Métodos de separación

y purificación de
proteínas
Departamente de Bioquímica Humana
Facultad de Medicina UBA

Autor: Paula Mariana Maloberti

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Electroforesis
Se denomina electroforesis al desplazamiento de moléculas con
carga neta en un campo eléctrico. Este método se puede utilizar para
separar proteínas y otras macromoléculas tales como DNA y RNA.

La velocidad ( v ) con que migre la proteína dependerá de la fuerza

del campo ( E ), de la carga neta de la proteína ( z ) y del coeficiente
de fricción ( f ) (dado por la fricción entre la molécula y el medio en
que se desplaza).

Las separaciones electroforéticas se pueden realizar sobre

distintos materiales tales como papel, sin embargo comúnmente se
realizan sobre geles ya que estos a su vez funcionan como tamices
aumentando la separación y dando así una mejor resolución a la
electroforesis.
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 ¿Cómo se prepara el gel?
El tipo de gel comúnmente utilizado para separar proteínas es el de
poliacrilamida. Para formar un gel de este tipo se utilizan dos
compuestos acrilamida y bisacrilamida. Estos dos compuestos se
hacen reaccionar para obtener un polímero de acrilamida donde la
bisacrilamida produce enlaces cruzados entre los monómeros de
acrilamida. CONH2 CONH2

O CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-
H2C=CH- C-NH2 CONH
CATALIZADOR
+
CH2
O
CONH
( CH2=CH-C-NH-)2CH2
CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-

CONH2 CONH2
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 Se mezclan la
acrilamida,
bisacrilamida, buffer, y
la sustancia
catalizadora.

Esta mezcla que es

líquida y
transparente en
poco tiempo
polimerizará. Antes de polimerizar la mezcla se
coloca en un molde hecho con
vidrios y luego se coloca un peine.

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 Una vez que
polimerizó se
retira el peine y
se observan
entonces pocillos
donde se
colocaran las
muestras para
correr.
La poliacrilamida forma
una especie de malla con
poros por los cuales pasan
las proteínas. A mayor
tamaño de la proteína
mayor será la dificultad
para migrar a través del
gel.
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 ¿Cómo se preparan las muestras a analizar?
Se colocan en distintos tubos de ensayo las muestras de proteínas a
analizar.
Se coloca una solución que contiene azul de bromofenol, que es un
colorante de tamaño muy pequeño qu correrá al frente de las proteínas
que tienen un tamaño mayor.
Se coloca también un detergente aniónico SDS (dodecilsulfato de
sodio).
Marcadores
1 2 3 4 5 6 de peso
molecular

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Al estar presente el SDS en la muestra se realizará la
electroforesis en condiciones desnaturalizantes. Este detergente
es capaz de romper todas las uniones no covalentes entre las
proteínas.
Los aniones de SDS se unen a la cadena proteica en una relación de
una molécula de SDS por cada dos aminoácidos, lo que produce un
complejo con carga negativa. De esta manera todas las proteínas
quedan cargadas negativamente, y podrán separarse por masa.

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 Marcadores
de peso
molecular
En la electroforesis se colocan
también marcadores de peso
molecular. Estos consisten en una
mezcla de proteínas conocidas y
cuyo peso molecular esta
determinado. De esta manera se
podrá comparar con estos
marcadores para determinar el
tamaño de una proteína de peso
molecular desconocido.

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¿Cómo se realiza la electroforesis?

Se coloca buffer en
la parte superior y se
colocan las muestras
en los pocillos

El gel se
coloca en un
recipiente
con buffer

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 Cátodo

Ánodo
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 Se coloca una
tapa y se conecta
todo el
dispositivo a una
fuente de poder
que producirá el
campo eléctrico

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 Se aplica un
potencial
eléctrico de
120 voltios. Y
comienza la
electroforesis.

120 volt

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 En esta animación vemos como se produce
la electroforesis. Ver.

