Fish & Shellfish Immunology (1996) 6, 57–69 

The role of specific antiserum of catfish, Clarias gariepinus, as a defence against 

Aeromonas hydrophila 
Z. Y 
IN 
, T. J. L 
AM AND 
Y. M. S 
IN 
* 
Department of Zoology, National University of Singapore, Singapore 0511 
(Received 6 June 1995, accepted in revised form 28 August 1995) 
Catfish  (Clarias gariepinus) were vaccinated against a virulent (PPD 134/91) and an avirulent strain (L37) of formalin-inactivated 
Aeromonas  hydrophila.  The  specific  antiserum  against  the avirulent strain, in vitro, showed a significant inhibition in the growth 
of  the  avirulent  strain  as  compared  to  that  treated  with  control  serum.  In  contrast,  no  significant  di#erence  was  found  in  the 
growth  rate  of  the  virulent  strain  (PPD  134/91)  which  was  treated  with  either  the  specific  antiserum  or  control  serum.  The 
specific  antibodies  against  PPD  134/91  showed  an  increased  opsonizing  e#ect.  However,  opsonization  did  not  enhance  the 
bactericidal  activity  of  phagocytic  cells  against  the  virulent  strain.  The  specific  antiserum did not show any opsonizing e#ect on 
the  serologically  di#erent  virulent  strain  (PPD  122/91).  The  specific  antiserum  against  PPD  134/91  could  inhibit,  in  vitro,  the 
invasive  ability  of  the  same  virulent  strain  of  A.  hydrophila  to  epithelial  cells.  However,  no  significant  protection  was 
encountered  in  naive  fish  when  they  were  intramuscularly  injected  with  the  virulent  strain  of  A.  hydrophila  pretreated  with the 
specific  antiserum.  Hence,  the  present  in  vitro  findings  suggest  that the specific antiserum in the mucus might play an important 
role  in  fish  disease  resistance  by preventing serologically similar virulent strains of A. hydrophila from attaching and penetrating 
into the integument at the initial stage of infection. 1996 Academic Press Limited 
Key words: Clarias gariepinus, specific antiserum, protection, Aeromonas 
hydrophila. 
I. Introduction 
In  mammals,  antibodies  perform  various  functions  in  the  host’s resistance to infection. These include neutralization 
of  the  e#ects  of  bacterial  toxins;  opsonization;  killing  of  bacteria  in  cooperation  with  complement  (bacterio-  lysis) 
and  prevention  of  bacterial  attachment  to  epithelial  cells  (Wistreich  &  Lechtman,  1988;  Schiemann  &  Nelson, 
1988).  However,  evidence  of  a  protec-  tive  role  of  specific  antibodies  in  fish  is full of contradictions. For instance, 
many  workers  have  failed  to  correlate  protection  with  specific  antibody  titres  in  fish  vaccinated  against  bacteria 
(McCarthy et al., 1983; Baba et al., 1988). 
Aeromonas  hydrophila,  which  often  causes  infections  in  carp,  catfish,  and  salmonids,  is  associated  with  small 
surface  lesions,  local  haemorrhage,  and  septicemia.  These  clinical  disorders  seem  to  be  triggered  by  toxic 
extracellular 
*Please address all correspondence to Dr Y. M. Sin, Associate Professor, Department of Zoology, National University of 
Singapore, Lower Kent Ridge Road, Singapopre 0511. 
57 1050–4648/96/010057+13 $12.00/0 1996 Academic Press Limited 
 
