominan ácido-alcohol resistentes parciales o débiles.

El frotis se tiñe durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua.
Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60
seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar

BLANCO DE CALCOFLÚOR
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando
considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Según fue descrito por Hageage
y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los
materiales clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos
morfológicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoríos ha suplantado al azul
de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde
manzana, según la fuente luminosa que se utilice.

TINCIÓN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)

Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen
en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones
ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones,
compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso
de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es
favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar
perdura durante años. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el
hombre, por lo que su estudio y observación son de enorme interés.

FUNDAMENTO
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el
microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.
La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.
 2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua,
y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

REALIZACIÓN
Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan
las esporas. Esta tinción es delicada en su realización y para poder obtener unos resultados
satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.
1. Preparar los frotis
bacterianos indicados.
2. Teñir con verde
malaquita. Con unas pinzas de madera
colocar la muestra encima de la llama
del mechero de forma que el colorante
humee durante 5 min.
Nota: evitar que la muestra
hierva. Añadir más colorante si éste se
evapora; es importante que la muestra
no se seque.
3. Lavar con abundante
agua el exceso de colorante.
4. Teñir con safranina 1
min.
5. Lavar con abundante
agua el exceso de colorante.
6. Secar la preparación.
7. Observar la
preparación al microscopio. Anotar la
disposición y la morfología de las tres
especies del género Bacillus.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un
carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género.
Las tres bacterias empleadas en esta práctica difieren en la disposición
y morfología de las endosporas. B. sphaericus posee una endospora
esférica con localización terminal y deformante de la célula vegetativa,
por lo que suele ser denominada "en palillo de tambor". B.
thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la
célula vegetativa, lo que provoca un abombamiento característico
denominado "en huso". B. subtilis forma una espora cilíndrica subterminal
no deformante.
 Tinción

Un espécimen histológico teñido, colocado entre portaobjetos y cubreobjetos, montado sobre

la platinade un microscopio óptico.

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el
contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que
usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos
que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes
colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de
tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por
ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso para resaltar organelas dentro
de células individuales.
En bioquímica, esto implica agregar un colorante específico (esto significa que se una de
manera selectiva ya sea a ADN, proteínas, lípidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para
cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Tanto la tinción como
el marcado fluorescente pueden servir para los mismos propósitos.
Diferentes tipos de tinciones biológicas son utilizadas también para marcar células
en citometría de flujo y para marcar proteínas ó ácidos nucleicos en electroforesis en gel.
Las tinciones no están limitadas a su uso en materiales biológicos, también pueden ser
utilizadas para estudiar la morfología de otros materiales (por ejemplo, las estructuras
lamelares de polímeros semicristalinos de las estructuras de dominio de bloques
de copolímeros).

Índice
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 1Tinción in vivo e in vitro

o 1.1Métodos de tinción in vitro
 1.1.1Preparación
 1.1.2Tinción adecuada
o 1.2Tinción directa
o 1.3Tinción indirecta
 2Afinidad de diferentes tejidos por diferentes colorantes
o 2.1Tinción negativa
 3Colorantes
 4Colorantes histológicos más comunes
o 4.1Azul brillante de Coomassie
o 4.2Azul de metileno
o 4.3Azul Nilo
o 4.4Bismarck brown
o 4.5Bromuro de etidio
o 4.6Carmín
o 4.7Cristal violeta
o 4.8DAPI
o 4.9Eosina
o 4.10Fucsina ácida
o 4.11Hematoxilina
o 4.12Hoechst
o 4.13Lugol
o 4.14Naranja de acridina
o 4.15Plata
o 4.16Rodamina
o 4.17Rojo neutro
o 4.18Rojo Nilo
o 4.19Safranina
o 4.20Sudan
o 4.21Tetróxido de osmio
o 4.22Verde de metilo
o 4.23Verde malaquita
 5En microscopía electrónica
o 5.1Ácido fosfotúngstico
o 5.2Tetróxido de osmio
o 5.3Tetróxido de rutenio
o 5.4Otros
 6Algunas de las tinciones más comunes
 7Referencias
 8Bibliografía
 9Enlaces externos

