DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS ESTRUCTURALES Y LIGNINA

EN BIOMASA

Procedimiento Analítico de Laboratorio (LAP)

NREL/TP-510-42618 (Junio-2010)

1. Introducción.

1.1. Los carbohidratos y la lignina conforman la mayor parte de las muestras de

biomasa. Estos constituyentes deben ser medidos como parte de un análisis
comprensivo de biomasa, los carbohidratos pueden ser estructurales o no
estructurales. Los carbohidratos estructurales están ligados en la matriz de la
biomasa, mientras que los carbohidratos no estructurales pueden ser removidos
utilizando ya sea extracción o por secuencia de lavado. La lignina es un
polímero complejo fenolico.

1.2. Partes de este procedimiento son substancialmente similar a los de ASTM

E1758-01 “Método estándar para la determinación de carbohidratos por HPLC”.

1.3. Este procedimiento es adecuado para las muestras que no contengan

extractivos. Este procedimiento usa una hidrólisis acida en dos etapas para
fraccionar la biomasa en formas que son más fácilmente cuantificables. La
lignina se fracciona en el material acido insoluble y en el material acido soluble.
EL material acido insoluble puede también incluirá la ceniza y proteína, el cual
debe ser tomado en cuanta durante el análisis gravimétrico. La lignina soluble
en acido se mide por espectroscopia de UV-Vis. Durante la hidrólisis los
carbohidratos poliméricos son hidrolizados en sus formas monomerica, la
cuales son solubles en el liquido de hidrólisis. Estas son entonces medidas por
HPLC. La proteínas también pueden partirse dentro de la fracción liquida. Una
medida del contenido de acetilo es necesaria para biomasa que contiene
hemicelulosa con un carácter de xilan, pero no de biomasa que contenga un
carácter de manan. El acetato se mide por HPLC.

2. Alcance.

2.1. Este procedimiento es apropiado para extractivos libre de biomasa, la cual

incluye biomasa que ha sido extraída utilizando el LAP “Determinación de
Extractivos en Biomasa”, así como en sólidos de procesos que no contengan
extractivos. Los resultados se reportan sobre una base de peso seco en horno.
Los resultados pueden informarse sobre una base de biomasa recibida o en
una base libre de extractivos, dependiendo del tipo de biomasa utilizada. El LAP
 “Preparación de Muestras para el Análisis de Composición de Biomasa” debe
utilizarse antes de este procedimiento.

2.2. Este procedimiento es apropiado para biomasa que contiene los

componentes listados a través del procedimiento. Cualquier biomasa que
contenga otros componentes que podrían interferir deben de ser investigados
extensamente.

2.3. Una medida del contenido de acetilo es necesaria para biomasa que
contenga hemicelulosa con un carácter de xilan, pero no para biomasa que
contenga un carácter manan.

2.4. Todos los análisis deben ser desarrollados de acuerdo con un plan
apropiado de seguridad específica de la calidad.

3. Terminología.

3.1. Peso seco en horno (Oven Dry Weight, ODW) – el peso de biomasa
matemáticamente corregido de la cantidad de humedad presente en la muestra
a la hora del pesado.

3.2. Biomasa Preparada – biomasa preparada de acuerdo al LAP “Preparación

de Muestras para el Análisis de Composición de Biomasa”:

3.3. Extractivos libres de biomasa – biomasa después de una extracción

exhaustica con agua y etanol (refiérase al LAP “Determinación de Extractivos
en Biomasa”).

3.4. Lignina insoluble en acido – el residuo remanente en un crisol de porosidad

del medio filtrante después de una hidrolisis en dos etapas, con una corrección
por la ceniza insoluble en acido y por la proteína insoluble en acido, si es
necesario.

3.5. Carbohidratos estructurales – carbohidratos poliméricos, denominados

celulosa y hemicelulosa.

3.6. Componentes no estructurales – componentes no químicamente enlazados

que incluyen pero no están limitados a sacarosa, nitratos/nitritos, proteína,
ceniza, clorofila, y ceras.

4. Importancia y uso.

4.1. Este procedimiento puede ser utilizado, en conjunto con otros

procedimientos para determinar la cantidad de carbohidratos estructurales y
lignina en una muestra solida de biomasa.
5. Interferencias.

5.1. Este procedimiento ha sido optimizado para un intervalo de tamaño de

partícula especificado en el LAP “Preparación de Muestras para el Análisis de
Composición de Biomasa”. Desviación a un tamaño de partícula menor puede
resultar en influir en un bajo contenido de carbohidrato (y una consecuente
influencia en alta lignina) debido a una hidrólisis incompleta de azucares
poliméricos en azucares monomericos.

5.2. Muestras que contengan extractivos que no son adecuados para el

procedimiento. Los extractivos se dividirán irreproduciblemente, resultando en
una alta influencia en lignina.

5.3. Muestras con un contenido de cenizas mayor que el 10% en peso podrían
no ser adecuados para este procedimiento, ya que la muestras puede contener
tierra u otros minerales que podrían interferir con concentraciones de acido
apropiadas y podrían catalizar reacciones secundarias.

