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01 julho - 2007

A revista do
Microbiologista.
informativo sbm • ano 1 • www.sbmicrobiologia.org.br

Um novo enfoque em
Microbiologia.

Consensos
Testes de
Sensibilidade
In Vitro a
Antifúngicos
2006

SBM 50 anos
Prof. Dr. Luiz
Rachid Trabulsi
Diretoria
Biênio 2006-2007

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Profa. Dra. Marina Baquerizo Martinez
presidente@sbmicrobiologia.org.br

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Profa. Dra. Marisa Landgraf
1º Secretário
Prof. Dr. Jorge Luís de Melo Sampaio
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Profa. Dra. Marcia Alves Pinto Mayer
2º Tesoureiro:
Prof. Dr. Alexandre Soares Rosado
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SBM 2006-2007
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Editorial Índice

Ciência in Foco
Prezado METANO
Mudanças Climáticas Globais
Microbiologista, e a Microbiologia. . . . . . . . . . . . . . . 4

Temos o prazer de trazer até vocês uma nova publicação da Sociedade Brasileira de
EPIDEMIA DE AIDS
Microbiologia com escopo principal de divulgação científica, Microbiologia in foco. E SEGURANÇA
Será uma publicação trimestral com tiragem inicial de 2.000 exemplares, que serão dis- TRANSFUSIONAL:
tribuídos para Departamentos de Universidades e Faculdades, Indústrias, Laboratórios Grupo de hemocentros
e outros serviços ligados à Microbiologia. brasileiros se une ao
A Revista será de informação e divulgação exclusivamente sobre bactérias, fungos e
vírus nas várias áreas de abrangência da Microbiologia e várias seções comporão, em
Retrovirus Epidemiology
princípio, o corpo da revista: Donor Study . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Seção 1: Ciência in Foco - Artigos de informação sobre temas relevantes
Seção 2: Resenhas - Comentários sobre livros. TRANSFORMAÇÃO
Seção 3: Resumos comentados de trabalhos científicos relevantes. BACTERIANA:
Seção 4: SBM 50 anos - Homenagens a profissionais com destaque na fundação da
SBM e no desenvolvimento da Microbiologia. Correspondências históricas. . . . . 13
Seção 5: Ensino em Microbiologia.
Seção 6: Departamentos in Foco - Departamentos em destaque: Notícias de inte- RNA INTERFERÊNCIA:
resse da Microbiologia A nova corrida do ouro . . . . . . . . . 17
Seção 7: Leitor in Foco - Espaço aberto ao leitor.
Seção 8: Empresas in Foco - Informes publicitários: Espaço destinado às Empresas
Esse primeiro número foi elaborado com sugestões de colegas próximos à diretoria SEGURANÇA DE
da SBM e os artigos incluídos são dos convidados que prontamente se dispuseram a ALIMENTOS:
colaborar. Novas ferramentas
Para os próximos números, esperamos e contamos com sua colaboração ativa, envi- de gestão dos riscos
ando sugestões, informações, enfim tudo que achar conveniente para divulgação.
Com mais esse canal de comunicação, a SBM espera promover e incentivar cada
microbiológicos . . . . . . . . . . . . . . . 22
vez mais a geração e disseminação de conhecimentos em Microbiologia.
Para o sucesso desta publicação, a SBM conta com a sua adesão: leia, critique, espa-
lhe a notícia, contribua com artigos, sugestões, informações, enfim tudo que achar perti-
Consensos
nente. Juntos, com certeza essa iniciativa da SBM terá o alcance e a penetração espe- TESTES DE
rada para que a Microbiologia seja divulgada nos mais diversos setores da comunidade SENSIBILIDADE IN VITRO
brasileira. A ANTIFÚNGICOS 2006 . . . . . . . 24
Escrevam para vgambale@usp.br ou taborda@usp.br .
Os Editores contam com vocês.
SBM 50 anos
Marina B. Martinez
PROF. DR. LUIZ
Presidente RACHID TRABULSI. . . . . . . . . . . 35
Walderez Gambale
Carlos P. Taborda Notícias in Foco . . . . . . 37
Editores
Agenda in Foco . . . . . . . 37
Expediente
Editores Editoração e Impressão:
Carlos Taborda Dolika Afa Artes Gráfica: (51) 3343.5533
SBM in Foco Walderez Gambale Diagramação: André Saboia
Revista da Sociedade Brasileira de
Microbiologia Tiragem: 2000 exemplares
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Vol.1, nº 1 (Julho, Agosto, Setembro) Prix Eventos
São Paulo:SBM,2007 Silvia Neglia - Diretora Responsabilidade editorial:
Fone/fax;51.32496164 Todos os artigos assinados são de
Periodicidade Trimestral
microbiologia@prixeventos.com.br responsabilidade dos respectivos autores.

03
Ciência in Foco

METANO
Mudanças Climáticas Globais
e a Microbiologia.
Vivian H. Pellizari *,
Cristina R. Nakayama,
Ana Carolina V. Araújo,
Rhavena G. Liotti e
Rosana F. Vazoller
Laboratório de Microbiologia Ambiental,
Departamento de Microbiologia,
Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade de São Paulo.
* vivianp@usp.br.