Tinción in vivo e in vitro[editar]

Una tinción in vivo (tinción vital) es el proceso de teñir tejidos vivos. Al provocar que
determinadas células o estructuras adquieran los colores de contraste, se puede estudiar su
ubicación y morfología mientras están desempeñando su función. El propósito más común es
revelar detalles de la citoestructura que de otra manera no resultarían evidentes, sin embargo,
la tinción vital puede revelar además donde aparece un determinado producto químico o
donde se lleva a cabo una determinada reacción química dentro de las células o tejidos.
A menudo estas tinciones son llamadas tinciones vitales. Se introducen en el organismo
mientras las células aún se encuentran vivas. Para conseguir el efecto deseado, el colorante
usualmente se utiliza en soluciones muy diluidas que van entre 1:5.000 a 1:50.000. A pesar de
esto las tinciones son eventualmente tóxicas para los organismos, algunas más que otras.
Una tinción in vitro o "supravital" involucra el coloreo de células o estructuras que han sido
removidas de su contexto biológico. Se utiliza a menudo una combinación de varios colorantes
para revelar más detalles y características de las que se obtendrían con la utilización de uno
solo. Combinados con protocolos específicos de fijación y de preparación de muestras, los
científicos y profesionales de la salud pueden utilizar estas técnicas estandarizadas como una
herramienta diagnóstica repetible y consistente. Una contratinción es una tinción que consigue
que las células o estructuras sean más visibles, cuando no se consigue que sean totalmente
visibles con la tinción principal.
Por ejemplo, el cristal violeta tiñe únicamente a las bacterias Gram positivas en la tinción de
Gram. Se utiliza una contratinción de safranina (que colorea todas las células), para permitir
también la identificación de bacterias Gram negativas.
Es de notar que muchas tinciones pueden ser utilizadas tanto en células vivas como en
células fijadas.
Métodos de tinción in vitro[editar]
Preparación[editar]
Las etapas preparatorias involucradas en una tinción van a depender del tipo de análisis
planeado; bajo estas premisas se puede considerar que algunos o todos de los siguientes
pasos podrían requerirse.

 Fijación: de por si, esta etapa puede consistir en varios pasos. La fijación es una
modificación de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas que forman una célula o
tejido y que tiene por finalidad preservar las formas de las células o tejidos tanto como sea
posible. A veces se puede utilizar una fijación por calor para matar, adherir y alterar un
espécimen de modo que acepte la tinción. La mayor parte de las veces se utiliza un fijador
químico. Los fijadores químicos en general causan la formación de enlaces cruzados entre
proteínas, o entre proteínas y otras sustancias presentes en la muestra, incrementando su
resistencia mecánica. Entre los fijadores químicos más comunes se encuentran
el formaldehído, etanol, metanol, y/o el ácido pícrico. Pequeños bloques de tejido pueden
ser embebidos en parafina o algún polímero, proceso conocido como inclusión, para
incrementar su resistencia y estabilidad, y para hacer más fácil cortarlos en rodajas
extremadamente delgadas, ya que cuanto más delgado es un corte histológico, más
definición se obtiene en las imágenes microscópicas.

 Permeabilización este paso implica el tratamiento de las células con

un surfactante suave. Este tipo de tratamiento tiene como finalidad disolver la membrana
celular para permitir que las grandes moléculas de colorante puedan acceder a las
estructuras del interior de las células.

 Montaje frecuentemente implica adherir los cortes histológicos a un portaobjetos de vidrio