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¿Cómo se separan las proteínas en el gel?
Para entender esto utilizaremos un ejemplo donde se analizarán solo
muestras que contienen 3 proteínas distintas.
Se preparan las muestras como vimos anteriormente y se separarán
electroforéticamente. Las proteínas migrarán hacia el ánodo ya que
estan cargadas negativamente por la presencia de SDS en la muestra.
Por otra parte las proteínas de menor tamaño migrarán con mayor
velocidad que las de mayor tamaño. Y recuerden además que el azul de
bromofenol presente en la muestra migra primero ya que es el de
menor peso molecular.

Marcadores
de peso
1 2 3 4 5 6 molecular

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 En los distintos carriles En este carril se
se colocan las muestras colocan marcadores de
a analizar peso molecular

La flecha
indica el
sentido
en que
corren las
proteínas

¿ Cuál será la proteína que migrará primero?

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 En esta animación observaremos como migran
las proteínas en el gel. Ver.

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 La proteína
que migra
primero es la
de menor
peso
molecular.

El colorante
azul marca
el frente de
la corrida y
es la única
banda que
podemos
ver. ¿Cómo podemos ver las bandas
correspondientes a las proteínas?

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 Así es como en
realidad se ve el
gel una vez que
terminó la
electroforesis

Para visualizar las proteínas en el gel se hace una tinción

con un colorante (Coomassie blue) que se une a las
proteínas. Pulse el mouse para teñir el gel con Coomasie.

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 Si se analizan muestras más complejas obtenidas de algún
tejido o suero se observarán muchas más bandas como en
este ejemplo.

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Western blot

Una vez finalizada la electroforesis el gel puede ser

utilizado para realizar la técnica de Western Blot. El
primer paso de esta técnica consiste en transferir las
proteínas separadas electroforéticamente desde el gel a
una membrana. Este proceso puede acelerarse por medio
de corriente eléctrica.
¿Cómo se realiza esta transferencia?

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 Para ver cada paso de la transferencia pulse el mouse.

Por último se
coloca otra
esponja embebida
en buffer.
Se coloca el gel donde
en colores observamos
la posición de las
proteínas.
Se coloca la membrana de
nitrocelulosa
Se coloca una
esponja con buffer

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 Para ver cada paso de la Se conecta el aparato
de transferencia a una
transferencia pulse el mouse. fuente de poder y se
utilizará un potencial
de 15 voltios durante
una hora
aproximadamente

15 volt

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¿Cómo se transfieren las proteínas? El buffer de
transferencia
contiene SDS, por
lo tanto las
proteínas tienen
carga negativa y
migrarán al ánodo
donde se encuentra
la membrana.

15 volt

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 En esta animación podemos ver como ocurre la
transferencia.Ver.

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 Una vez que
finalizó la
transferencia la
membrana se
observa de esta
manera.

¿Cómo podemos visualizar las proteínas transferidas a la

membrana?
Para este fin se utiliza otro colorante, rojo Ponceau, que
tiñe las proteínas fijadas a la membrana. Pulse el mouse
para teñir la membrana con rojo Ponceau.

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Las proteínas pueden identificarse utilizando anticuerpos. Los anticuerpos
pueden diferenciar proteínas muy semejantes entre sí, incluso pueden
detectar diferencias de unos pocos aminoácidos. En la técnica de Western
blot se utiliza esta ventaja para analizar la presencia de una proteína
determinada. Para esto, luego de la transferencia la membrana se incuba en
una solución concentrada de proteínas que se unirán al papel en los espacios
vacíos en los cuales no haya proteínas unidas. Este proceso se denomina
“bloqueo” y generalmente se realiza utilizando una solución de leche
descremada en un buffer apropiado como solución de bloqueo.
Para realizar el bloqueo pulse el mouse.

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 Una vez realizado el bloqueo se coloca el anticuerpo contra la
proteína que se desea estudiar. Este anticuerpo se incuba con la
membrana durante toda la noche a 4 oC. Durante este tiempo se
produce la unión específica entre el antígeno y el anticuerpo.

Para incubar con el anticuerpo pulse el mouse.