Culminando com a liberação da quarta como nas adversidades e venturas conse- Lançar luz sobre a contribuição micro-
parte do Relatório do Painel Intergoverna- qüentes das modificações no equilíbrio de biana na composição e regulação de
mental de Mudanças Climáticas (IPCC) da ecossistemas. Um dos pontos focais das gases atmosféricos, revela muitos grupos
ONU, o debate sobre os impactos futuros mudanças climáticas, sem dúvida, refere- microbianos envolvidos com a geração de
associados à mudança climática nunca se à questão dos gases de efeito estufa gases, como fotossintetizantes, fermenta-
esteve tão em alta. Muitas destas mudan- (GEE). Os GEEs relacionam gases como tivos acidogênicos, sulfato-redutores, des-
ças, que incluem alterações na atmosfera, o metano, os óxidos de nitrogênio, os halo- nitrificantes, metanogênicos, metanotrófi-
oceano e ecossistemas terrestres, apesar metanos e o mais conhecido de todos, o cos, entre outros. Alguns deles são espé-
de fazerem parte da história natural do pla- dióxido de carbono. A contribuição bioló- cies bastante conhecidas no âmbito da
neta foram aceleradas pelos seres huma- gica na composição atmosférica é mar- Microbiologia Ambiental e Sanitária, e
nos. No entanto, pouco é lembrado sobre cante. Porém, sem hesitação, pode-se afir- possuem imensurável valor à Biotecnolo-
as contribuições microbianas para a ocor- mar que é a compreensão da microbiota gia aplicada ao Saneamento Ambiental,
rência ou solução destas alterações. Este envolvida na formação e consumo dos quer seja pelos processos clássicos do tra-
fato não é de difícil compreensão, sobre- gases, notadamente os de efeito estufa tamento anaeróbio de resíduos ou pelos
tudo ao considerarmos o reduzido conhe- (GEE), que fará surgir novas fronteiras do mais modernos como as notáveis práticas
cimento que possuímos em relação ao conhecimento sobre o aquecimento ter- in situ da biorremediação.
impacto da atividade antropogênica nas restre, mediante um exame microscópico Há alguns anos, o grupo de pesquisas
comunidades microbianas, bem como de eventos de extraordinário impacto a do Laboratório de Microbiologia Ambiental
sobre a diversidade microbiana ou micro- todo o Planeta. (LMA) do Departamento de Microbiologia
biodiversidade nos diferentes ecossiste- Desde a origem da vida na Terra os do Instituto de Ciências Biomédicas USP
mas do planeta. Entretanto, não restam microrganismos vêm modificando a com- vem dedicando-se à microbiologia envol-
dúvidas quanto à importância da atividade posição da atmosfera. O primeiro oxigênio vida com os GEEs, particularmente o gás
microbiana nas reações químicas que molecular foi produzido a 3.8 bilhões de metano. Iniciou seus trabalhos com o
ocorrem na superfície terrestre, em outras anos atrás pelas cianobactérias ou algas apoio do Programa Biota- FAPESP. Nessa
palavras, sobre o comando exercido pelos verde-azuladas. Com o acúmulo desse oxi- oportunidade, estruturou-se a área para
microrganismos nos ciclos biogeoquími- gênio, várias formas de vida surgiram, manipulação de organismos produtores e
cos. adaptadas principalmente a utilizar o oxi- consumidores de gases (Figura 1), o que
Os microrganismos são elementos gênio para otimizar seu metabolismo. A viabilizou os estudos sobre diversidade
chave nas mudanças climáticas globais, e presença do oxigênio na atmosfera permi- microbiana funcional em amostras de
compete também aos microbiologistas tiu também a formação da camada de ozô- áreas contaminadas do Sistema Estuarino
empreender investigações que gerem nio que passou a proteger a terra dos raios Santos-São Vicente e a constatação da
conhecimento sobre o papel desses seres ultravioleta contribuindo para a coloniza- geração do gás metano nos sedimentos e
vivos nas alterações do Planeta, bem ção da Terra. coluna d´água locais. Em conseqüência,

04
Figura 1. Visão geral da área de anaeróbios do Laboratório de Microbiologia Ambiental do
Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP.

elucidaram-se grupos procariontes anae- a presença dos grupos procariontes pro- O efeito estufa é conseqüente da ação
róbios degradadores de organoclorados dutores e consumidores desse GEE na desses gases que, em conjunto, impedem
sob metanogênese, além de complemen- região amazônica, possibilitando a inte- que a radiação infravermelha seja total-
tar as investigações de exploração tecno- gração do LMA no PRONEX-Rondônia do mente retransmitida da Terra para o espa-
lógica da atividade microbiana na área Departamento de Microbiologia do ICB- ço. Embora esse processo seja vital para a
estuarina conduzidas por pesquisadores USP. manutenção da temperatura no planeta, o
da Escola de Engenharia de São Carlos O enfoque desse artigo não pretende aumento na concentração dos GEEs
USP (NAKAYAMA, 2005; SAIA et al., cobrir todos os microrganismos envolvi- podem alterar os padrões de absorção e
2007). dos com os GEEs, mas buscar esclarecer reflexão da radiação infravermelha e, con-
Posteriormente, o grupo do LMA atu- um dos mais importantes grupos da natu- seqüentemente, resultar na elevação da
ando junto ao Programa Antártico Brasi- reza envolvidos com a produção do gás temperatura média da superfície terrestre,
leiro - Proantar, viabilizou em parceria com metano, bem como apontar algumas cu- com possível derretimento das calotas
o INPE- São José dos Campos - determi- riosidades sobre os organismos consumi- polares e o aumento do nível dos oceanos.
nações in situ do gás metano (Figura 2) e dores do metano, os metanotróficos. O metano, apesar de lançado em menor
detectou grupos metanogênicos e meta- O gás metano é um dos GEE prioriza- quantidade, tem um poder no aqueci-
notróficos na Baía do Almirantado dos em 1997 pelo Protocolo de Kyoto mento global superior ao causado pelo
(NAKAYAMA, 2006). Mais tarde, foi atra- (2004). Segundo Holmes (1999), nos últi- gás carbônico. Aliado a esse fato, o tempo
vés das investigações com amostras de mos 300 anos as emissões do gás metano de vida relativamente curto do metano na
aterros sanitários em estudos sobre barre- aumentaram aproximadamente 1% ao atmosfera, de 8 a 12 anos, estimula os
iras biológicas à GEE, que o grupo de pes- ano, sendo o potencial de absorção de radi- estudos tecnológicos e científicos em dire-
quisas confirmou sua competência no ação infravermelha pelo metano estimado ção à redução de sua emissão (USEPA,
estudo sobre fisiologia e identificação de em 21 equivalentes de CO2 (KIGHTLEY et 2006).
organismos consumidores do gás metano al., 1995; HANSON & HANSON, 1996; A produção do metano pode se dar
os metanotróficos (LIOTTI, 2007). O domí- BOECKX & CLEEMPUT, 2000), ou seja, tanto por processos biogênicos quanto abi-
nio dos métodos clássicos e moleculares ele é ao menos vinte vezes mais potente ogênicos. Cerca de ¼ da emissão total de
do tema “organismos envolvidos no ciclo que o dióxido de carbono (CO2), o gás metano na atmosfera é abiogênica, o que
do metano” estimulou as pesquisas sobre mais conhecido do efeito estufa. inclui fontes como extração, transporte,
distribuição e consumo de combustíveis
fósseis (ex.: fissura em tubulações, com-
bustão incompleta entre outros). As fontes
biogênicas de metano, resultantes da ati-
vidade de microrganismos pertencentes
ao Domínio Archaea, as arquéias metano-
gênicas, incluem tanto as naturais, quanto
aquelas geradas pela atividade antrópica.
Dentre as primeiras, podem-se citar os
sedimentos alagados (100-200
Tg1CH4/ano), os hidratos de metano, os
Figura 2. Cúpula para coleta de metano na interface oceano-atmosfera (a); junção
da cânula de saída da cúpula com a seringa utilizada para a amostragem do gás (b). solos congelados, os corpos de água
doce, os oceanos, os cupins e as combus-

1. Teragrama (Tg) = unidade métrica de massa igual a 1012 g ou 1megaton (um milhão de toneladas métricas). É uma unidade freqüentemente
empregada em ciência da atmosfera e outros contextos científicos nos quais grandes massas são consideradas.