5.4. Muestras con un contenido de humedad mayor al 10% en peso podrían no

ser adecuadas para este procedimiento, ya que el exceso de humedad podría
interferir con concentraciones de acido apropiadas. Las muestras deben
secarse (secado con aire o secado en horno al menos a 40ºC) antes de este
procedimiento.

5.5. Muestras que contengan proteína podría influir en alta lignina insoluble en
acido a menos que la proteína se tome en cuenta para las determinación
gravimétricas del material insoluble en acido. Un análisis independiente de
nitrógeno es requerido para estimar el contenido de proteína en el residuo. El
estimado de proteína es entonces sustraído de la medida de lignina insoluble en
acido. Separaciones físicas de la proteína insoluble en acido de la lignina
insoluble en acido sobrepasa el alcance de este procedimiento.

5.6. Este procedimiento no es adecuado para muestras que contengan acido,

bases o catalizadores añadidos.

5.7. Ciertas columnas de guardia para la cuantificación de carbohidratos

pueden causar picos del aparato. Los carbohidratos individuales deben de
correrse en nuevas columnas y columnas guardia para verificar la ausencia de
picos de aparato.

6. Aparatos.

6.1. Balanza analítica, precisión de 0.1 mg.

 6.2. Horno de convección de secado, con un control de temperatura de
105±3ºC.

6.3. Horno mufla, equipada con un termostato, establecido a 575±25ºC o

equipado con un programa opcional de rampa.

6.4. Baño de agua, establecido a 30±3ºC.

6.5. Autoclave, adecuado para líquidos, establecida a 121±3ºC.

6.6. Equipo de filtración, equipado con una fuente de vacío y adaptadores para
vacio de crisoles.

6.7. Desecador que contenga material desecante.

6.8. Sistema HPLC equipado con un detector de índice de refracción y las

siguientes columnas:

6.8.1. Columna Shodex azúcar SP0810 o Biorad Aminex HPX-87P (o

equivalente) con una columna de guardia para el retirado de cenizas con forma
iónica H+/CO3-.

6.8.2. Columna Biorad Aminex HPX-87H (o equivalente) con su

correspondiente columna guardia.

6.9. Espectrofotómetro UV-Vis, arreglo de diodos o una simple longitud de

onda, con cubetas de alta pureza de cuarzo con un paso de luz de 1cm.

6.10. Bureta automática, capaz de dispensar 84.00 mL de agua, opcional.

7. Reactivos y materiales.

7.1. Reactivos.

7.1.1. Acido sulfúrico, 72% p/p (gravedad especifica 1.6338 a 20ºC) –

(también comercialmente disponible como un reactivo para la determinación
de fluor, de Fluka #00647).

7.1.2. Carbonato de calcio, grado reactivo ACS.

7.1.3. Agua, purificada, filtrada 0.2 μm.

7.1.4. Estándares de alta pureza: D-celobiosa, D-(+) glucosa, D-(+) xilosa, D-

(+) galactosa, L-(+) arabinosa, y D-(+) manosa.
 7.1.5. Segundo juego de estándares de alta pureza, como se lista arriba, de
una fuente diferente (fabricante o lote), para ser usado para preparar los
estándares de verificación de calibración (CVS).

7.2. Materiales.

7.2.1. Normas de garantía de calidad, bien caracterizados, como los

estándares de biomasa del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST)
u otra muestra bien caracterizada de composición similar a las muestras que
están siendo analizadas.

7.2.2. Tubos de presión, mínimo con una capacidad de 90 mL, vidrio, con
rosca sobre tapas de teflón y sellos o-ring (Tubo de vidrio ace #8648-30 con
tapón #5845-47, o equivalente).

7.2.3. Barras para agitación de teflón que encajen en los tubos de presión y
aproximadamente 5 cm más largos que los tubos de presión.

7.2.4. Crisoles para filtración, 25 mL, porcelana, media porosidad,

Coors #60531 o equivalente.

7.2.5. Botellas, boca ancha, 50 mL.

7.2.6. Matraces para filtración, 250 mL.

7.2.7. Matraces erlenmeyer, 50 mL.

7.2.8. Pipeteador ajustable, cubriendo los intervalos de 0.02 a 5.00 mL y

84.00 mL.

7.2.9. Papel pH, intervalo 4-9.

7.2.10. Jeringas desechables, 3 mL, equipadas con filtros para jeringa de

0.2 μm.

7.2.11. Viales para automuestreador con sellos de rosca para adaptarse.

8. Peligros y consideraciones.

8.1. El acido sulfúrico es corrosivo y debe manejarse con el cuidado apropiado.

8.2. Sea precavido cuando maneje tubos de presión calientes después de

removerlo de la autoclave, ya que los tubos presurizados tienen peligro de
explosión.

8.3. Cuando coloque los crisoles en la mufla y al removerlos, utiliza equipo de

seguridad personal, incluyendo guantes resistentes al calor.
 8.4. Operar todos los equipos de acuerdo al manual y a los procedimientos de
operación de seguridad de la NREL.