58 Z. YIN ET AL. 
products  and  the  ability  of  the  bacterial  strains  to  survive  within  the  host  (Krovacek  et  al.,  1987;  Ainsworth  & 
Dexiang,  1990;  Leung  et  al.,  1995b).  The aim of the present study was to investigate the role of specific antibody in 
catfish (Clarias gariepinus) in protection against Aeromonas hydrophila. 
II. Materials and Methods 
BACTERIAL STRAINS 
Three  serologically  di#erent  strains  of  Aeromonas  hydrophila  were  used.  Two  virulent  strains  (PPD  122/91  and 
PPD  134/91)  were  obtained  from  the  Primary  Production  Department,  Singapore  while  the  other  avirulent  strain 
(L37)  was  obtained  from  Southeast  Asian  Regional  Center  for  Tropical  Biology,  Bogor,  Indonesia.  Strains of both 
sources  were  isolated  from  infected  fish.  The  characteristics were reported previously (Angka et al., 1995; Leung et 
al., 1995a,b). 
EXPERIMENTAL FISH 
Healthy  catfish  (Clarias  gariepinus)  weighing  about  52  g  were maintained in well-aerated, dechlorinated water at 
23–26 C. Fish were fed commercial food pellets at 1% body weight daily. 
VACCINE PRODUCTION, ADMINISTRATION AND SERUM COLLECTION 
Aeromonas  hydrophila  was  cultured  for  24  h  at  25  C  in  trypticase  soy  broth  (TSB,  Difco).  The  cells  were 
centrifuged  (3000  g  at  room  temperature  for  15  min)  and  washed  3  times  with  sterile  phosphate  bu#ered  saline 
(PBS),  pH  7·2.  The  bacterial  suspension was adjusted to an optical density of 0·5 at a wave length of 540 nm, which 
had  been  determined  to  correspond  to  about  108  colony  forming  units  (CFU)  ml  1.  The  CFU  of  the  bacterial 
suspension was counted exactly by the spread plate method on trypticase soy agar (TSA) plates. Formalin was added 
to  the  bacterial  suspension  at  a final concen- tration of 0·2%. They were fixed overnight at 25 C and washed 3 times 
with PBS. 
Catfish  were  injected  intraperitoneally  with  200  μl  of  vaccine  (1  109  bacteria  ml  1) of either PPD 134/91 or L37 
in Freund’s complete adjuvant (FCA, ICN Biomedicals Company). They were similarly boostered 2 weeks later. For 
the  control  group,  200  μl  PBS  and  FCA  mixture  was  similarly  injected.  Antiserum  samples  for  antibody  titration 
were  obtained  from  blood  collected  via  the  caudal  vessel  at  7,  14,  20,  28  and  35  days  after  the  initial  vaccination. 
Blood  samples were allowed to clot for 1h at 25 C. All the antisera and control sera were separated by centrifugation 
and then stored at 30 C. 
In  the experiments to determine the bactericidal and opsonization of the specific antiserum, fish were killed 28–35 
days  after the initial vaccination. The serum samples from the control and vaccinated fish were used immediately for 
bactericidal activity, opsonization and agglutination tests. 
 
PROTECTION AGAINST AEROMONAS HYDROPHILA 59 
AGGLUTINATING ANTIBODY ASSAY 
Antibody  titres  against  A.  hydrophila  strains  were  determined  by aggluti- nation tests in 96-well microtitre plates 
(Sigma)  as  described  by  Roberson  (1990).  Serum  samples  (50  μl  each)  were  serially  diluted  in  PBS  and  50  μl 
formalin-killed  A.  hydrophila  (4  109  cells  ml  1)  was  added  to  each  well  and  thoroughly  mixed.  Plates  were 
incubated  at  room  temperature  overnight  prior  to  examination  for  agglutination. The antibody titres were expressed 
as the reciprocal of the highest serum dilution giving positive agglutination. 
SERUM BACTERICIDAL ASSAY 
The  serum  bactericidal  activity  was  determined  according  to  Rainger  &  Rowley  (1993).  The  bacterial  cultures 
were  pelleted  (3000  g,  15  min)  and  washed  3  times  with  sterile  PBS.  The  bacterial  suspension  was  adjusted  to  an 
optical  density  of  0·5  at  540  nm  (about  108  CFU  ml  1).  A  volume  of  100  μl  bacterial  suspension  and  900  μl fresh 
antiserum  or  control  serum  were  mixed  in sterile eppendorf tubes. The control groups consisted of bacterial suspen- 
sion  and  PBS  alone.  They  were  incubated  at  25  C  for  1  h,  and  subsequently,  all  incubation  mixtures  were  used  to 
determine  the  CFU  ml  1  by  the  spread  plate  method  on  TSA.  The  bactericidal activities of the sera were expressed 
as percentages of the CFU in PBS control groups. 
PHAGOCYTE ISOLATION 
Phagocytes  were  isolated from the head kidney of naive catfish and purified following the procedure of Secombes 
(1990).  Briefly,  each  head  kidney  was  pushed  through  a  100  μm  steel  mesh  to  prepare  a  cell  suspension  in  L-15 
medium  (Leibovitz,  Sigma).  The  resultant  cell  suspension  was  layered  over  a  34–51%  Percoll density gradient and 
centrifuged  at  400  g  for  35  min  at  4  C.  The  band  of  the  cells  at  the  34–51%  interface  was  collected,  washed  and 
counted  by  a  Coulter  counter  (Coulter  Electronic  Ltd.).  The  cell  suspension  was  then  adjusted  to  4  106  cells  ml 1. 
One  ml  of  the  cell  suspension  was  allowed  to  adhere  to  24-well  microtitre  plates  (Falcon  Laboratories)  supple- 
mented  with  L-15  medium  and  0·1%  heat-inactivated  foetal  calf  serum  (FCS,  Gibco). After 1 h incubation at 25 C, 
the  phagocytes  were  then  purified  by  removal  of  non-adherent  cells  and  washed  3  times  with Hank’s balanced salt 
solution  (HBSS,  Sigma).  The  remaining  phagocyte  monolayers  were  maintained  in  supplemented  L-15  medium 
before use. 
PHAGOCYTOSIS AND INTRACELLULAR REPLICATION ASSAY 