05
tões espontâneas em ambientes secos
(USEPA, 2006). Como exemplos de ativi-
POLÍMEROS
dades humanas que levam a uma grande (proteínas, lipídios e polissacarídeos)

geração de metano devem-se mencionar


as atividades agropecuárias principal- 1

mente a criação de gado e os arrozais,


com respectivamente 65-100 TgCH4/ano e MONÔMEROS E OLIGÔMEROS Hidrólise e
25-150 TgCH4/ano, correspondendo de 15 fermentação -
a 45% das emissões antropogênicas e a 1 1 acidogênese
queima de biomassa e o tratamento de
lixo, especialmente os sistemas de aterros ÁCIDOS GRAXOS.
ÁLCOOIS etc.
sanitários (NAKICENOVIC & SWART,
2000; GARCIA et al., 2000), além de áreas
alagadas criadas pelo homem, como 4 4
Acetogênese
represas e hidrelétricas. Estima-se que as 5
H2 + CO2
emissões relacionadas a atividades huma- FORMIATO
ACETATO
nas são responsáveis por 60% da emissão
global desse gás para a atmosfera 2 3
(USEPA, 2006). A Tabela 1 apresenta Metanogênese
exemplos de fontes naturais e antropogê-
nicas, bem como quantidades de emissão CH4 + CO2

e consumo do metano no ambiente. Os


valores mostram que, no balanço final, há
Figura 3: Fluxo de carbono na degradação de matéria orgânica em
emissão de metano da ordem de 40 ambientes naturais. Os números ao lado das setas referem-se ao tipo de
Tg/ano, um resultado final oriundo das ati- microrganismo responsável pela realização do respectivo passo na degradação:
vidades antropogênicas. 1 - bactérias fermentadoras primárias, 2 - arquéias metanogênicas hidrogenotróficas,
3 - arquéias metanogênicas acetoclásticas, 4 - fermentadoras acetogênicas,
A produção biogênica do metano é 5 - homoacetogênicas.
comandada pelas arquéias metanogêni-
cas e constitui o passo final do fluxo de car-
bono em habitats anaeróbios como sedi- que se destacam aspectos importantes de lam a capacidade de oxidação da atmosfe-
mentos marinhos, de água doce, solos ala- pesquisa para a região, como o sistema cli- ra. Em estudos que relacionam a emana-
gados, ambientes geotermais, trato diges- mático, o ciclo biogeoquímico do carbono, ção do metano e a variação climática na
tivo de ruminantes etc. A conversão da a química e física da atmosfera, além da região da Floresta Nacional de Tapajós,
matéria orgânica a metano ocorre pela coo- hidrologia e química de águas superficiais, próximo a Santarém, revelou-se que a
peração entre diferentes grupos de micror- há um considerável desconhecimento dos perda de água do solo, devido à variação
ganismos, como mostrado no esquema da valores existentes no Brasil que forneçam do índice de pluviosidade inibiu a produ-
Figura 3. uma base sólida para estimativas de fato- ção de gases como o nitroso (NO2) e o
Apesar do enorme significado da emis- res de emissão e absorção para os gases metano. Ainda, a redução do metano foi
são biogênica do metano, há relativa- de efeito estufa chaves (CO2, CH4, e N2O), confirmada em 4 vezes mais do que a nor-
mente poucos estudos sobre as comuni- bem como dos gases reativos que contro- malmente determinada, provavelmente
dades microbianas metanogênicas em lam o potencial oxidante da atmosfera (O3, como um efeito direto da aeração do solo
campos abertos, como em sedimentos de CO, NOx, NOy, e hidrocarbonetos) e que que pode causar alteração na atividade de
alagados, rios, lagoas, represas e ocea- afetam a concentração do CH4. Em conjun- grupos de microrganismos como os desni-
nos (KEMNITZ, 2004). to, os gases reativos e os aerossóis trificantes, metanogênicos e metanotrófi-
Na Bacia Amazônica, por exemplo, há atmosféricos afetam significativamente o cos (DAVIDSON et al., 2004).
progressos no reconhecimento da pre- balanço radiativo atmosférico de modo Os resultados de pesquisas do LMA na
sença do metano tanto em rios quanto em ainda desconhecido para a região Amazô- Bacia do Rio Madeira, em Rondônia, reve-
represas, bem como indicações da ação nica, atingindo os ciclos biogeoquímicos lam a presença do gás metano em áreas
microbiana na geração do gás (CO2 de nutrientes essenciais para a Floresta consideradas tanto eutrofizadas como não
SCIENCE, 2004). Como apontado nos Amazônica. Além disso, as alterações oca- eutrofizadas (Araújo, dados não publica-
experimentos conduzidos no âmbito do sionadas pelo uso do solo na Amazônia dos), e os experimentos de isolamento
LBA2 (Experimento de Larga Escala da afetam a concentração de gases de efeito mostram a presença de arquéias metano-
Biosfera-Atmosfera da Amazônia)2, em estufa, de aerossóis e de gases que regu- gênicas hidrogenotróficas e acetotróficas

2. Projeto Temático aprovado pela FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - Setembro de 1997.Interações Físicas e
Químicas entre a Biosfera e a Atmosfera da Amazônia no Experimento LBA.

06
Figura 4. Fotomicrografias de arquéias metanogênicas. (a) micrografia eletrônica de varredura de células metanogênicas;
(b) bacilos retos sob luz UV. As fotos são apenas ilustrativas, uma vez que não se encontram inseridas as ordens de magnitude.