para su observación al microscopio o análisis. En algunos casos, se puede cultivar a las
células directamente sobre le portaobjetos. En muestras de células sueltas, como las que
se presentan en un extendido de sangre o de fluidos biológicos, la muestra puede ser
aplicada directamente sobre el portaobjetos. Para piezas de tejido de mayor tamaño, se
utiliza un micrótomo que corta la muestra en rodajas sumamente delgadas. Estas rodajas
son luego adheridas al portaobjetos por medio de una substancia que funciona como
pegamento, ya sea una resina transparente, gelatina o clara de huevo. El montaje tiene
por finalidad aumentar la resistencia mecánica de una muestra que de otra manera sería
extremadamente frágil, para que soporte el proceso de teñido conservando lo más posible
su estructura original.
Tinción adecuada[editar]
En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la
muestra (antes o después de la fijación y el montaje) en la solución colorante, seguido del
aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante y la observación. Muchos
tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente, esto es, un compuesto químico que
reacciona con el colorante para formar un precipitado coloreado insoluble. Cuando la solución
de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tinción mordentada permanece.
La mayoría de los colorantes utilizados en microscopía se encuentran disponibles
como colorantes certificados. Esto significa que los colorantes ofrecidos por el fabricante
han sido evaluados por un organismo independiente, la Biological Stain Commission, y que
este organismo ha determinado que el producto ofrecido cumple o excede ciertos estándares
de pureza, concentración de sustancia colorante y desempeño en las técnicas de tinción
empleadas. Estos estándares son publicados detalladamente en la revista Biotechnic &
Histochemistry.1 Muchos colorantes presentan una composición diferente entre diferentes
fabricantes. La utilización de colorantes certificados elimina una fuente de resultados
inesperados.2
Tinción directa[editar]
Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin
otro tratamiento previo.
Tinción indirecta[editar]
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente
habitual es el ácido tánico.3

Afinidad de diferentes tejidos por diferentes colorantes[editar]

Cuando un tejido u estructura subcelular presenta una afinidad por un determinado colorante
se suele designar por los sufijos -filo o -fílico. Por ejemplo, los tejidos que se tiñen
con azure suelen ser nombrados como azurófilos o azurofílicos. También puede ser utilizado
para designar propiedades tintoriales más generalizadas, por ejemplo los tejidos que se tiñen
con colorantes de naturaleza ácida (por ejemplo la eosina) suelen ser denominados
como acidofílicos, basofílicos cuando se tiñen con colorantes de naturaleza básica (tales como
por ejemplo el azul de metileno o la hematoxilina), y anfifílicos cuando aceptan ambos
colorantes.4 Por el contrario, los tejidos cromófobos no toman colorante con facilidad.
Tinción negativa[editar]
Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro caso de cromofobia y
que por lo tanto funciona aún cuando los métodos de tinción positiva fallan, es la tinción
negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos
y aplicando directamente sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la
muestra humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser
observados fácilmente por medio de microscopía en campo claro como inclusiones claras muy
bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea.5 Adicionalmente, la tinción negativa
es una técnica suave que no destruye a los microorganismos, permitiendo por lo tanto un
recultivo posterior para el estudio de patógenos.

Colorantes[editar]
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica
por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.
Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son
sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos
de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de
grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán. Si se desea simplemente
incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos
simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las
células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los
detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras
naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

Colorantes histológicos más comunes[editar]