8.5. Sigue todos los procedimientos aplicables de manejo químico de la NREL.

9. Muestreo, especímenes y unidades de prueba.

9.1. Se debe tener cuidado para asegurar que se tome una muestra
representativa para el análisis.

9.2. El LAP “Preparación de Muestras para Análisis de Composición de

Biomasa” debe ser realizado antes de este análisis. Muestras deben contener
un contenido mínimo de sólidos totales del 85%.

9.3. El LAP “Determinación de Extractivos en Biomasa” debe realizarse antes

de este análisis si los extractivos están presentes en la muestra.

9.4. El LAP “Determinación de Sólidos en Biomasa” debe realizarse al mismo

tiempo para las muestras de este análisis son pesadas.

9.5. Este procedimiento es adecuado para muestras que han sido secadas por
aire o liofilizadas. Muestras secadas a una temperatura de 45ºC o superiores no
son adecuadas para este procedimiento.

9.6. Pasos 9.2 a 9.4 deben de aplicar las normas de garantía de calidad.

10. Procedimiento.

10.1. Prepare la muestra para análisis e hidrolice.

10.1.1. Coloque un numero apropiado de crisoles de filtración en un horno

mufla a 575±25ºC por un mínimo de cuatro horas. Retire los crisoles del horno
directamente en un desecador y enfrié por un periodo especifico de tiempo, se
recomienda una hora. Pese los crisoles con una precisión de 0.1 mg y registre
este peso. Es importante mantener los crisoles en un orden específico, si no
están marcados con identificaciones. Calcomanías permanentes para marcado
están disponibles de Wale Apparatus. No marque el fondo del crisol de filtración
con un marcador de porcelana, ya que esto impedirá la filtración.

10.1.2. Coloque los crisoles de vuelta dentro de la mufla a 575±25ºC y

cenize a peso constante. El peso constante se define como menos de un
cambio de ±0.3 mg en el peso tras una hora de recalentamiento del crisol.
 10.1.3. Pese 300.0 ±10.0 mg de la muestra o del estándar QA en tubo de
presión tarado. Registre el peso con una precisión de 0.1 mg. Etiquete el tubo
de presión con un marcador permanente. El LAP “Determinación de Sólidos
Totales en Biomasa” debe de realizarse al mismo tiempo, con precisión mida el
porcentaje de sólidos para corrección. Cada muestra debe ser analizada en
duplicado, como mínimo. El tamaño recomendado de lote es de tres a seis
muestras y un estándar QA, todo debe correrse en duplicado.

10.1.4. Adicione 3.00 ± 0.01 mL (o 4.92 ± 0.01 g) de acido sulfúrico al 72%

a cada tubo de presión. Utilice una varilla de agitación de teflón para mezclarla
durante un minuto, o hasta que la muestra se encuentre bien mezclada.

10.1.5. Coloque el tubo de presión en un baño de agua establecido a

30 ± 3ºC e incube la muestra durante 60 ± 5 minutos. Usando la varilla de
agitación, agite la muestra durante cinco a diez minutos sin retirar la muestra
del baño. La agitación es esencial para asegurar el nivelado de acido para el
contacto de partícula y una hidrólisis uniforme.

10.1.6. Sobre la terminación de la hidrólisis de 60 minutos, retire los tubos

del baño de agua. Diluya el acido a una concentración de 4% al adicionar
84.00 ± 0.04 mL de agua desoinizada usando una bureta automática. La
dilución también puede hacerse al añadir 84.00 ± 0.04 g de agua purificada
usando una balanza con una precisión de 0.01 g. Enrosque los tapones de
teflón en forma segura. Mezcle la muestra al invertir los tubos mucha veces
para eliminar la fase de separación entre capas de concentración de acido altas
y bajas.

Nota: El volumen de la solución de 4% será 86.73 mL, como se

demuestra en el siguiente calculo.

Densidad 72% H2SO4 = d72% H2SO4 = 1.6338 g/mL

Densidad H2O = dH2O = 1.00 g/mL

Densidad 4% H2SO4 = d4% H2SO4 = 1.025 g/mL

1. El peso de 3.00 mL de 72% H2SO4 es:

3.00 mL 72% H2SO4 x d72% H2SO4 = 4.90 g 72% H2SO4

2. La composición de 3.00 mL de 72% H2SO4 es:

4.90 g 72% H2SO4 x 72% (peso acido) = 3.53 g acido

4.90 g 72% H2SO4 x 28% (peso agua) = 1.37 g acido

 3. La concentración de H2SO4 después de la dilución es:

3.53 g acido / (84.00 g H2O + 4.90 g 72% H2SO4) = 3.97 % H2SO4 (p/p)

4. El volumen total de la solución presente después de la dilución es:

(4.90 g H2SO4 + 84.00 g H2O) x (d4% H2SO4)-1 = 86.73 mL

10.1.7. Prepare una serie de estándares de recuperación de azúcar (SRS)

que se tomaran a través de la hidrólisis remanente y usados para corregir
las pérdidas debido a la destrucción de azucares durante la hidrólisis acida
diluida. SRS debe incluir D(+)glucosa, D(+)xilosa, D(+)galactosa,
L(+)arabinosa, y D(+)manosa. Las concentraciones de azucares SRS
deben de ser escogidas para parecerse lo más posible a las
concentraciones de azucares en la muestra de prueba. Pese las cantidades
requeridas de cada azúcar, a una precisión de 0.1 mg, t añada 10.0 mL de
agua desionizada. Adicione 348 μL de acido sulfúrico al 72%. Transfiera el
SRS a un tubo de presión y tápelo con fuerza.