The  assays  for  phagocytosis,  opsonization  and  intracellular  replication  in  cultured  catfish  phagocytes  were 
performed  by  the  methods  of  Leung  et  al.  (1995b)  with  slight  modifications.  A  volume  of  100  μl  washed  A. 
hydrophila  culture  in  HBSS  (108  cells  ml  1)  was  mixed  with  900  μl serum from vaccinated and control catfish and 
incubated  for  30  min  at  25  C  before  adding  50  μl  of  the  bacterial  mixture  to  each  microtitre  well  containing  a 
phagocyte monolayer. Plates were incubated for 30 min and then the monolayers washed 3 times with 
 
60 Z. YIN ET AL. 
HBSS.  Fresh  L-15  medium  containing  gentamycin  (100  μg  ml  1)  was  added  onto  the  monolayers  of  phagocytes 
which  were  incubated  for  another  30  min.  After  the  gentamycin  treatment,  phagocytes  were  washed  3  times  with 
HBSS  and  incubated in L-15 medium supplemented with 0·1% heat-inactivated FCS. The intracellular population of 
bacteria  in  the  phagocytes  was determined at 0 and 3 h after the last wash by counting the CFU in each well after all 
the  phagocytic  cells  were  lysed  by  1%  Triton.  In  order  to  determine  the  e#ects  of  the  opsonization  activities on A. 
hydrophila viabilities, the intracellular bacterial population at 0 h was determined. The intracellular replication of the 
opsonized  bacteria  was  obtained  by  comparing  the  di#erence  in  intracellular  bacterial  population  of  A.  hydrophila 
between 0 h and 3 h. 
CELL CULTURE AND INVASION ASSAY 
Virulent  bacteria  (PPD  134/91,  PPD  122/91)  were  cultured  by  the  methods  as  described  in  ‘phagocytosis  and 
intracellular  replication assay’. A 100-μl volume of the bacterial suspension (108 CFU ml 1) was incubated with 900 
μl  of  variously  diluted  antiserum  (against  PPD  134/91)  at  25  C  for  30  min. Antisera which were pre-absorbed with 
pellets  of  bacterial  cells  of the homologous virulent strain (PPD 134/91) or serum from the control fish were used as 
the controls. 
Epithelioma  papulosum  of  carp,  Cyprinus  carpio  (EPC)  (Wolf  &  Mann,  1980)  were  seeded  into  each  well  of  a 
24-well  tissue  culture  plate  (Falcon  Laboratories). Cells were grown in Eagle Minimum Essential Medium (EMEM, 
Sigma) containing Hank’s salts, 10m 
M 
Hepes (pH 7·3), 2m 
M glutamine, 0·23% 
atmosphere for NaHCO 3 days. 3 
Thereafter, and 10% heat-inactivated 50 μl FCS at 25 C in 5% of the reaction mixture of CO 
the 2 
bacteria  and  serum  was  added  to  each  well  containing  a  monolayer  of  EPC  cell  culture.  The  infection process was 
allowed  to  continue  for  30  min  at  25  C.  The  inoculum  was  then  removed  and  each  well  was  washed  3  times  with 
HBSS.  After  the  washings,  each  well  was  overlaid  with  1ml  of  EMEM  containing  heat-inactivated  FCS, 
L-glutamine,  Hepes and gentamycin (100 μg ml 1). This was to kill any extracellular bacteria that had not penetrated 
EPC  cells  and  were  not  removed  during  the  washings.  The culture plates containing this overlay solution were then 
incubated for 30 min at 25 C. The medium was then removed and plated onto TSA to determine the progeny number 
of  gentamycin-resistant  bacteria.  The  wells  were  washed  5  times  with  HBSS.  The monolayer of EPC cells infected 
by  each  strain  was  then  lysed  with  1%  Triton  X-100  for  5  min  and  the  CFU  in  each  well  were  counted  on  TSA 
plates. 
CHALLENGE PROCEDURE 
Prior  to  the  challenge,  A.  hydrophila (PPD 134/91 strain) cells were cultivated, washed and treated with anti-PPD 
134/91  antiserum  or control serum as described in the ‘invasion assay’. The bacterial concentrations were confirmed 
in arrears by spreading dilutions of the bacteria on the TSA plates. 
 