Los diferentes colorantes reaccionan o se concentran en diferentes partes de las células o
tejidos, y estas propiedades son utilizadas como una ventaja para revelar partes o áreas
específicas. Algunos de los colorantes biológicos más comunes se listan más abajo. A menos
que se indique lo contrario la mayoría de estos colorantes se utilizan con células y tejidos
fijados. Las tinciones vitales (que pueden ser utilizadas con organismos vivos) se encuentran
destacadas.
Azul brillante de Coomassie[editar]
Azul de Coomassie (también conocido como Coomassie blue) es un colorante que tiñe en
forma no específica a todas las proteínas con un fuerte color azul. Se utiliza frecuentemente
para teñir las corridas de proteínas en las electroforesis en gel.
Azul de metileno[editar]
El azul de metileno se utiliza para teñir células de animales, para hacer más visibles sus
núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser utilizados en
citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos.
Azul Nilo[editar]
El Nile Blue o Nile blue A, es decir, azul Nilo, tiñe los núcleos de color azul. También puede
ser utilizado para teñir células vivas.
Bismarck brown[editar]
Bismarck brown (Marrón Bismarck, también conocido como Bismarck brown Y o Manchester
brown) imparte un color amarillo a las mucinas ácidas. Se puede utilizar con células vivas.
Bromuro de etidio[editar]
El bromuro de etidio (BE) se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja fluorescente.
A pesar de que no es capaz de teñir células vivas ya que no atraviesa las membranas
intactas, puede ser utilizado para identificar células que se encuentran en las etapas finales de
la apoptosis, ya que tales células poseen unas membranas mucho más permeables. Por el
mismo motivo, el bromuro de etidio es utilizado como un marcador de apoptosis en
poblaciones celulares y para localizar las bandas de ADN en una corrida en electroforesis en
gel. Este colorante puede ser utilizado en combinación con naranja de acridina (NA) en el
conteo de células viables. Esta tinción combinada BE/NA le otorga a las células vivas un color
verde fluorescente mientras que las células apoptóticas aparecen con la distintiva
fluorescencia rojo-naranja.
Carmín[editar]
El carmín es un colorante de un intenso color rojo que puede ser utilizado como sal
de litio para teñir glicógeno, mientras que las sales de alumbre-carmín son colorantes que se
adhieren al núcleo. Las tinciones con carmín requieren del uso de un mordiente, que
usualmente es aluminio o alumbre.
Cristal violeta[editar]
El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe las paredes celulares de
color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloración de Gram.
DAPI[editar]
El DAPI es un colorante nuclear (tiñe el núcleo) fosforescente, se excita con luz ultravioleta
para producir una fuerte fluorescencia azul cuando se encuentra unido al ADN. El DAPI se une
a las regiones de alta repetición A=T en los cromosomas. Además no es visible cuando se
utiliza con un microscopio de transmisión corriente. Puede ser utilizado en células vivas o
fijadas. La técnica de tinción con DAPI es especialmente adecuada para el recuento celular.6
Eosina[editar]
La eosina se utiliza más frecuentemente como contracoloración de la hematoxilina,
impartiendo un color que va del rosado al rojo al material citoplasmático, membrana celular, y
algunas estructuras extracelulares. Además imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La
eosina puede ser utilizada también en algunas variantes de la coloración de Gram, y en
muchos otros protocolos de tinción. De hecho existen dos compuestos muy estrechamente
relacionados (aunque no iguales) conocidos como eosina. El más frecuentemente utilizado es
la eosina Y (también conocida como eosina amarillenta) ya que posee una tonalidad
amarillenta muy suave. El otro compuesto conocido como eosina es la eosina B, también
conocida como eosina azulada o rojo imperial, la cual posee una suave tonalidad azul. Los
dos colorantes son intercambiables, y el la utilización de uno u otro es más una cuestión de
preferencia y tradición.
Fucsina ácida[editar]
La fucsina ácida puede ser utilizada para colorear colágeno, músculo liso o mitocondrias.
Forma parte de la coloración tricrómica de Mallory donde se utiliza para colorear núcleo y
citoplasma. En la tinción de Van Gieson (picrofucsina), la fucsina es la responsable de dar el
color rojo a las fibras de colágeno. También es una coloración tradicional para colorear
mitocondrias (método de Altmann).
Hematoxilina[editar]
La hematoxilina es un colorante nuclear. Utilizado con un mordiente, la hematoxilina tiñe los
núcleos celulares de color azul violeta a negro. Con gran frecuencia se utiliza en combinación
con eosina en la coloración H&E (hematoxilina y eosina), una de las más comunes utilizadas
en histología.
Hoechst[editar]
Hoechst es un compuesto derivado bis-benzimidazol que se une al surco menor del ADN. Se
utiliza con frecuencia en microscopía de fluorescencia para colorear el ADN. Hoechst tiene
color amarillo cuando se encuentra disuelto en agua, y emite luz azul cuando recibe luz
ultravioleta. Hay dos tipos principales de colorantes Hoechst. Hoechst 33258 y Hoechst 33342.
Ambos compuestos son funcionalmente similares, aunque poseen pequeñas diferencias en su
estructura. El Hoechst 33258 contiene un hidroxilo terminal, y por lo tanto es más soluble en
solventes acuosos, aunque esta característica disminuye su habilidad para penetrar la
membrana plasmática. El Hoechst 33342 contiene un grupo etilo en sustitución del
grupo hidroxilo terminal (un grupo etileter), lo que lo hace más hidrofóbico, y con mejor
penetración en la membrana plasmática.
Lugol[editar]
El yodo se utiliza en química analítica como indicador para el almidón. Cuando se mezcla
almidón con una solución de yodo, se desarrolla un color intensamente azul, representando la
formación del complejo de inclusión yodo/almidón. El almidón es una sustancia muy común en
la mayor parte de las células vegetales, de modo que una solución diluida de yodo puede
colorear el almidón presente en las células. El yodo también es componente de la coloración
de Gram utilizada en microbiología. La solución de Lugol o Lugol yoduro (IKI) es una solución
de color marrón que se torna negra en presencia de almidones y puede ser utilizada para
colorear células, haciendo más visible el núcleo. En la coloración de gram el yoduro se utiliza
como mordiente, aumentando la capacidad del colorante para entrar en las células a través de
los poros presentes en la membrana o pared celular.
Naranja de acridina[editar]
El naranja de acridina es un colorante fluorescente, catiónico y selectivo para ácidos nucleicos
útil para demostraciones sobre el ciclo celular. Es capaz de atravesar la membrana celular e
interactúa con el ADN y el ARN por intercalación o interacciones electrostáticas. Cuando se
une al ADN presenta un espectro muy similar al de la fluoresceína. Al igual que la
fluoresceína, se puede utilizar también como una tinción inespecífica para dar un trasfondo
fluorescente (contraste) a tinciones convencionales en la superficie de muestras sólidas de
tejidos (coloración de contraste fluorescente).7
Plata[editar]
Una tinción argéntica es el uso de plata para colorear preparados histológicos. Este tipo de
coloración es especialmente importante para demostrar proteínas (por ejemplo el colágeno
tipo III) y ADN. Se utiliza para facilitar la visualización de ambas sustancias tanto dentro como
fuera de las células. También se utiliza la tinción argéntica en la electroforesis en gel en
gradiente de temperatura.
Algunas células argentafines reducen las soluciones de plata a plata metálica, luego de la
fijación con formalina. Este método fue descubierto por el fisiólogo italiano Camillo Golgi,
utilizando una reacción entre el nitrato de plata y el dicromato de potasio, para precipitar
cromato de plata en algunas células (método de Golgi).
Otras células son argirofílicas: sólo reducen la plata a su forma metálica, luego de ser
expuestas a una tinción que contiene un agente reductor como la hidroxiquinona o formalina.
Rodamina[editar]
La rodamina es una tinción fluorescente específica para proteínas utilizada comúnmente
en microscopía fluorescente.
Rojo neutro[editar]
El rojo neutro (toluylene red) colorea de rojo a la substancia de Nissl. Con frecuencia se utiliza
como contracoloración en otras técnicas de tinción.
Rojo Nilo[editar]
El Rojo Nilo (también conocido como oxazona del azul nilo) se produce hirviendo el Azul Nilo
con ácido sulfúrico. Este tratamiento produce una mezcla de Rojo y Azul Nilo. El Rojo Nilo es
una coloración lipofílica, y se acumula en los glóbulos lipídicos en el interior de las células, y
los colorea de rojo. El Rojo Nilo puede utilizarse con células vivas. Fluoresce fuertemente
cuando se encuentra particionado en lípidos, pero prácticamente no presenta fluorescencia en
soluciones acuosas.
Safranina[editar]
La safranina (o safranina O) es un colorante nuclear. Colorea los núcleos celulares de rojo, y
se utiliza principalmente como contracoloración. También puede ser utilizada para darle una
coloración amarilla al colágeno.
Sudan[editar]
La coloración de Sudán se utiliza para destacar sustancias "sudanofílicas", por lo común,
lípidos. También se utiliza para determinar los niveles de grasa en materia fecal para
diagnosticar esteatorrea. Hay varios colorantes de la familia sudan, por ejemplo: Sudan
III, Sudan IV, Oil Red O, y Sudan Black B.
Tetróxido de osmio[editar]
El tetróxido de osmio se utiliza en microscopía óptica para colorear lípidos. Se disuelve con
facilidad en las grasas y se reduce a osmio metálico al interactuar con material orgánico,
dejando un color marrón o negro característico.
Verde de metilo[editar]
El verde de metilo se utiliza frecuentemente en microscopia de campo claro, para teñir la
cromatina de las células y facilitar así su visualización.
Verde malaquita[editar]
El verde malaquita (conocido también como diamond green B o victoria green B) puede ser
utilizado como contracoloración azul-verdosa en combinación con la safranina un ejemplo es
la coloración de Giménez para bacterias. También se puede utilizar directamente para
colorear endosporas.