10.1.7.1. Un nuevo SRS no es requerido para cada análisis. Un gran

lote de estándares de recuperación de azucares puede producirse,
filtrado a través de filtros de 0.2 μm, dispensado en alícuotas de 10.0
mL en contenedores sellados, y etiquetados. Estos podrán ser
almacenados en un congelador y retirados cuando se necesiten.
Descongele y agite el SRS congelado antes de su uso. Si se va a usar
un SRS congelado, la cantidad apropiada de acido debe añadirse a la
muestra descongelada y agitada antes de su uso y transferida a un tubo
de presión.

10.1.8. Coloque los tubos en una rejilla de seguridad para autoclave, y

coloque la rejilla en la autoclave. Autoclave las muestras selladas y los
estándares de recuperación de azúcar durante una hora a 121ºC,
usualmente el líquido se asienta. Después de completar el ciclo de
autoclave, permita a los hidrolizados enfriarse lentamente a temperatura
ambiente antes de remover las tapas. (Si el paso 10.2. no es
desarrollado, retire una alícuota de 10 mL del licor para usarlo en el
paso 10.5.)

10.2. Analice la muestra para lignina insoluble en acido como sigue:

10.2.1. Filtre al vacio la solución de hidrólisis de autoclave a través de uno

de los previamente pesados crisoles de filtración. Capture el filtrado en un
matraz para filtración.
10.2.2. Transfiera una alícuota, aproximadamente 50 mL, dentro de un
recipiente para almacenamiento de muestra. Esta muestra se utilizara para
determinar la lignina insoluble en acido así como para carbohidratos, y
acetilo su es necesario. La determinación de lignina soluble en acido debe
hacerse dentro de las seis horas después de la hidrólisis. Si el licor de
hidrólisis debe ser almacenado, debe ser almacenado en un refrigerador
por un máximo de dos semanas. Es importante recoger una alícuota del
licor antes de proceder con el paso 10.2.3.

10.2.3. Utilice aguas Desionizada para transferir cuantitativamente todos los

sólidos remanentes fuera del tubo de presión dentro del crisol para
filtración. Enjuague los sólidos con un mínimo 50 mL de agua desionizada
fresca. Agua desionizada caliente puede ser usada en lugar de agua a
temperatura ambiente para disminuir el tiempo de filtración.

10.2.4. Seque el crisol y el residuo de acido insoluble a 105±3ºC hasta que

se alcance un peso constante, usualmente un mínimo de cuatro horas.

10.2.5. Retire las muestras del horno y enfrié en un desecador. Registre el

peso del crisol y de la muestra seca con una precisión de 0.1 mg.

10.2.6. Coloque los crisoles y el residuo en un horno mufla a 575 ± 25ºC

durante 24 ± 6 horas.

10.2.6.1. Un horno con rampa de temperatura también puede usarse:

Programa de rampa de temperatura para horno.

Rampa de temperatura ambiente a 105ºC

Mantenga a 105ºC durante 12 minutos

Rampa a 250ºC a 10ºC / minuto

Mantenga a 250ºC durante 30 minutos

Rampa a 575ºC a 20ºC / minuto

Mantenga a 575ºC durante 180 minutos

Permita que la temperatura caiga a 105ºC

Mantenga a 105ºC hasta que las muestras sean retiradas

10.2.7. Cuidadosamente remueva el crisol del horno directamente a un

desecado y enfrié por una cantidad específica de tiempo, igual al tiempo
 inicial de enfriado para los crisoles. Pese los crisoles y las cenizas con un
precisión de 0.1 mg y registre el peso. Coloque los crisoles de vuelta en el
horno y cenize hasta un peso constante. (La cantidad de ceniza insoluble
en acido no es igual a la cantidad total de ceniza en la muestra de biomasa.
Refiérase al LAP “Determinación de Ceniza en Biomasa” si el total de
ceniza se determinara.)

10.3. Analice la muestra para lignina soluble en acido como sigue

10.3.1. En un espectrofotómetro UV-Visible, corra un blanco con agua

desionizada o con acido sulfúrico al 4%.

10.3.2. Usando la alícuota del licor de hidrólisis en el paso 10.2.2., mida la

absorbancia de la muestra en una longitud de onda apropiada en un
espectrofotómetro UV-Visible. Refiérase a la sección 11.3 para valores
sugeridos de longitud de onda. Diluya la muestra como sea necesario para
llevar la absorbancia al intervalo de 0.7 – 1.0, registrando la dilución. Agua
desionizada o acido sulfúrico al 4% puede ser utilizado para diluir la
muestra, pero el mismo solvente debe ser utilizado como blanco. Registre la
absorbancia hasta tres decimales. La reproducibilidad debe estar en ±0.05
unidades de absorbancia. Analice la muestra en duplicado, como mínimo.
(Este paso debe ser hecho en las seis horas después de la hidrólisis).