PROTECTION AGAINST AEROMONAS HYDROPHILA 61 
These  sera-treated  bacterial  preparations  were  adjusted  approximately  to  three  concentrations  of  2·5  105,  2·5  106 
and 2·5 107 cells ml 1 and used for challenge. 
To  assess  whether  protection  was  conferred  by  the  specific  antiserum,  the  following challenge experiments were 
carried  out  in  two  sets of naive catfish and one set of vaccinated catfish. The fish of the latter group were vaccinated 
against  A.  hydrophila  (PPD  134/91  strain)  as  described  above  and  maintained  at  23–26  C  for  28–35  days  before 
challenge.  The  antiserum  titres  against  PPD  134/91  of  these  vaccinated  fish  ranged  from  5120  to  20  480.  For 
challenge  test,  every  set  containing  three  groups  of  5  catfish  each  was  intramuscularly  injected  with  0·1  ml 
serum-treated  bacteria. The mortalities were recorded for 7 days. The LD50 values were calculated by the method of 
Reed & Muench (1937). The experiment was repeated once. 
STATISTICAL ANALYSIS 
All the data were analyzed using Student’s t-test. A value of P<0·05 was considered to be significant. 
III. Results 
SERUM ANTIBODY TITRE AND BACTERICIDAL ACTIVITY 
The  time  kinetics  of  the  agglutinating  antibody  response  against  A.  hydrophila  strains  (PPD  134/91,  L37)  in the 
sera  of  catfish  were  determined  (Figs  1  &  2).  From the 7th day after vaccination, fish displayed a humoral response 
which peaked at 28th day and maintained a significantly high level until 35 days post-vaccination. 
The  antiserum  of  fish  at  28–35  days  post-vaccination  did  not  show  signifi-  cant  bactericidal  activity  against  the 
virulent  strain  PPD  134/91  (Table  1).  Indeed,  the  virulent  strain  proliferated  in  all  sera  compared  to  the  PBS 
controls.  However,  the  antiserum  from  the  fish  vaccinated  against  the  aviru-  lent  strain  L37  caused  a  significant 
reduction  in  growth  of  the  avirulent  strain  (P<0·05)  compared  to  those  treated  with  the  control  serum  of  the  non- 
vaccinated fish or antiserum against the serologically di#erent virulent strain (PPD 134/91) (Table 1). 
OPSONIZATION AND INTRACELLULAR REPLICATION 
The  control  serum  and  the  antiserum  (against  PPD  134/91)  were  used  to  opsonize  two  serologically  di#erent 
virulent  strains  (PPD  134/91  and  PPD  122/91).  The  control  serum  was  pooled  from  several  naive  catfish  as 
described  above.  The  agglutinating  titres  of  the  control  serum  against  the  two  virulent  strains  were  lower  than  32. 
The  specific  antiserum  against  PPD  134/91  was  collected  from  several  catfish  which  were  vaccinated  as described 
above. The antiserum titres against PPD 134/91 (the homologous strain) were higher than 10 240 while those against 
the serologically di#erent strain PPD 122/91 were lower than 32. 
 
62 Z. YIN ET AL. 
16 
n i a r t s 1 9 / 4 3 1 
12 
D P P t s n i a g a e r t i t y d o b i t n a 
8 
4 
g o L 
0 
10 20 30 Time after injection (days) 
Fig.  1  Changes  in  agglutinating  antibody  titres  in  the  serum  of  catfish  after  intraperi-  toneal  injection  of  formalin-killed  A. 
hydrophila  (strain  PPD  134/91)  in  Freund’s  Complete  Adjuvant  (FCA).  For  control  serum  catfish  were  injected  with  PBS  and 
FCA only. Values are mean 
S.E 
40 
. of triplicates. — —, vaccinated; — —, control. 
Bacteria  which  were  opsonized  with  heat-inactivated  sera  from  control  and  vaccinated  fish were all found inside 
the  phagocytes.  However,  the  intra-  cellular  population  of  inactivated  antiserum-opsonized  bacteria  was  signifi- 
cantly  higher  than  that  of  bacteria  opsonized  with  the  inactivated  control  serum  (Groups  I  &  II  in  Fig.  3).  Similar 
results  were  encountered  when  fresh  specific  antiserum  against  the  PPD 134/91 were used as compared to the fresh 
control  serum  (Fig.  3).  This  indicated  that  the  antibodies  exhibited  a  strong  opsonization  e#ect.  However,  the 
significant  di#erence  in  intracellular  bacterial  population  of  the  virulent  strains  PPD  134/91  between  0  h  and  3  h 
showed  that  engulfed  pathogens  were not killed and they multiplied within the phagocytes (Fig. 3). It should also be 
pointed  out  that  no  increase  of  phagocytic  activity  was  observed  when  virulent  PPD  122/91  was  treated  with  the 
antiserum against PPD 134/91. 
INHIBITION OF BACTERIAL INVASION 
Specific  antiserum  against  the  virulent  strain  (PPD  134/91)  was  added  to  the  bacterial  suspension  and incubated 
with  EPC  cells.  The  virulent  strain  (PPD  134/91)  treated  with  specific  antiserum  with  a  titre  higher  than  1280 lost 
their  ability  to  penetrate  the  EPC  cells  (Fig.  4).  On  the  other  hand,  when  another  serologically  di#erent  virulent 
strain PPD 122/91, was treated with the antiserum against PPD 134/91, no loss of invasive ability of the bacteria was 
observed even though the agglutinating titre (against PPD 134/91) used was 10 240. 
 