em sedimentos dos Rios Madeira e Flores- predominantemente a grupos metanogê- amostras de pântanos, charcos, rios, arro-
ta. nicos, mostrando sua relação com a zais, oceanos, lagoas, alagados, terras de
Estudos de arquéias metanogênicas gênese das grandes formações de hidra- prados, bosques decíduos, vertedouros,
em ambientes marinhos são mais comu- tos de metano. lodos de esgoto, aterros sanitários e sedi-
mente associados aos sedimentos. Altas As pesquisas realizadas no LMA no mentos da região Antártica (HANSON &
taxas de produção de metano foram âmbito do Programa Antártico Brasileiro HANSON, 1996; WISE et al., 1999; KNIEF
detectadas em sedimentos de estuários, têm revelado a produção do metano e a ati- et al.,2003), obviamente todos relaciona-
pântanos, deltas de rios e em bacias mari- vidade metanogênica em diversos pontos dos com a presença biogênica do metano.
nhas isoladas (BERNARD, 1979; da Península Antártica, particularmente na Dentre os vários ambientes em que se
SANSONE & MARTENS, 1981), com pro- Baía do Almirantado. A Figura 4 mostra encontram as metanotróficas, destacam-
duções que resultam não apenas no acú- morfologias de arquéias metanogênicas. se os solos de cobertura, sendo exemplos
mulo de metano no sedimento, como no Estudos sobre respostas das células os solos de floresta, os agrícolas, os
transporte do gás para a atmosfera expostas à luz UV durante os estudos de desertos (BOECKX & CLEEMPUT, 2000)
(SANSONE & MARTENS, 1981). De uma isolamento revelaram que ambas as mor- e aqueles que recobrem os aterros sanitá-
maneira geral, os diversos processos de fologias predominantes, cocos e bacilos, rios (KIGHTLEY et al., 1995). Os solos ser-
respiração que ocorrem nos sedimentos apresentaram auto-fluorescência, carac- vem como biofiltros do gás CH4 produzido,
marinhos são geralmente estratificados, terística que distingue as arquéias meta- formando uma espécie de barreira biológi-
devido a um gradiente decrescente de nogênicas que possuem a enzima F420, ca. As velocidades de oxidação do metano
potencial de oxi-redução formado como envolvida na via de produção do metano e variam com o conteúdo de água na terra, o
conseqüência do consumo de oxigênio, responsável por essa à luz nesse compri- destino da terra, e concentração de nutri-
nitrato e manganês, ferro e sulfato, nesta mento de onda (NAKAYAMA, 2006). entes, em especial da amônia. A quantia
ordem, por grupos específicos de micror- O estudo de comunidades microbianas de CH4 atmosférico consumida pela oxida-
ganismos (BRAKER et al., 2001). Nessa envolvidas com GEE no ambiente é de ção nos solos foi calculada de 40 a 60 Tg
lógica, considera-se que a metanogênese grande relevância, sobretudo em regiões por ano, uma quantia que é aproximada-
ocorre abaixo da faixa de redução de sul- como a Antártica, uma vez que essa é uma mente igual ao aumento anual de metano
fato, em camadas mais profundas do sedi- área que vem sofrendo alterações em atmosférico durante o último século. Os
mento, onde se desenvolvem condições decorrência do aquecimento global, e aterros sanitários, por exemplo, são res-
de anaerobiose estrita e baixos valores de constitui-se ainda em um ambiente prísti- ponsáveis por 5 a 6% das emissões de
potencial de oxi-redução. no, com características particulares que GEE gerados pela ação antropogênica
Estudos sobre a caracterização de tornam justificáveis as pesquisas envol- (BöRJESSON & SVENSSON, 1997). No
comunidades metanogênicas também vendo o ciclo do metano na região. solo de cobertura desses aterros, onde
têm sido feitos em sedimentos associados Como anteriormente observado, as fon- ocorre a atividade metanotrófica, o lança-
a áreas de hidratos de metano (formações tes do metano são inúmeras, notada- mento de CH4 para a atmosfera é calcu-
compostas por metano envolto por molé- mente as antropogênicas, e sua redução lado em 30 a 70 Tg por ano. As metanotró-
culas de água congelada que se formam na atmosfera pode se dar por reações foto- ficas presentes nas camadas de cobertura
sob condições de alta pressão, baixa tem- químicas, mas também pela notável capa- dos aterros sanitários podem apresentar
peratura e altas concentrações de gás), os cidade microbiana de realizar sua oxida- velocidades consideradas altas de oxida-
quais constituem grandes depósitos do ção biológica (OBM), exercida pelas bac- ção do CH4 - até 45 g ou 3 moles. m-2. dia-1
gás aprisionados em áreas oceânicas pro- térias metanotróficas. Representantes , constituindo os valores mais elevados de
fundas. Nesses estudos, foram encontra- das metanotróficas foram isolados de uma oxidação do CH4 já observados para solos,
das seqüências de Archaea pertencentes grande variedade de ambientes, tais como o que faz dessas comunidades verdadei-

07
obtidos e confirmados através da detec-
ção do gene pmoA, que codifica para a
enzima metano oxigenase, específica do
0,1 12,0 grupo, e por análises cromatográficas do
0,09 consumo de metano. As pesquisas na
10,0
0,08 região têm se concentrado ainda na carac-
absorbância 600nm