En microscopía electrónica[editar]
Al igual que en la microscopía óptica, se puede hacer uso de sustancias que aumentan el
contraste en la microscopía de transmisión electrónica. Por lo general se utilizan sustancias
electrondensas, o metales pesados.
Ácido fosfotúngstico[editar]
El ácido fosfotúngstico es un colorante negativo común utilizado para
resaltar virus, nervios, polisacáridos, y otros tejidos y materiales biológicos.
Tetróxido de osmio[editar]
El tetróxido de osmio se utiliza en microscopía óptica para teñir lípidos. Se disuelve en grasas
y se reduce por la presencia de materiales orgánicos a osmio metálico, dejando un residuo
negro fácilmente visible. Debido a que es un metal pesado, que absorbe los electrones, es
quizá la coloración más común para resaltar morfologías en la microscopía electrónica.
También se utiliza para la tinción de varios polímeros para el estudio de los mismos por TEM.
El OsO4 es muy volátil y extremadamente tóxico. Es un agente oxidante fuerte, ya que en él el
osmio tiene un estado de oxidación +8. Oxida agresivamente muchos materiales, dejando un
depósito de osmio no volátil en un estado de oxidación bajo.
Tetróxido de rutenio[editar]
El tetróxido de rutenio es igualmente volátil e incluso más agresivo que el tetróxido de osmio,
lo que permite colorear materiales que se resisten a la coloración con osmio. Por ejemplo el
polietileno.
Otros[editar]
Otros compuestos químicos utilizados en microscopía electrónica: molibdato de
amonio, yoduro de cadmio, carbohidrázida, cloruro férrico, hexamina tricloruro de indio, nitrato
de lantano, acetato de plomo (II), citrato de plomo, nitrato de plomo (II), ácido peryódico, ácido
fosfomolíbdico, ferricianuro de potasio, ferrocianuro de potasio, rojo de rutenio, nitrato de
plata, proteinato de plata, cloroaurato de sodio, nitrato de talio, tiosemicarbázida, acetato de
uranilo, nitrato de uranilo y sulfato de vanadilo.8