PROTECTION AGAINST AEROMONAS HYDROPHILA 63 
16 
n i a r t s 7 3 1 t s n i a g a e r t i t y d o b i t n a g o L 
12 
8 
4 
0 
10 20 30 Time after injection (days) 
Fig.  2  Changes  in  agglutinating  antibody  titres  in  the  serum  of  catfish  after  intraperi-  toneal  injection  of  formalin-killed  A. 
hydrophila (strain L37) in FCA. For control serum, catfish were injected with PBS and FCA only. Values are mean 
S.E. 
of triplicates. — —, vaccinated; — 
—, control. 
Table 1. E#ects of sera from vaccinated (Test) and non-vaccinated (Control) fish on the growth of virulent (PPD 134/91) and 
avirulent (L37) strains of A. hydrophila 
Sera (Fish)* N=5 
Test strains 
Agglutination titres 
Survival ability* 
Control PPD 134/91 8–128 210 8·5 (non-vaccinated) L37 8–64 0·01 0·0002** 
Test PPD 134/91 5120–20480 214 7·6 (vaccinated against PPD 134/91) L37 32–64 0·01 0·0004** 
Test PPD 134/91 32–128 216 5·7 (vaccinated against L37) L37 5120–10240 0·0002 0·00002** 
*Percentage of growth compared with growth in PBS controls. Mean values with 
S.E. **Significant di#erence (P<0·05) 
between groups of specific antiserum and other sera. 
CHALLENGE EXPERIMENTS 
The  LD50  values of A. hydrophila which were pre-mixed with either antiserum or control serum were determined 
in  two  sets  of  naive  fish  and  one  set of vaccinated fish. The LD50 values of the bacteria in both naive fish sets were 
similar (Table 2). However, a somewhat higher LD50 value of the control 
 
64 Z. YIN ET AL. 
200 ) U F C 0 0 1 
150 
: PPD 134/91 at 0 h 
c 
: PPD 134/91 at 3 h : PPD 122/91 at 0 h 
( l l e w r e p n o i 
100 
a 
e 
a 
0 
I 
II III IV Group (opsonized by various sera) 
Fig.  3  Opsonization  of  virulent  strains  (PPD  134/91  and  PPD  122/91)  of  A.  hydrophila  with  specific  antiserum  against  PPD 
134/91 and the growth of the engulfed bacteria within the phagocytes. Values are mean 
S.E 
b 
c 
t a l u p o p 
b 
d 
l a i r e t c a B 
50 
.  of  triplicate. a,b,c: The same letters indicate that there was a significant 
di#erence  (P>0·05)  between  the  two  groups;  d,e:  no  significant  di#erence  (P<0·05)  between  the  two  groups.  Group:  I. 
heat-inactivated control serum; II. Heat-inactivated antiserum; III. control serum; IV. antiserum. 
serum-treated bacteria was encountered in the vaccinated fish as compared to those in the other two sets of naive 
fish. 
IV. Discussion 
Nowadays,  many  commercially  available  bacterins  are  used  for  vaccination  against  various  fish  diseases 
(Newman,  1993).  However,  little  is  known  about  how  the  humoral  mechanisms  are  involved  in  the  immune 
protection  against  the  bacterial  infections.  There  are  many  conflicting  reports  regarding  the  protective  role  of  fish 
specific  agglutinating  antibody  (Dorson,  1981).  Some  indicated  that  there  is  no  correlation  between  protection and 
the  level  of  serum  specific  antibody  (McCarthy  et  al.,  1983;  Baba  et  al.,  1988).  In  mammals,  specific  antibody  is 
principally  dedicated  to  the  recognition,  inhibition  and  elimination  of  invading  organisms.  However,  for  fish,  all 
these functions remain to be clarified. 
The complement system plays a crucial role in humoral defense against microbial pathogens (Taylor, 1988). It has 
been  well-established  that  anti-  bodies  in  mammals  are  able  to  promote,  in  vitro,  killing  of  some  Gram-negative 
bacteria  in  the  presence  of  complement  (Heddle & Rowley, 1975). In fish, similar results have also been reported in 
rainbow  trout,  Oncorhynchus  mykiss  against  some  Aeromonas  salmonicida  and  Vibrio anguillarum strains (Harrell 
et  al.,  1975;  Rainger  &  Rowley, 1993). However, Ourth & Wilson (1981) stated that bactericidal activity of channel 
catfish (Ictalurus punctatus) antiserum 
 