0,07 terização dessas culturas e quantificação


8,0
0,06 das populações metanotróficas nas amos-

CH4 (%)
0,05 6,0
tras ambientais.
0,04
4,0
A correta projeção dos efeitos do
0,03
aumento dos GEEs para a economia e o
0,02
2,0 clima do planeta e a viabilidade e o
0,01
sucesso das ações mitigadoras depen-
0 0,0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 absorbância dem diretamente do conhecimento acu-
horas CH4(%) mulado sobre os processos geradores e
consumidores desses gases. Os relatórios
Expon. (CH4(%))
do IPCC têm mostrado que, embora pro-
Expon.
(absorbância)
gressos importantes tenham sido feitos,
ainda há várias lacunas de informação a
Figura 5. Representação gráfica da cinética de consumo de serem preenchidas. No caso do ciclo do
metano de uma cultura isolada de aterro sanitário, monitoramento metano, o preenchimento dessas lacunas
de absorbância e porcentagem de metano por 111 horas.
passa invariavelmente pelo estudo dos
grupos microbianos associados à produ-
ção e ao consumo do gás, que tem sido o
ras barreiras biológicas à emanação do do gás metano para a atmosfera. foco de estudo do LMA. Dessa forma, as
metano para a atmosfera (HANSON & Quando comparado ao volume de pesquisas realizadas vêm contribuindo
HANSON, 1996). informações disponíveis sobre bactérias não apenas para a geração de informa-
Os pesquisadores do LMA estudaram metanotróficas em ambientes terrestres ções sobre a microbiologia do metano em
amostras de cobertura de solo de aterro ou em corpos de água doce, o conheci- amostras ambientais e sistemas antropo-
sanitário, adaptando-se para tal as técni- mento sobre esse grupo em ambientes gênicos, mas tem também se concentrado
cas empregadas no cultivo de organismos marinhos ou salinos é escasso, e os resul- no desenho de estratégias de estudo efici-
anaeróbios estritos que proporcionam con- tados direcionam-se quase sempre à clas- entes e no aprimoramento das técnicas de
dições atmosféricas controladas em fras- sificação microbiana e menos aos aspec- cultivo dessas comunidades microbianas.
cos de cultivo. Alguns dos isolados ob- tos funcionais de sua presença. Particular- Esse conhecimento poderá auxiliar na
tidos na pesquisa pertenceram ao gênero mente em um estudo realizado com amos- geração de estimativas mais realistas das
Methylocystis, bem como possuíram o tras de sedimento e água de uma lagoa emissões e da dinâmica do ciclo do
gene para a enzima metano-mono- marinha na Antártica, BOWMAN et al. metano em sistemas naturais e antropo-
xigenase (pmoA) que apresenta alta simi- (1997) isolaram uma nova espécie de bac- gênicos, assim como contribuirá para o
laridade com a seqüência de aminoácidos téria metanotrófica ressaltando a dificul- desenvolvimento de tecnologias envol-
das pMMOs da Família Methylocystace- dade que encontraram durante a fase de vendo o controle da emissão ou aproveita-
ae, gênero Methylocystis. O estudo ciné- isolamento desses microrganismos. mento do gás como fonte de energia.
tico das culturas durante o consumo do Assim, embora seja possível conhecer a
metano e crescimento celular revelou um composição das comunidades metanotró- Bibliografia
tempo de geração da ordem de 26h (Fi- ficas através de técnicas moleculares BERNARD, B.B. Methane in Marine Sediments. Deep-
gura 5). O isolamento e cultivo de bacté- empregando genes funcionais, a dificul- Sea Research v.26A, p.429-433, 1979.
rias metanotróficas a partir de amostras do dade em se obter culturas de laboratório BOECKX, P.; VAN CLEEMPUT O. Methane oxidation
in landfill cover soils. Trace Gas Emissions And Plants.
solo de cobertura de um aterro sanitário faz com que as informações sobre a ecolo- Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p. 197 213,
em atividade indicaram a ocorrência da gia e fisiologia desse grupo em ambientes 2000.
OBM relevante ao controle da emanação marinhos ainda seja insuficiente. O LMA BöRJESSON, G.; SVENSSON, B.H. Seasonal and
diurnal methane emission from a landfill and their regu-
do gás metano, favorecendo a formação vem desenvolvendo estudos nesse senti- lation by methane oxidation. Waste Manegement and
das barreiras biológicas. Resultados como do, como parte da pesquisa que visa à Research, v.15, p.33-34, 1997.
esses auxiliam a tecnologia ambiental inse- caracterização do ciclo do metano na BOWMAN, J.P.; MCCAMMON, S.A.; AND SKERRATT,
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potencializar o desenvolvimento de méto- na coluna d'água têm sido desenvolvidos e logy-UK.v.143: 14511459.
dos biológicos para a redução de emissão cultivos dessas células também já foram BRAKER, G., AYALA-DEL-RIO, H.L., DEVOL, A.H.,

08
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Tabela 1: Estimativas de fontes e sorvedouros de metano. (Adaptado de Wuebbles & Hayhoe, 2002).

Fontes e Sorvedouros ................................................................................................................................Tg/ano*

Fontes Naturais
Áreas alagadas.............................................................................................................................................100 (92 232)
Cupins ..........................................................................................................................................................20 (2 22)
Oceanos .......................................................................................................................................................4 (0,2 2)
Sedimentos marinhos ...................................................................................................................................5 (0,4 12,2)
Fontes geológicas ........................................................................................................................................14 (12 36)
Queimadas naturais .....................................................................................................................................2
Subtotal .......................................................................................................................................................145

Fontes Agropecuárias
Fermentação entérica (principalmente pecuária) ..........................................................................................81 (65 100)
Plantações de arroz alagadas .......................................................................................................................60 (25 90)
Subtotal .......................................................................................................................................................141

Outras Fontes Atropogênicas


Gás natural ...................................................................................................................................................30 (25 50)
Mineração de carvão ....................................................................................................................................46 (15 64)
Outros combustíveis fósseis .........................................................................................................................30 (6 60)
Queima de biomassa ...................................................................................................................................50 (27 80)
Disposição de resíduos.................................................................................................................................61 (40 100)
Subtotal .......................................................................................................................................................217

Total emitido................................................................................................................................................503 (41 660)

Sorvedouros
Reação com radicais hidroxila na atmosfera .................................................................................................- 445 (360 530)
Oxidação no solo ..........................................................................................................................................- 30 (15 45)
Remoção na estratosfera..............................................................................................................................- 40 (32 48)

Total absorvido ...........................................................................................................................................- 515 (430 600)

* Número entre parênteses representam variações nas estimativas feitas em diferentes trabalhos.

09
Ciência in Foco

EPIDEMIA DE AIDS
E SEGURANÇA
TRANSFUSIONAL
Grupo de hemocentros brasileiros se une ao
Retrovirus Epidemiology Donor Study
Ester Sabino
Livre-docente pela Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da FMUSP
Chefe do Departamento de Biologia Molecular da
Fundação Pró-Sangue/Hemocetro de São Paulo