Algunas de las tinciones más comunes[editar]

Nota: Esta lista incluye solo algunas de las tinciones más comunes, y no es ni con mucho
completa.

Tinción Tipo Características Uso Ejemplo

Tiñe núcleos, ácidos

nucleicos y
Básica / estructuras Tinción histológica
Hematoxilina
Acidofílica basofílicas general
(mitocondrias y
ribosomas) en azul.

Tiñe proteínas y
estructuras con
Ácida / Tinción histológica
Eosina afinidad por los
Basofílica general
ácidos en diferentes
tonos de rojo

 Los núcleos
aparecen en
azul
(hematoxilina).
Tinción  Los ácidos Tinción histológica
Bicomponente
hematoxilina- nucleicos general
Anfifílica
eosina asociados a
proteína (ej.
ribosomas) en
violeta
 Fibra muscular
 en rojo
 Tejido conectivo
en rosado

Similar a la tinción
Tinción
H&E con colores más Tinción histológica
hemalumbre-
marcados y general
eosina
definidos

 Los núcleos
aparecen en
azul
(hematoxilina).
 La elastina
aparece en
Tinción HOPS negro (orceína).
 Fibra muscular
en rojo (filoxina)
 Tejido conectivo
(colágeno) en
amarillo
(safranina)
 Los núcleos
aparecen en
azul
(hematoxilina).
Tinción HPS Policromática  Fibra muscular
en rojo (filoxina)
 Tejido conectivo
(colágeno) en
amarillo
(safranina)
Permite ver la
cromatina con Se utiliza para diferenciar
células en muestras de
mucha claridad.
secreciones biológicas
 Los núcleos (esputo, LCR, orina, etc.)
Tinción de aparecen de y en raspados y biopsias.
Papanicolau color entre azul Permite distinguir con
y negro. relativa facilidad células
 Células con alto con transformaciones
contenido de neoplásicas, levaduras y
queratina en
bacterias.
amarillo
 Glucógeno en
 amarillo
 Células
superficiales de
naranja a
rosado
 Células
intermedias y
parabasales
entre turquesa y
azul
 Las células
metaplásicas
muestran
coloraciones
mezcladas (por
ejemplo, verde
y rosa).