PROTECTION AGAINST AEROMONAS HYDROPHILA 65 
100 l l e w r e p 
80 
: PPD 134/91 : PPD 122/91 s l l e c C P E n i 
) U F C 
60 
n o i t a l u p o p l 
0 1 ( 
40 
a i r e t c a B 
20 
0 
I 
II III 
IV V VI Group 
Fig.  4  Inhibition  of  infectivity  of  A. hydrophila (strains PPD 134/91 and PPD 122/91) towards EPC cells. The specific antiserum 
used  was  against  strain  PPD  134/91  only.  The  virulent  bacteria  were  incubated  with  either  antiserum,  absorbed  antiserum  or 
control  serum  at  25  C  for  30  min.  Residual  infectivity  was  determined  by  counting  the  CFU  in  EPC  cells  per  well.  Values  are 
mean 
S.E 
.  of  triplicates.  Group:  I.  0,  adsorbed  serum;  II.  1:32,  control 
serum; III. 1:320, antiserum; IV. 1:640, antiserum; V. >1:1280, antiserum; VI. 1:10 240, antiserum. 
Table 2. The susceptibility of fish to Aeromonas hydrophila (PPD 134/91) pre-treated with either control serum or specific 
antiserum. The value of LD50 was used as an indicator for susceptibility of fish to infection. N=30 
Fish 
Sera mixed with PPD 134/91 and used for challenge 
LD50 value 
Naive  (non-vaccinated)  Control  serum  1·5  106  Naive  (non-vaccinated)  Antiserum  1·9  106  Vaccinated  against  PPD  134/91 
Control serum 5·0 106 
remained  nearly  constant  and  did  not  increase  even  with  an  increase  in  agglutination  titre.  In the present study, the 
bactericidal  activity  of  the  specific antisera against virulent and avirulent strains of A. hydrophila were di#erent. For 
the  serum-sensitive  avirulent  strain  (L37,  Leung  et  al.,  1995a), specific antiserum against L37 significantly reduced 
its  growth  as  compared  to  the  non-immune  serum  of the control fish. In contrast, there was no significant di#erence 
in  bactericidal  activity  of  the  antiserum  or  control  serum  on  the  serum-resistant virulent strain (PPD 134/91, Leung 
et  al.,  1995a).  It  has  to  be  pointed  out  that  killing  of  various  strains  of  A.  hydrophila  by  normal  serum  was almost 
abolished  after  the  serum  was  heated  at  47  C  for  30  minutes (Leung et al., 1995a). Therefore, the findings on strain 
L37  suggested  that  the  fish  specific  antiserum  does  have  the  ability  to  enhance  the killing e#ect of the complement 
system. However, this bactericidal activity of the antiserum may 
 
66 Z. YIN ET AL. 
depend  on  the  target  strain,  because  the  virulent  strains  (PPD  134/91)  can  avoid  the  complement-mediated  killing. 
This  character  has  also  been  reported  by  Merino  et  al.  (1991)  and  Merino  et  al.  (1994)  in  certain  strains  of  A. 
hydrophila  and  A.  salmonicida.  Therefore,  resistance  of  some  virulent  A.  hydrophila  strains  to  the  bactericidal 
activity of serum appears to be an important pathogenic factor to avoiding elimination from the host. 
The  phagocytic  process  is  the  principal  mechanism  for  destruction  of  extracellular  bacterial  pathogens  in 
mammals  (Cohn,  1978).  It  is  also  generally  agreed  that  specific  antibody  can  activate  macrophages  to  mediate 
antibody-  dependent  cell-mediated  cytotoxicity (ADCC) (Adams & Hamilton, 1984). Many studies have shown that 
fish  phagocytes  have  potent  bactericidal  and  larvacidal  activity.  However,  there  is  a  considerable  number  of 
conflicting  reports  regarding  the  opsonic  e#ect  of  antibody  and  the  presence  of  ADCC-  like  activity  in  teleost  fish 
(Wrathmell  &  Parish,  1981;  Pettey  &  McKinney,  1988;  Kaige  et  al.,  1990;  Whyte  et  al.,  1990;  Secombes  & 
Fletcher,  1992).  The  use  of  specific  fresh  antiserum  to  opsonize  virulent  bacteria  in  vitro  demonstrated  that  an 
enhanced  phagocytosis  of  homologous  bacteria  occurred  as compared to control serum and a similar result was also 
obtained  using  heat-inactivated  specific  antiserum.  This  indicates  that  the  enhancement  in  phagocytosis  was 
attributed  to  the specific antibodies against the bacteria. However, the intracellular killing activity by the presence of 
specific  antibodies  showed  no  significant  di#erence  from  those  of  the  non-immune  sera.  Bacteria  like 
Mycobacterium.  Edwardsiella,  Yersinia  and  Salmonella  are  also  known  to  be  capable  of  resisting  intracellular 
killing  by  macrophages  (Armstrong & D’Arey Hart, 1971; Finlay & Falkow, 1989; Waterstrat et al., 1991; Leung & 
Finley, 1991; Secombes & Fletcher, 1992). 
The  ability  of  bacteria  to  attach  and  penetrate  epithelial  cells seems to have a crucial impact on the establishment 
of  the  indigenous  bacterial  flora.  Therefore,  observation  of  the  interaction  between  pathogens  and  epithelial  cell 
cultures  is  one  of  the  in  vitro  models  explored  as  a  method  for  studying  the  pathogenicity  of  bacteria  and  for 
measuring  protection  against  the  experimen-  tal  infection  following  vaccination.  The  in  vitro  neutralization  of 
infectivity  is  potentially  an  important  and  versatile  assay  that  can  be  used  to  characterize  host  humoral  immunity 
(Lawson  et  al.,  1985;  Schiemann  &  Nelson,  1988;  Janda  et al., 1991). Lawson et al. (1985) demonstrated that some 
strains  of  A.  hydrophila  were  invasive  to  Hep-2  cells.  In  this  in  vitro  study,  we  have  also  shown  that both virulent 
strains  of  A.  hydrophila  (PPD  134/91,  PPD  122/91)  can  invade  EPC  cells.  However,  the  fish  specific  antiserum 
against  virulent  strain  PPD  134/91  could  e#ectively  prevent  the  invasion  of  the  same  A.  hydrophila  strain  into  the 
EPC  cells.  On  the  other  hand,  the  PPD  122/91  (a  di#erent  serogroup  strain,  Leung  et  al., 1995a) when treated with 
the  above  antiserum  showed  no  loss  of  invasive  ability  to  enter  the  epithelial  cells.  This  indicates  that  the  specific 
antibody  might  play  an  important  role  in  preventing  the  virulent  strain  PPD  134/91  from  entering  the  EPC  cells. 
Since the specific antiserum was not heat-inactivated, it is not known to what extent comple- ment is involved in this 
inhibitory  process.  It  has  been  well-established  that  the  surface  of  fish  is  covered  with  a  mucus  layer,  varying  in 
thickness and forming a barrier to pathogens. Dorson (1981) showed that immunoglobulins 
 