10.3.3. Calcule la cantidad presente de lignina soluble en acido usando el

cálculo en 11.3.

10.4. Analice la muestra para carbohidratos estructurales.

10.4.1. Prepare unas series de estándares de calibración que contengan los

componentes que se van a cuantificar, refiriéndose a la Tabla 1 para un
intervalo de concentración sugerido. Use una calibración de cuatro puntos.
Si los estándares se preparan fuera del intervalo sugerido, el nuevo
intervalo para estas curvas de calibración deberá ser validado.

10.4.1.1. Tabla 1 – Intervalo de concentración sugerido para los

estándares de calibración 10.4.1.

Componente Intervalo sugerido de

concentración (mg/mL)
D-cellobiose 0.1 – 4.0
D(+)glucosa 0.1 – 4.0
D(+)xilosa 0.1 – 4.0
D(+)galactosa 0.1 – 4.0
L(+)arabinosa 0.1 – 4.0
 D(+)manosa 0.1 – 4.0
CVS Media del rango lineal,
concentración no igual a
la del punto de calibración
(se sugiere 2.5)
10.4.1.2. Un nuevo lote de estándares no es requerido para cada
análisis. Un largo lote de estándares se puede producir, filtrado a través
de filtros de 0.2 μm en viales para automuestreador, sellados y
etiquetados. Las muestras de estándares y de CVS pueden
almacenarse en un congelador y removidos cuando se necesite.
Descongelar y agitar los estándares antes de su uso. Durante cada uso,
las muestras de estándar y CVS se deben observar por un
comportamiento de concentración inusual. Las concentraciones
inusuales pueden significar que las muestras se encuentran
comprometidas o que componentes volátiles se han perdido.
Asumiendo volumen suficiente, las muestras de estándares y CVS no
deben de tener más de 12 arrastres de inyección de un solo vial. En
una para automuestreador enfriada, el tiempo de vida de las muestras
de estándares y CVS es aproximadamente de tres a cuatro días.

10.4.2. Prepare una calibración de verificación de estándares independiente

(CVS) para cada lote de estándares de calibración. Use reactivos de otra
fuente o lote del que se está utilizando en la preparación de los estándares
de calibración. Prepare los CVS a una concentración que caiga en el medio
de un rango valido de la curva de calibración. Los CVS deben de analizarse
en el HPLC después de cada lote de calibración y a intervalos regulares a
través de la secuencia, agrupando grupos de muestras. Los CVS se usan
para verificar la calidad y estabilidad de la curva(s) de calibración a través
de la corrida.

10.4.3. Usando el licor de hidrólisis obtenido en el paso 10.2.2., transfiera

una alícuota de aproximadamente 20 mL de cada licor en un matraz
Erlenmeyer de 50 mL.

10.4.4. Use carbonato de calcio para neutralizar cada muestra a un pH de

5 – 6. Evite neutralizar a un pH mayor de 6 al monitorearlo con papel de pH.
Añada el carbonato de calcio lentamente hasta que el pH sea de 4. Agite la
muestra frecuentemente, Después de llegar a un pH 5 – 6, permita que la
muestra sedimente y decante el líquido claro. El pH del líquido después del
sedimentado será aproximadamente de 7. (Las muestras nunca deberán
permitirse exceder a un pH de 9, ya que esto resultara en una pérdida de
azucares).
 10.4.5. Prepare la muestra para análisis por HPLC al pasar el liquido
decantado a través de un filtro de 0.2 μm dentro de un vial para
automuestreador. Selle y etiquete el vial. Prepare cada muestra en
duplicado si lo desea. Si es necesario, las muestras neutralizadas pueden
ser guardadas en un refrigerador por tres o cuatro días. Después de este
tiempo, las muestras deberán ser consideradas como comprometidas
debido al crecimiento potencial microbiano. Después del almacenado en
frio, revise las muestras por la presencia de un precipitado. Las muestras
que contengan un precipitado deberán ser refiltradas, mientras
permanezcan frías, a través de filtros de 0.2 μm.

10.4.6. Analice los estándares de calibración, CVS y las muestras por HPLC
usando una columna Shodex sugar SP0810 o Biorad Aminex HPX-87P
equipada con su apropiada columna guardia.

Condiciones HPLC:

Volumen de inyección: 10 – 50 μL, dependiendo de la concentración

y los límites del detector.

Fase móvil: Agua grado HPLC, filtrada 0.2 μL y desgasificada.

Caudal: 0.6 mL / minuto.

Temperatura de columna: 80 – 85ºC.

Temperatura del detector: tan cercana a la temperatura de la

columna como sea posible.

Detector: índice de refracción.

Tiempo de corrida: 35 minutos.

Nota: La columna guardia retirado de cenizas deberá ser colocada

fuera de la unidad de calentamiento y mantenida a temperatura
ambiente. Esto prevendrá picos del aparato en el cromatograma.