O vírus da imunodeficiência Existe um caso bem documentado cidade de São Francisco caiu de 1% em
humana (HIV) é um bom exemplo de de HIV de 1959 na região do Congo, 1983 para 0,2% em 1985 quando um
como um agente com um longo período porém apenas no final da década de 70 teste foi disponibilizado para a triagem
de incubação pode espalhar silenciosa- ele chegou aos EUA, provavelmente sorológica para o HIV. Mesmo com as
mente numa população antes de ser proveniente do Haiti. medidas rapidamente introduzidas
descoberto. A síndrome só foi reconhecida em pelos bancos de sangue americanos,
O HIV é uma zoonose. Esta conclu- 1981, quando foram descritos os prime- os casos de infecção por transfusão san-
são se baseia no fato de existirem inú- iros casos em homossexuais masculi- guínea abalaram a opinião pública. A
meros vírus semelhantes ao HIV que nos dos Estados Unidos. Demorou procura por um sangue sem risco para
infectam diferentes espécies de símios cerca de um ano para que a origem da transmissão de HIV passou a ser uma
africanos. A caça a estes animais para epidemia fosse associada a um agente política de saúde nos EUA indepen-
alimentação é comum na África o que infeccioso. A nova síndrome chegou a dente do custo. A epidemia de HIV
exporia com freqüência os caçadores ser associada a outros vírus como o mudou totalmente a prática da transfu-
ao sangue dos animais infectados. É Citomegalovirus, ou ao uso de drogas são sanguínea. Desde a forma como o
possível que os eventos de transmis- comum na época como nitrito de isobu- doador é selecionado até a indicação
são inter-espécie tenham ocorrido múl- til. De certa forma, esta demora em médica de transfusão sanguínea.
tiplas vezes no passado, porém a infec- fazer compreender que se tratava de A cada novo agente infeccioso que
ção ficava restrita a poucos indivíduos e um novo agente infeccioso, atrasou a surge os bancos de sangue são chama-
sua transmissão entre humanos era implementação de medidas preventi- dos para dar uma resposta rápida para
pouco eficiente. No século XX, vários vas em relação à transmissão por trans- o problema. O governo americano dedi-
acontecimentos no continente africano fusão sanguínea. cou verbas especificas para pesquisa
mudaram a estrutura populacional Os primeiros doadores HIV positi- relacionada à segurança transfusional,
(guerras, êxodo rural, mudanças de vos doaram em 1978, mas somente no foi organizado um estudo multicentrico
comportamento com aumento signifi- final 1982 foram descritos os primeiros denominado Retrovirus Epidemiology
cativo das doenças sexualmente trans- casos de recipientes infectados nos Donor Study (REDS) que desenvolve
missíveis). Neste novo ambiente, o HIV EUA. No inicio de 1983, os bancos de pesquisas relacionadas a este tema
pode ser transmitido para um número sangue americanos iniciaram a exclu- naquele país.
maior de pessoas conseguindo se adap- são de indivíduos com fatores de risco Na medida que novas epidemias sur-
tar ao novo hospedeiro e ser transmi- da doação. Com esta medida a preva- gem como SARS, Influenza, Dengue e
tido de forma mais eficiente. lência de doadores HIV positivo na mais recentemente Chikungunya vírus,

10
mostram a necessidade da organiza- de sangue e maior controle sobre a qua- os indivíduos tem uma maior chance de
ção de redes de pesquisa mundiais lidade do sangue. estarem na janela imunológica (HIV,
para que rapidamente de desenvolvam Neste sentido o Brasil está muito à HCV). Muitas destas perguntas se refe-
estudos que permitam o reconheci- frente de outros países em desenvolvi- rem atitudes relativas a sexualidade do
mento de um novo agente e tomadas de mento como a China e a Índia, onde doador que os pode constranger ou que
medidas preventivas. transmissão por HIV ainda ocorre pela os faça sentir estigmatizado ou excluí-
Neste sentido o NIH abriu uma cha- não realização dos testes sorológicos. do. É provável que a nossa triagem clí-
mada internacional para que países em Apesar de tudo isso, ainda o risco de nica não seja tão eficaz quanto a ameri-
desenvolvimento submetessem pro- transmissão de HIV por transfusão san- cana, ou então que individuos recem
postas para se unir à rede americana guínea é de 1/60.000 no Brasil . Este expostos procurem o banco de sangue
REDS. O Brasil e a China foram as duas risco é decorrente da janela imunoló- para testagem de HIV.
propostas vencedoras. O grupo do Bra- gica do HIV período que dura em torno Neste sentido a FPS tem desenvol-
sil tem a participação da Fundação Pró- de 22 dias, em que o vírus está presente vidos estudos relacionados a motiva-
Sangue (FPS), Hemominas, HemoPE. mas o anticorpo, detectado pelo teste ção do doaores e sobre seu conheci-
A hemoterapia no Brasil teve início de ELISA, ainda não foi produzido. mento sobre janela imunológica do HIV.
na cidade do Rio de Janeiro, com a A janela imunológica porém não Trabalho de Gonzalez et al publicado
implantação do primeiro banco de san- explica por si só o fato do risco residual na revista VOX Sanguinis em 2006,
gue, em 1941. Rapidamente ocorreu no Brasil ser tão mais alto que o ameri- mostra que em cerca de 9% dos doado-
uma proliferação dos bancos de sangue cano. A prevalência de HIV é muito res o resultado dos testes é um motivo
devido à disseminação, entre o meio
médico, do arsenal terapêutico repre-
sentado pelo sangue e seus componen-
tes. Nos anos 50, a doação remunerada
"... o Brasil está muito à frente
de sangue consolidou-se, no Brasil, de outros países em desenvolvimento
como importante fonte de recurso para
a captação de doadores. Em 1967,
como a China e a Índia, onde transmissão
quando a Previdência Social passou a por HIV ainda ocorre pela não realização
comprar sangue para ser utilizado em dos testes sorológicos."
sua rede própria de hospitais e a cus-
tear sangue e hemocomponentes utili-
zados em hospitais conveniados, o pro-
blema da doação remunerada agravou- semelhante na população geral dos importante para a doação de sangue.
se. dois países. No entanto entre doado- Estes indivíduos sabem menos sobre a
No final da década de 70 e início da res de sangue a prevalencia nos EUA é janela imunológica do HIV e acreditam
80 houve uma iniciativa para a imple- 10 vezes menor. que os testes usados no banco de san-
mentação de hemocentros públicos e Antes de um voluntário ser aceito gue detectam 100% dos casos.
um maior controle do sangue. A doação como doador os bancos realizam uma Sem um entendimento correto do
remunerada foi proibida e iniciou-se o triagem clinica com o objetivo de evitar problema da janela imunológica, é pro-
processo de obtenção de doadores algum problema para o doador. Assim vável que muitos doadores omitam
entre familiares de pacientes interna- indivíduos com doenças cardíacas, dados na entrevistas por constrangi-
dos. A epidemia da AIDS fortaleceu esta com alguma doença hematológica, que mento ou por acreditarem que estas per-
iniciativa e os Hemocentros foram cria- foram operados recentemente ou rece- guntas são irrelevantes.
dos em todos os Estados. bendo algum medicamento são exclui- Os bancos de sangue costumam ser
Na década de 90 e início do novo dos da doação. Esta triagem também é alvo frequente de debates nos jornais
milênio houve um esforço para imple- usada para previnir doenças que pos- sobre as perguntas realizadas na tria-
mentação de novos testes de triagem, o sam ser transmitidas pelo sangue, e gem de doador. Estas reclamações par-
Brasil foi o primeiro pais na América que os testes sorologicos não detectam tem de pessoas que pouco entendem
Latina a triar para HCV e HTLV (1993) ou porque não existe teste laboratorial da dificuldade do processo de obter san-
melhorar, desenvolver regulamenta- para elas como a variante da Doença de gue com alta segurança.
ções sobre o procedimento nos bancos Creutzfeldt-Jacob (vCJD), ou porque Entender os motivos que levam a