PROTECTION AGAINST AEROMONAS HYDROPHILA 67 
were  present  in  this  mucous  secretion  that  had  a  weak  agglutinating  activity.  Therefore,  it  is logical to suggest that 
the  specific  antibody  in  the  mucus  might  play  an  important  role  in  preventing  A.  hydrophila  from  attaching  and 
penetrating  the  epithelium  of  the  fish  gills,  skin  and  fins.  Unfortunately,  there  is  no  ideal  waterborne  challenge 
model for A. hydrophila that can be used to test this assumption in fish. 
In  conclusion,  the  present  in  vitro  study  indicates  that  the  role  of  specific  antibody  might  e#ectively  kill  the 
serum-sensitive  strain  of  A.  hydrophila  (L37)  by  activation  of  the  complement  lytic  system.  Specific  antibody was 
unable  to kill a virulent strain but was able to opsonize the bacteria and enhance phagocytosis. However, the virulent 
strain  (PPD  134/91)  was  able  to  survive  within  macrophages  even  when  they  were  treated with specific antiserum. 
On  the  other  hand,  specific  antiserum  prevented  the  virulent  A. hydrophila, but not a serologically di#erent virulent 
strain, from penetrating carp epithelial cells in vitro. 
This work was supported by a research grant from the National University of Singapore. 
References 
Adams, D. O. & Hamilton, T. A. (1984). The cell biology of macrophage activation. 
Annual Review of Immunology 2, 283–318. Ainsworth, A. J. & Dexiang, C. (1990). Di#erences in the phagocytosis of 
four bacteria by channel catfish neutrophils. Development and Comparative Immunology 14, 201–209. Angka, S. L., Lam, T. J. 
& Sin, Y. M. (1995). Some virulence characteristics of Aeromonas hydrophila in walking catfish (Clarias gariepinus). 
Aquaculture 130, 103–112. Armstrong, J. A. & D’Arey Hart, R. (1971). Response of cultured macrophages to Mycobacterium 
tuberculosis with observations on fusion of lysosomes with phagosomes. Journal of Experimental Medicine 134, 713–740. Baba, 
T., Imamura, J., Izawa, K. & Ikeda, K. (1988). Cell-mediated protection in carp, Cyprinus carpio L., against Aeromonas 
hydrophila crude lipopolysaccharide. Journal of Fish Diseases 11, 171–178. Cohn, Z. (1978). The activation of mononuclear 
phagocytes: fact, fancy and future. 
Journal of Immunology 121, 813–816. Dorson, M. (1981). Role and characterization of fish antibody. Developments in 
Biological Standardization 49, 307–319. Finlay, B. B. & Falkow, S. (1989). Common themes in microbial pathogenicity. 
Microbiological Review 53, 210–230. Harrell, L. W., Etlinger, H. M. & Hodgins, H. O. (1975). Humoral factors 
important in resistance of salmonid fish to bacterial disease. I. Serum antibody protection of rainbow trout (Salmo gairdneri) 
against vibriosis. Aquaculture 6, 211–219. Heddle, R. J. & Rowley, D. (1975). Dog Immunoglobulins II. The antibacterial 
properties of dog IgA, IgM and IgG antibodies to Vibrio cholerae. Immunology 29, 197–208. Janda, J. M., Abbott, S. L. & 
Oshiro, L. S. (1991). Penetration and replication of 
Edwardsiella spp. in Hep-2 cells. Infection and Immunity 59, 154–161. Kaige, N., Miyazaki, T. & Kubota, S. S. (1990). Opsonic 
e#ect of antiserum and complement on phagocytosis by macrophages from the peritoneal cavity of the Japanese eel Anguilla 
japonica. Journal of Fish Biology 37, 199–204. 
 