10.4.7. Revise los cromatogramas de la muestra de prueba por la presencia

de celobiosa y azucares oligomericos. Niveles de celobiosa mayores que
3 mg/mL indican una hidrólisis incompleta. Muestra frescas deberán
hidrolizarse y analizarse.

10.5. Analice la muestra por el contenido de lignina soluble en acido si es

necesario.
10.5.1. Prepare 0.005 M (0.01 N) de acido sulfúrico para usarlo como fase
móvil para HPLC. En un matraz volumétrico de 2L, añada 2.00 mL de acido
sulfúrico estandarizado 10N y afore al volumen con agua grado HPLC. Filtre
a través de un filtro de 0.2 μm y desgasifique antes de usar. Si acido
sulfúrico 10N no se encuentra disponible, se puede utilizar acido sulfúrico
concentrado. 278 μL de acido sulfúrico concentrado traído a un volumen en
un matraz volumétrico de 1 L con agua grado HPLC también producirá
0.005 M de acido sulfúrico.

10.5.2. Prepare una serie de estándares de calibración que contengan los

componentes que se van a cuantificar. Se recomienda el acido acético, son
opcionales el acido fórmico y el acido levulinico. Se sugiere un intervalo de
0.02 a 0.5 mg/mL. Se sugiere un espaciado uniforme de cuatro puntos de
calibración. Si los estándares se preparan fuera de los intervalos sugeridos,
el nuevo intervalo para estas curvas de calibración debe ser validado.

10.5.3. Prepare un independiente estándar de verificación de calibración

(CVS) para cada lote de estándares de calibración, usando los
componentes obtenidos de otra fuente que los usados en la preparación de
los estándares de calibración. Los CVS deben contener con precisión
cantidades conocidas de cada componente contenido en los estándares de
calibración, en una concentración que caiga en el medio del intervalo
validado de la curva de calibración. El CVS debe ser analizado mediante
HPLC después de cada lote de calibración y a intervalos regulares a través
de la secuencia, entre espacios de grupos de muestras. El CVS se utiliza
para verificar la calidad y estabilidad de la curva(s) de calibración a través
de la corrida.

10.5.4. Prepare la muestra para análisis de HPLC al pasar una pequeña

alícuota del licor recolectado en el paso 10.2.2. a través de un filtro de
0.2 μm dentro de un vial para automuestreador. Selle y etiquete el vial. Si
se sospecha que la concentración de la muestra pueda exceder el intervalo
de la curva de calibración, diluya las muestras como se necesiten,
registrando la dilución. Las concentraciones deberán ser corregidas por la
dilución después de la corrida.

10.5.5. Analice los estándares de calibración, CVS y las muestras por HPLC
usando una columna Biorad Aminex HPX-87H equipada con su apropiada
columna guardia.

Condiciones HPLC:

Volumen de inyección: 50 μL
 Fase móvil: Acido sulfúrico 0.005 M, filtrada 0.2 μm y desgasificada

Caudal: 0.6 mL / minuto.

Temperatura de columna: 55 – 65ºC.

Temperatura del detector: tan cercana a la temperatura de la

columna como sea posible.

Detector: índice de refracción.

Tiempo de corrida: 50 minutos.

11. Cálculos.

11.1. Calcule el peso seco de horno (ODW) de la muestra libre de extractivos,

usando el promedio del contenido de sólidos totales como se determino por el
LAP “Método Estándar para la Determinación de Sólidos Totales en Biomasa”.

𝑃𝑒𝑠𝑜𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎 𝑎𝑖𝑟𝑒 ∗ %𝑆𝑜𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠

𝑂𝐷𝑊 =
100
11.2. Calcule y registre el porcentaje en peso del residuo de acido insoluble
(AIR) y lignina insoluble en acido (AIL) en una base libre de extractivos.

𝑃𝑒𝑠𝑜𝑐𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙+𝐴𝐼𝑅 − 𝑃𝑒𝑠𝑜𝑐𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙
%𝐴𝐼𝑅 = ∗ 100
𝑂𝐷𝑊𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

(𝑃𝑒𝑠𝑜𝑐𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙+𝐴𝐼𝑅 − 𝑃𝑒𝑠𝑜𝐶𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙 ) − (𝑃𝑒𝑠𝑜𝑐𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙+𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎 − 𝑃𝑒𝑠𝑜𝑐𝑟𝑖𝑠𝑜𝑙 ) − 𝑃𝑒𝑠𝑜𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎

%𝐴𝐼𝐿 = ∗ 100
𝑂𝐷𝑊𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Donde:
Pesoproteína = Cantidad de proteína presente en el residuo de acido
insoluble, como se determina en el LAP “Determinación del
Contenido de Proteína en Biomasa”. Esta medición solo es necesario
para biomasas que contengan altas cantidades de proteína.
11.3. Calcule la cantidad de lignina soluble en acido (ASL) en una base libre de
extractivos:

𝑈𝑉𝑎𝑏𝑠 ∗ 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 ∗ 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛

%𝐴𝑆𝐿 = ∗ 100
𝜀 ∗ 𝑂𝐷𝑊𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Donde:

UVabs = promedio de la absorbancia UV-Vis para la muestra en una

apropiada longitud de onda (ver tabla abajo).
 Volumen licor hidrólisis = volumen del filtrado, 86.73 mL

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 + 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛

𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 =
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

ε = Absortividad de la biomasa a una longitud de onda especifica

(ver tabla abajo)

Constantes de absortividad para mediciones de lignina soluble en acido para tipo

de biomasa seleccionados

Tipo de Biomasa Lamda max Absortividad en Longitud de onda Absortividad en

(nm) la lambda max recomendada la longitud de
(L/ g cm) (nm) onda
recomendada
(L/g cm)
Pinus Radiata- 198 25 240 12
NIST SRM 8493
Bagasse – NIST 198 40 240 25
SRM 8491
Corn Stover – 198 55 320 30
NREL materia
prima
suministrada
Popolus 197 60 240 25
deltiodes – NIST
SRM 8492
Nota: Valores máximos de lambda con frecuencia contienen picos
inoportunos de los productos de degradación de carbohidratos. Los valores
de longitud de onda recomendados han sido escogidos para minimizar estas
interferencias.

11.4. Calcule la cantidad total de lignina en una base libre de extractivos.

%𝐿𝑖𝑔𝑛𝑖𝑛𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 𝑒𝑥𝑡𝑟 = %𝐴𝐼𝐿 + %𝐴𝑆𝐿

11.5. Calcule el valor total de lignina en una base así como se recibió, si es
necesario

(100 − %𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠)
%𝐿𝑖𝑔𝑛𝑖𝑛𝑎𝑐𝑜𝑚𝑜 𝑟𝑒𝑐𝑖𝑏𝑖𝑜 = (%𝐿𝑖𝑔𝑛𝑖𝑛𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 𝑒𝑥𝑡𝑟 ) ∗
100
Donde:

% Extractivos = porcentaje de extractivos en la muestra de biomasa

preparada, como se determino en el LAP “Determinación de
Extractivos en Biomasa”
11.6. Cree una curva de calibración para cada analito que será cuantificado
utilizando regresión lineal. De estas cuervas, determine la concentración en
mg/mL de cada componente presente en la muestras analizadas por HPLC,
corrigiendo por dilución si se requiere.

11.7. Calcule y registre la cantidad de cada estándar recuperado de verificación

de calibración (CVS) seguido por análisis por HPLC.

𝑐𝑜𝑛𝑐. 𝑑𝑒𝑡𝑒𝑐𝑡𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝐻𝑃𝐿𝐶, 𝑚𝑔/𝑚𝐿

%𝐶𝑉𝑆 𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜 = ∗ 100
𝑐𝑜𝑛𝑐. 𝑐𝑜𝑛𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟, 𝑚𝑔/𝑚𝐿

11.8. Para los estándares de recuperación de azúcar (SRS), calcule la cantidad

de cada componente recuperado de azúcar después de la hidrólisis acida
diluida, contando para cada dilución hechas antes del análisis por HPLC.
Promedie cualquier calor de replica (%Razucar) obtenido para cada azúcar
individual y repórtelo %R azúcar prom.

𝑐𝑜𝑛𝑐. 𝑑𝑒𝑡𝑒𝑐𝑡𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝐻𝑃𝐿𝐶, 𝑚𝑔/𝑚𝐿

%𝑅𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟 = ∗ 100
𝑐𝑜𝑛𝑐. 𝑐𝑜𝑛𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑎𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠, 𝑚𝑔/𝑚𝐿

11.9. Use los valores de porcentaje de azucares recuperados hidrolizados

calculados en el paso 11.8 para corregir los valores correspondientes de
concentración de azúcar obtenidos por HPLC para cada una de las muestras
hidrolizadas (C muestra cor.), contando para cada dilución hecha antes del análisis
por HPLC.

𝐶𝐻𝑃𝐿𝐶 ∗ 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛

𝐶𝑥 =
%𝑅𝑝𝑟𝑜𝑚.𝑎𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟 /100

Donde:

CHPLC = conc. de un azúcar como se determina por HPLC, mg/mL

%Rprom. azúcar = promedio de recuperación de un componente

especifico de SRS.

Cx = Ccor. muestra, concentración en mg/mL de un azúcar en la muestra

hidrolizada después de corregir por perdida en la hidrólisis al 4%.

11.10. Calcule la concentración de azucares poliméricos de la concentración de

los correspondientes azucares monomericos, usando una corrección anhidra de
0.88 (o 132/150) de azucares C-5 (xilosa y arabinosa) y una corrección de 0.90
(o 162/180) de azucares C-6 (glucosa, galactosa, y manosa).

𝐶𝑎𝑛ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎 = 𝐶𝑐𝑜𝑟𝑟 ∗ 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑎𝑛ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎

11.11. Calcula el porcentaje de cada azúcar en una base libre de extractivos.

1𝑔
𝐶𝑎𝑛ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎 ∗ 𝑉𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 ∗ 1000𝑚𝑔
%𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 𝑒𝑥𝑡 = ∗ 100
𝑂𝐷𝑊𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Donde: Vfiltrado = volumen del filtrado, 86.73 mL.