11
doação no Brasil e a frequência pela os kits de biologia molecular como para a melhoria da pesquisa em trans-
busca de testes é um passo muito carga viral de HIV e HCV não são fusão sanguínea. Este projeto foi
importante na segurança transfusional. desenvolvidos no país. orçado em US 2 milhões e terá duração
Os testes de biologia molecular dimi- Com o estabelecimento de grandes de 4 anos.
nuem 65% da janela imunológica. hemocentros com infra-estrutura ade- Em primeiro lugar, estaremos
Assim, mesmo que estes testes sejam quada, a pesquisa relacionada a segu- desenvolvendo ferramentas de infor-
introduzidos no Brasil, o risco de trans- rança transfusional iniciou graças ao mática que permitirão guardar os dados
missão será de 1/150.000. esforço individual de pesquisadores em dos três hemocentros em um banco
Os EUA e Europa introduziram tes- vários centros do país. Não existe uma único (datawarehouse). No total tere-
tes de biologia molecular (NAT) em sua rede nacional com objetivo específico mos 500.000 doações por ano nos três
rotina. O risco nos EUA era de de analisar nossos dados e propor centros. Este esforço poderá ser base
1/600.000 antes desta iniciativa, dimi- novas medidas. Em geral as decisões de um sistema nacional para integração
nuindo para 1/2.000.0000. Apesar são tomadas baseadas na literatura de dados de outros bancos de sangue.
desta medida não ser efetiva em rela- estrangeira, ou em pequenas experiên- Os dados nacionais ainda são coleta-
ção ao custo, os bancos de sangue opta- cias. dos de forma manual, e muito simplifica-
ram pela introdução ao invés de enfren- Em 2005, O NIH optou por abrir uma da. Este trabalho estará sendo reali-
tar a opinião pública e os desdobramen- concorrência internacional para que zado no laboratório de banco de dados
tos jurídicos que seguem cada trans- outros paises fizessem parte do seu do IME USP.
missão transfusional pelo HIV. estudo multicêntrico REDS. Além da Os projetos de pesquisa em si esta-
Apesar de haver intenção do Brasil verba direcionada a pesquisa ser subs- rão focados em HIV, doença de Chagas
em introduzir o teste de NAT, o custo da tancial (total da chamada de 8 milhões e estudos epidemiológicos relaciona-
implementação fez a portaria inicial ser de dólares para 3 centros), esta era dos à motivação do doador e recusa.
revogada. uma oportunidade rara que iria permitir No caso do HIV, pretendemos moni-
O processo de desenvolvimento do a interação dos investigadores brasilei- torar a prevalência e a incidência nos
doadores e calcular o risco residual de
transmissão nos 3 centros. Os doado-
res HIV positivos serão entrevistados e
Projeto manterá pesquisadores será realizado teste de genotipagem
brasileiros em contato com o que existe para definirmos resitência primaria no
pais.
de mais desenvolvido em relação à Um dos estudos estará focado em
segurança transfusional . analizar as motivações e o motivo de
recusa, no intuito de melhorar o questio-
nário pré doação mais efetivo.
NAT nos EUA é interessante. Em 1996 o ros com o grupo com maior experiência O estudo de doença de Chagas pre-
NIH abriu uma concorrência de US$ 6 em estudos sobre segurança transfusi- tende reconvocar doadores cuja sorolo-
milhões para que empresas colocas- onal no mundo. gia foi positiva há 5-10 anos atrás. Pre-
sem uma proposta de desenvolvimento Escrever a proposta foi já uma tendemos verificar a taxa de mortali-
de um teste para bancos de sangue. A grande aventura, a estrutura do projeto dade e evolução da doença. Com isso
empresa Chiron que hoje vende o pro- é muito diferente daquela que estamos pretendemos ajudar o entendimento da
duto para o mundo inteiro foi a vence- acostumados. Os projetos têm que ser historia natural da doença. Este etudo
dora da chamada. baseados em dados preliminares. O também servirá para analisar novos tes-
Na Alemanha pequenas empresas grupo têm que demonstrar capacidade tes sorológicos usados para confirma-
de biotecnologia se desenvolveram de realizar o que está propondo. ção diagnóstica.
para suprir a necessidade dos bancos Apenas duas propostas foram esco- Seguramente o projeto RDS ajudará
de sangue na realização dos testes "in lhidas: o Brasil e a China. A proposta a aglutinar centros de excelência no
house". A introdução do NAT no Brasil brasileira é coordenada pela Fundação país colocando seus pesquisadores em
poderia seguir a mesma estratégia da Pró-Sangue e conta com o HemoMinas contato com o que existe de mais
Alemanha e ajudar na implementação e o HemoPE. desenvolvido em relação à segurança
de empresas de biotecnologia na área Seguramente o desenvolvimento do transfusional e manter o Brasil na lide-
diagnóstica. Hoje praticamente todos projeto REDS no Brasil será um marco rança da América Latina.

12
Ciência in Foco

TRANSFORMAÇÃO
BACTERIANA
Correspondências históricas.
Luiz R. Travassos
Unidade de Oncologia Experimental,
Professor Titular do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia,
Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brasil