Tinción de
Extendidos sanguíneos
Romanowsky

Tinción de
Wright
Pancromática
de
Romanowsky

Tinción de
Giemsa

Tinción de
Jenner
Tinción de
Leishman

Tinción de Field

Tinción de May
Grünwald

Tinción de May
Grünwald-
Giemsa

Tiñe de azul oscuro

Diagnóstico de anemias
restos de ácidos
Tinción con regenerativas
Supravital nucleicos, y los
azul de
proteoglicanos Demostración de
metileno metacromática
ácidos en varios estructuras
tonos de violeta. metacromáticas

Tiñe los depósitos de

Diagnóstico de
Tinción con hemosiderina y
hemopoyesis ineficaz,
azul de prusia hierro de color azul-
y hemocromatosis
celeste

 Los núcleos
aparecen en
marrón o negro.
 Keratina y
Tinción
músculo en rojo
tricrómica de Tricrómica
 Los citoplasmas
Masson aparecen en
tonos de rosa.
 El colágeno y el
hueso, en azul o
verde.
Tinción
Símil tricrómica de
tricrómica de
Masson
Lillie

Símil tricrómica de
Masson. Los
citoplasmas
Tinción
aparecen en tonos
tricrómica
de rojo más
AZAN de
profundos y el
Heidenhan
conectivo en tonos
más intensos de
azul.

Tinción
Símil tricrómica de
tricrómica de
Masson
Mallory

 Los núcleos
celulares
aparecen en
colores de
marrón a negro.
Tinción de Van
 Colágeno (tejido
Gieson conectivo
fibroso): color
rosa o rojo.
 Músculo y
citoplasma:
color amarillo.
 Negro =
núcleos, fibras
elásticas
 Amarillo =
Tinción de
colágeno, fibras
Movat reticulares
 Azul = sustancia
basal, mucina
 Rojo brillante =
fibrina
  Rojo = músculo
Tinción
Tricrómica
tricrómica de
Argéntica
Gömöri

Tinción de
Warthin-Starry

Tiñe de tonos de
Tinción de Von marrón y negro los
Kossa depósitos de fosfato
inorgánico en hueso.

Tinción de
Golgi Argéntica

Tinción de
Bielchowsky

Tinción de
Jones

Tinciones para microbiología

Tinción de
Gram

Tinción de
Ziehl-Neelsen
Tinción de Tiñe endosporas de
Sirve para diferenciar
Schaeffer- verde y bacterias en
endosporas y bacterias.
Fulton rojo

Tiñe endosporas de
Tinción de verde, similar a la
Conklin tinción de Schaeffer-
Fulton.

Detección de
Tinción de
microorganismos, en
Grocott
especial fúngicos.

Búsqueda de
Tinción de microorganismos (por
Dieterle ejemplo, Treponema
pallidum)

Es muy utilizada en
microscopía electrónica.
Tiñe el exterior, pero
Tinción En microscopía óptica,
no el interior de
negativa para identificar
células y estructuras.
microorganismos
encapsulados.

Sirve para diferenciar

Tiñe las paredes bacterias con pared de
Tinción con celulares de polisacáridos de otras
mucicarmina polisacáridos de un que no (por ejemplo,
intenso color rojo. los Cryptococcus son
mucicarmina +).

Tinciones para organelos

 Produce colores
púrpuras y violetas
Tinción
en presencia de
metacromática
mucopolisacáridos
ácidos sulfatados.

Tinciones para fibras

Tiñe fibras elásticas

Tinción de
en tonos de azul y
Weigert
violeta.