11.12. Calcula el porcentaje de cada azúcar en una base como fue recibida, si
es necesario.

(100 − %𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠)
%𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑐𝑜𝑚𝑜 𝑠𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑖𝑏𝑖𝑜 = (%𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 𝑒𝑥𝑡 ) ∗
100
Donde: % Extractivos = porcentaje de extractivos en la muestra de biomasa
pretratada, como se determino en el LAP “Determinación de Extractivos en
Biomasa”.

11.13. Calcula el porcentaje de acetato en una base libre de extractivos.

𝐶𝐴𝐴,𝐻𝑃𝐿𝐶 ∗ 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 ∗ 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑐𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑖𝑜𝑛

%𝐴𝑐𝑒𝑡𝑎𝑡𝑜𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 𝑒𝑥𝑡 = ∗ 100
𝑂𝐷𝑊𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Donde:

CAA,HPLC = concentración en mg/mL de acido acético como se determino

por HPLC.

Volumen licor de hidrólisis = volumen del filtrado, generalmente 86.73 mL

Factor de conversión = 0.683, la conversión de acido acético a acetato

en biomasa.

11.14. Calcula el porcentaje de acetilo en una base como se recibió, si es

necesario.

(100 − % 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠)
%𝐴𝑐𝑒𝑡𝑖𝑙𝑜𝑐𝑜𝑚𝑜 𝑠𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑖𝑏𝑖𝑜 = (%𝐴𝑐𝑒𝑡𝑖𝑙𝑜𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 𝑒𝑥𝑡 ) ∗
100
11.15. Para reportar o calcular el porciento relativo de diferencia (RPD) entre
dos muestras, use el siguiente cálculo:

(𝑋1 − 𝑋2 )
𝑅𝑃𝐷 = ( ) ∗ 100
𝑋𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎

Donde: X1 y X2 = valores medidos

 XMedia = la media de X1 y X2.

11.16. Para reportar o calcular la desviación cuadrada de la raíz media (RMS

desviación) o la desviación estándar (st dev) de las muestras, utilice los
siguientes cálculos. Primero encuentre la raíz cuadrada de la media (RMS), de
la muestras usando

2
∑𝑛 𝑥
𝑅𝑀𝑆 = 𝑥𝑚 = 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 = √( 1 )
𝑛

Después encuentre la desviación cuadrada de la raíz media, usando

∑𝑛(𝑥𝑖 − 𝑥𝑚 )2
𝑅𝑀𝑆𝑑𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 = 𝜎 = 𝑠𝑡𝑑𝑒𝑣 = √ 1
𝑛

Donde: xm = la raíz media cuadrada de todos los valores de x en el conjunto

n = numero de muestras en el conjunto

xi = un valor medido del conjunto

12. Formato del reporte.

12.1. Reporte el porcentaje en peso de lignina, de cada azúcar, y del acetato.

Reportado en una base como fue recibido corrigiendo por los extractivos, si es
necesario.

12.2. Para análisis de replicas, reporte el promedio y la diferencia en porcentaje

relativo.

13. Precisión y parcialidad.

13.1. Rondas de pruebas complejas – Para un reporte documentando una

prueba internacional de rondas de prueba complejas de métodos de análisis de
biomasa, incluyendo este procedimiento, ver Milne et al., 1992.

14. Control de la calidad.

14.1. Reporte figuras significativas o decimales: Determinado por los objetivos

de adquisición de datos y un plan apropiado de seguridad específica de la
calidad.

14.2. Replicas: Corra todas las muestras en duplicado.

14.3. Blanco: Ninguno.

 14.4. Criterio relativo de diferencia porcentual: Determinado por los objetivos de
adquisición de datos y un plan apropiado de seguridad específica de la calidad.

14.5. Método de verificación de estándar: Estándares de verificación de

calibración deben de prepararse independientemente y analizados como se
describe en la sección del procedimiento.

14.6. Tamaño de la muestra: 4g, como mínimo, de la muestra, extraer si es

necesario (incluyendo la cantidad necesaria para la determinación del
porcentaje de sólidos).

14.7. Almacenamiento de muestras: Los licores de hidrólisis pueden ser

almacenados en un refrigerados por hasta dos semanas.

14.8. Almacenamiento de estándares: Los estándares deberán ser

almacenados en un congelador y retirados cuando se necesiten. Descongele y
agite los estándares congelados antes de su uso.

14.9. Preparación de estándares: Los estándares deberán ser preparados como

se describe en el procedimiento, incluyendo los estándares de calidad.

14.11. Definición de un lote: Cualquier numero de muestras que se van a

analizar y registrar juntos. El tamaño recomendado es de tres a seis muestras
con un estándar de calidad, todas corridas en duplicado.

14.11. Tablas de control: Todos los recuperados de CVS, SRS y NIST o los
estándares QA deberán tener una tabla de control.

15. Apéndices.

15.1. Ninguno.