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 Luego de la incubación con el anticuerpo se realizan lavados con
buffer para eliminar el exceso de anticuerpo que no se unió
específicamente a la membrana. Después de los lavados se
incuba la membrana con un segundo anticuerpo. Este anticuerpo
es un anticuerpo anti anticuerpo, y aunque suene a trabalenguas,
es fácil de entender si recordamos como se producen los
anticuerpos........

Para realizar el lavado pulse el mouse.

lavados

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 Para obtener el primer
anticuerpo se inyecta el
antígeno (X) que es la
proteína que queremos
estudiar.

El sistema inmune del conejo

responde produciendo anticuerpos
circulantes. Obtenemos el suero
del conejo que contiene una alta
concentración de inmunoglobulinas
anti X.

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 Para obtener un
anticuerpo anti
inmunoglobulina de
conejo, se utiliza como
antígeno suero de conejo
no inmunizado, y se
inyecta en otro animal
El sistema inmune del
para que las proteínas
burro responde
que contiene funcionen
produciendo entre
como antígeno.
otros anticuerpos anti
inmunoglobulinas de
conejo.

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 Los segundos
anticuerpos
obtenidos se pueden
acoplar
covalentemente a una
Se pueden enzima.
purificar los Frecuentemente se
anticuerpos utiliza peroxidasa de
contenidos en rábano picante.
el suero del
burro.

Este finalmente es el
segundo anticuerpo que
se utiliza en el Western
blot.
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 El segundo anticuerpo entonces reconoce al primer anticuerpo
unido a la proteína X unida a la membrana. Se realizan lavados
nuevamente para eliminar el exceso del segundo anticuerpo.
La actividad de la enzima unida al segundo anticuerpo permite
detectar el complejo segundo anticuerpo-primer anticuerpo-
proteína X.

Para incubar con el segundo anticuerpo pulse el mouse.

Segundo
anticuerpo

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 Luego de los lavados se agrega el sustrato específico de la
enzima acoplada al anticuerpo. La enzima catalizará la
reacción que transforma el sustrato en un producto coloreado
o luminiscente. De cualquiera de las dos maneras podremos
detectar la presencia de la proteína que queríamos estudiar.

Para incubar con el sustrato pulse el mouse.

Sustrato

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Para repasar los distintos pasos del Western blot
imaginemos tres proteínas diferentes unidas a la membrana.

Membrana

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Primer paso: Bloqueo.
Se utiliza leche para bloquear todos los sitios de
la membrana que no tienen proteínas unidas.

Membrana

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Segundo paso: Incubación con el primer
anticuerpo.
Se incuba la membrana con el anticuerpo anti la
proteína que queremos estudiar.

Membrana

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Tercer paso: Lavado.
Se realiza un lavado con buffer para eliminar el
exceso de anticuerpo que no se unió a la proteína
de interés. De esta manera queda unido sólo el
anticuerpo que reconoce a la proteína específica.

Membrana

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Cuarto paso: Incubación con el segundo
anticuerpo.
Se incuba con el segundo anticuerpo anti primer
anticuerpo. Este anticuerpo está conjugado a una
enzima.

Membrana

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Quinto paso: Lavado.
Se elimina el exceso de segundo anticuerpo.

Membrana

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Sexto paso: Agregado del sustrato.
Se agrega el sustrato que en presencia de la enzima se
transformará en un producto coloreado o luminiscente.

Membrana

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El producto enzimático produce una señal que nos permite
visualizar la presencia de la proteína.

Membrana

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 Si la señal es luminiscente el resultado puede
evidenciarse colocando encima de la membrana una
placa radiográfica trabajando en un cuarto oscuro.

Pulse el mouse para colocar la placa de autorradiografía.

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 Se procede a revelar la placa. En el lugar donde
está la señal luminiscente, la placa aparece
velada y se observa una banda correspondiente a
la proteína en estudio. Pulse el mouse para
revelar.

Revelador Agua Fijador

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 Así se ve la placa
de autorradiografía
una vez revelada

A través de esta técnica se puede determinar la

presencia y la cantidad de una proteína en una muestra.