Tiñe fibras elásticas

Tinción con
en tonos de marrón
orceína
y negro.

Tinciones para carbohidratos

Tiñe carbohidratos y
proteínas
Tinción PAS
glicosiladas de color
rojo magenta.

Tiñe el almidón de
Tinción con azul, el glucógeno de
Lugol amarillo y el resto en
tonos de ocre.

Tinción con Tiñe el glicógeno de

carmín intenso color rojo.

Tinciones para proteínas

 En función del fijado,
tiñe proteínas y
Tinción
ácidos nucleicos en
argéntica
tonos de negro y
marrón.

Se utiliza con
Tiñe el amiloide de
Tinción con hematoxilina/eosina en
un intenso color
Rojo Congo patología cuando se
rojo.
busca amiloide.

Tiñe
Tinción con
mucopolisacáridos
Alcian Blue
ácidos de color azul.

Tiñe
Tinción con
inespecíficamente
Azul de
proteínas de color
Coomassie
azul.

Tinciones para ácidos nucleicos

Tiñe el ADN y los

Tinción de
cromosomas de
Feulgen
color rojo-violeta.

Tiñe ADN y
cromosomas de
Naranja de color verde
acridina fluorescente, ARN y
ribosomas en color
rojo fluorescente.
 Tiñe ADN de color
DAPI azul-celeste
fluorescente.

Bromuro de
etidio

Tinciones para lípidos

Tinción con Tiñe la mielina de

Luxol Fast Blue color azul-celeste.

Técnica de la Tiñe fosfolípidos y

Hematina ácida nucleoproteínas de
de Baker color azul negro.

Tinción con Oil Tiñe lípidos neutros

Red O de color rojo intenso

Tiñe gotas de lípidos

Tinción con
neutros de color
Sudan Black B Sudán
negro azulado.
lipofílica

Tinción con
Sudan II

Tinción con Tiñe lípidos neutros

Sudan III de color rojo.

Tinción con
Sudan IV

Referencias[editar]
1. Volver arriba↑ Penney, D. P., Powers, J. M., Frank, M., Churukian, C. (2002) «Analysis and
testing of Biological Stains - the Biological Stain Commission
Procedures.» Biotechnic & Histochemistry 77: 237-275.
2. Volver arriba↑ Horobin, R. W., Kiernan JA (2002) Conn's Biological Stains. A Handbook of Dyes
Stains and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine. 10th ed. Oxford: BIOS. ISBN 1-
85996-099-5
3. Volver arriba↑ [1]
4. Volver arriba↑ thefreedictionary.com > amphophilic Citing: Saunders Comprehensive Veterinary
Dictionary, 3 ed. 2007 Elsevier, Inc.
5. Volver arriba↑ Clark, G. (1981) Staining Procedures, 4th ed. p. 412. Baltimore: Williams &
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6. Volver arriba↑ Levenfus, I.: An efficient method for counting DAPI-stained cells using Fiji. Grin:
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7. Volver arriba↑ Wells, J. (1988). «A Technique for Staining the Superficial Cells of Plucked Hair
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8. Volver arriba↑ [2]

Bibliografía[editar]
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 Bancroft, J. D., Gamble, M. eds. (2002). Theory and Practice of Histological Techniques.
5th ed. London: Churchill-Livingstone. ISBN 0443064350.
 Horobin, R. W., Kiernan, J. A. eds. (2002). Conn's Biological Stains. 10th ed. Oxford:
BIOS. ISBN 1859960995.
 Kiernan, J. A. (2008). Histological and Histochemical Methods. Theory and Practice.
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 Presnell, J. K., Schreibman MP (1997). Humason's Animal tissue Techniques. 5th ed.
Baltimore: Johns Hopkins University Press.
 Ruzin, S. E. (1999). Plant Microtechnique and Microscopy. New York: Oxford University
Press. ISBN 0195089561

Enlaces externos[editar]

 Wikimedia Commons alberga una categoría multimedia sobre Tinción.

 StainsFile referencia para colorantes y métodos de tinción (en inglés)

 Tinciones supravitales para protozoos y Técnicas de Montaje Temporarias ~ Howey, 2000
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