68 Z. YIN ET AL. 
Krovacek, K., Faris, A., Ahne, W. & Mansson, I. (1987). Adhesion of Aeromonas hydrophila and Vibrio anguillarum to fish cells 
and to mucus-coated slides. FEMS Microbiology Letters 42, 85–89. Lawson, M. A., Burke, V. & Chang, B. J. (1985). Invasion 
of HEp-2 cell by fecal isolates 
of Aeromonas hydrophila. Infection and Immunity 47, 680–683. Leung, K. Y. & Finlay, B. B. (1991). Intracellular 
replication as essential for the virulence of Salmonella typhimurium. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88, 
11470–11474. Leung, K. Y., Lam, T. J. & Sin, Y. M. (1995a). Serum resistance is a good indicator for virulence in Aeromonas 
hydrophila strains isolated from diseased fish in Southeast Asia. Journal of Fish Diseases (in press). Leung, K. Y., Low, K. W., 
Lam, T. J. & Sin, Y. M. (1995b). Interaction of the fish pathogen Aeromonas hydrophila with tilapia phagocytes. Journal of Fish 
Diseases (in press). McCarthy, D. H., Amend, D. F., Johnson, K. A. & Bloom, J. V. (1983). Aeromonas salmonicida: 
determination of an antigen associated with protective immunity and evaluation of an experimental bacterin. Journal of Fish 
Diseases 6, 155–174. Merino, S., Camprubi, S. & Tomas, M. (1991). The role of lipopolysaccharide in complement-killing 
Aeromonas hydrophila strains of serotype O:34. Journal of General Microbiology 137, 1583–1590. Merino, S., Alberti, S. & 
Tomas, M. (1994). Aeromonas salmonicida resistance to 
complement-mediated killing. Infection and Immunity 62, 5483–5490. Newman, S. G. (1993). Bacterial vaccines for fish. 
Annual Review of Fish Diseases 1, 
145–185. Ourth, D. D. & Wilson, E. A. (1981). Agglutination and bactericidal responses of the channel catfish to 
Salmonella paratyphi. Developmental and Comparative Immunology, 261–270. Pettey, C. L. & McKinney, E. C. (1988). 
Induction of cell-mediated cytotoxicity by shark 
19s IgM. Cellular Immunology 111, 28–38. Rainger, G. E. & Rowley, A. F. (1993). Antibacterial activity in the serum 
and mucus of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, following immunization with Aeromonas salmonicida. Fish & Shellfish 
Immunology 3, 475–482. Reed, L. J. & Muench, H. (1937). A simple method of estimating fifty per cent endpoints. 
The American Journal of Hygiene 27, 493–497. Roberson, B. S. (1990). Bacterial Agglutination. In Techniques in Fish 
Immunology (J. S. Stolen, G. C. Fletcher, D. P. Anderson, B. S. Roberson & W. B. van Muiswinkel, eds), pp. 137–154. Fair 
Haven, NJ: SOS Publications. Schiemann, D. A. & Nelson, C. M. (1988). Antibody inhibition of Hela cell invasion by 
Yersinia enterocolitica. Canadian Journal of Microbiology 34, 52–57. Secombes, C. J. (1990). Isolation of salmonid 
macrophages and analysis of their killing activity. In Techniques in Fish Immunology (J. S. Stolen, T. C. Fletcher, D. P. 
Anderson, B. S. Roberson & W. B. van Muiswinkel, eds), pp.137–154. Fair Haven, NJ: SOS Publications. Secombes, C. J. & 
Fletcher, T. C. (1992). The role of phagocytes in the protective 
mechanisms of fish. Annual Review of Fish Diseases 2, 53–71. Taylor, P. W. (1988). Bacterial resistance to 
complement. In Virulence mechanisms of bacterial pathogens. (J. A. Roth, ed.), pp. 107–120. Washington DC: American Society 
for Microbiology. Waterstrat, P. R., Ainsworth, A. J. & Capley, G. (1991). In vitro responses of channel catfish, Ictalurus 
punctatus, neutrophils to Edwardsiella ictaluri. Developmental and Comparative Immunology 15, 53–63. Whyte, S. K., Chappell, 
L. H. & Secombes, C. J. (1990). Protection of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Richardson), against Diplostomum 
spathaceum (Digenea): the role of specific antibody and activated macrophages. Journal of Fish Diseases 13, 281–291. Wistreich, 
G. A. & Lechtman, M. D. (1988). Microbiology, 6th edition. New York: 
Macmillan Publishing Company. 
 
PROTECTION AGAINST AEROMONAS HYDROPHILA 69 
Wolf, K. & Mann, J. A. (1980). Poikilotherm vertebrate cell lines and virus: a current 
listing for fishes. In Vitro 16, 168–179. Wrathmell, A. B. & Parish, N. M. (1981). Cell surface receptors and immune 
mechanisms in an elasmobranch fish Scyliorhinus canicula. In Aspects of Developmental and Comparative Immunology I (J. B. 
Solomon, ed.) pp. 463–464. Oxford: Pergamon Press.