Fred Griffith descreveu em seu traba- transformação e de forma mais relevante e a Medicina. Uma dessas comemora-
lho de 1928 que pneumococos encapsu- levou o assunto a grandes reuniões cien- ções ocorreu na Rockefeller University
lados mortos pelo calor podiam transmitir tíficas e “mais crucialmente nos corredo- em 2 de Fevereiro de 1979, portanto cele-
o fenótipo capsular a pneumococos não res fora das sessões plenárias”. M. Mars- brando o 35º aniversário da publicação
patogênicos de tal forma que esses últi- hall lembrou-me com orgulho que da dessa descoberta revolucionária. No Cas-
mos tornavam-se capazes de infectar mesma forma que ele, Dawson, Avery e pary auditorium, diversos pesquisadores
camundongos. Esse fenômeno foi cha- Colin MacLeod eram todos de Nova Sco- se reuniram alguns lembrando os argu-
mado de transformação. O médico, que tia, Canadá e que Nova Scotia é uma mentos e discussões havidas na época,
morreu no Ministério de Saúde Pública pequena provincia de 900.000 pessoas. inclusive com acusações fora de propó-
durante o bombardeio de Londres pelos Dawson iniciou as experiências sito como “você defendia que eram as pro-
germânicos em 1941, sugeriu na época de transformação no laboratório de teínas que transmitiam os caracteres
que uma proteina enzimaticamente ativa Oswald Avery mesmo com as objeções genéticos”, e a projeção de protocolos
poderia ser o agente transferido. O efeito desse último. Os resultados de Griffith experimentais históricos por um rema-
de pneumococos mortos S, tipo III no foram confirmados, mas Dawson inicial- nescente da trinca. Eu tive a oportuni-
aumento da virulência da amostra R deri- mente não obteve sucesso na transfor- dade de presenciar essa grande festa. E,
vada do tipo II, era observado somente in mação in vitro e igualmente não conse- da mesma forma que ouvi, fiz a mim
vivo, mas não in vitro. Um aquecimento a guiu transformar amostras R do bacillus mesmo a pergunta que René Dubos tinha
60ºC (mas não a 100ºC) por 15 min era de Friedlander com bactérias mortas do insinuado. E se Dawson tivesse sido um
seguro, permitindo a transformação tipo S II de Pneumococcus (Dawson, French Canadian, não traria ele um
(Griffith, 1928). 1930). Contudo, o pesquisador junta- modelo de transformação desenvolvido
O modelo experimental de Griffith foi mente com R.H.P. Sia no ano seguinte, já por pesquisadores franceses ou de
adotado por Oswald Avery no Instituto publicava uma técnica de indução de outros paises, mas escritos ou comunica-
Rockefeller em New York e todo o traba- transformação de tipos de pneumococos dos em francês?
lho subsequente que culminou na publi- in vitro (Dawson e Sia, 1931). Simultane- Essa idéia me veio a mente estimu-
cação de 1944 (Avery et al., 1944) asso- amente, J.L. Alloway (1931) extraiu o prin- lado pelo trabalho de meu pai, Joaquim
ciando a indução da transfomação ao cipio ativo a partir de células mortas pelo Travassos em 1930, baseado no fenô-
ácido desoxiribonucleico (DNA), esteve calor, recuperando-o em filtrados. meno da aglutinabilidade transmissível
ligado ao seu laboratório. Somente, no entanto, com a publica- descrito pelas pesquisadoras romenas J.
Não é frequentemente enfatizado que ção do trabalho de Avery, MacLeod e Cantacuzène e O. Bonciu em 1926 e
quem intermediou a adoção do modelo McCarty (1944) 13 anos depois, ficou comunicado à Academia de Ciências da
de Griffith foi Martin Henry Dawson, um estabelecida a natureza do principio França. Escrevi então um “Feature Arti-
“English Canadian” como a ele se referia transformante como sendo o DNA. Não é cle” para ASM News da American Society
R.J.Dubos. Como me escreveu Michael surpresa, pois, que inúmeras comemora- for Microbiology sobre Transformação
Marshall, o qual prepara uma biografia de ções tenham ocorrido no mundo inteiro bacteriana “revisited” e levantando
M. H. Dawson, esse pesquisador publi- para relembrar esse fato histórico que várias referências da década de 1920-
cou amplamente sobre o fenomeno de revolucionou toda a Genética, a Biologia 1930 (Travassos, 1979).

13
Esse artigo levou um tempo razoável sólido não enriquecido com os produtos um elemento “dragged along” ou “entrai-
para ser publicado considerando a natu- de pacientes convalescentes de escarla- né” no estreptococo. Na sua visão as
reza das ASM News. Um dia, no Memorial tina. Apesar disso, curiosamente, as auto- eventuais partículas de virus adsorvidas
Sloan-Kettering Cancer Center, New ras concluiram que a propriedade agluti- seriam progressivamente diluidas nas
York, onde trabalhava, ouvi o comentário nante era “hereditariamente persistente” subculturas sucessivas da bactéria. Na
de que eu tinha publicado uma nota revo- sendo devida a uma adsorção ao contrá- verdade, os títulos aglutinantes era man-
lucionária sobre transformação bacteri- rio de absorção do elemento específico. tidos mesmo após várias passagens em
ana contestando o que era descrito em Ainda em 1926, Martin e Lafaille no meios de cultivo. O fenômeno da agluti-
todos os livros-textos. Na verdade, eu Institut Pasteur usaram 4 amostras de nação transmissivel foi reproduzido por
não contestava nada, mas adicionava estreptococos de casos de endocardite, Travassos (1930) usando coelhos infec-
informação perdida na penumbra da his- oftalmia purulenta, pleurisia e infecção tados pela amostra Dick I que era agluti-
tória. O que ficou marcado, no entanto, puerperal. Essas bactérias não reagiam nável a um título de 1:640. As fontes do
era a citação do trabalho de Cantacuzène com soros de convalescentes de escarla- principio transformante foram a urina dos
e Bonciu de 1926, portanto, dois anos tina, mas, após uma única passagem em animais coletada diretamente da bexiga,
antes da publicação dita pioneira de Grif- presença de urina filtrada e exudato tonsi- bem como emulsões do figado, coração e
fith. lar passaram a ser aglutinadas pelos rim, filtradas em filtro Chamberland L3,
Cantacuzène e Bonciu (1926) mostra- soros de escarlatinosos em títulos de com teste de esterilidade feito. Seis amos-
ram que estreptococos eram aglutinados 1:1000-1:2000. O fenótipo aglutinante tras de Streptococcus não reativas ou indi-
pelo soro de convalescentes de escarla- era mantido mesmo após 5 subculturas ferentes, foram crescidas em meio suple-
tina após as bactérias, originalmente não em agar simples. Esse trabalho confir- mentado com os produtos dos coelhos
aglutináveis, terem sido cultivadas em mava pois os resultados de Cantacuzène infectados. Com exceção de uma, as
meio contendo produtos filtrados, acelu- e Bonciu. Essas autoras relataram um outras amostras foram transformadas
lares de pacientes com escarlatina, como ano depois (1927) que embora os estrep- com títulos aglutinantes de 1:320 a
urina ou exudato tonsilar. A aglutinação tococos eram as bactérias mais capazes 1:1280. A capacidade de transformação
em altos títulos pelos soros de convales- de transformação com os produtos de dos produtos dos coelhos infectados não
centes de escarlatina era uma proprie- pacientes com escarlatina, outras espé- foi afetada pelo aquecimento a 55 oC por
dade estável e específica dos estreptoco- cies igualmente adquiriram a propriedade 1 h. A aglutinabilidade dos estreptococos
cos hemolíticos. As pesquisadoras obser- aglutinante. Entre elas estavam Escheri- transformados era mantida mesmo após
varam alteração no perfil de aglutinação chia coli, Salmonella paratyphi e Staph- 5 passagens em caldo glucose (em comu-
de 2 estreptococos, um isolado do san- ylococcus, mas não meningococos B, nicação pessoal, soube que até 27 passa-
gue de septicemia puerperal e outro, do bacilos pseudo-diftéricos ou Proteus gens foram feitas sem perda da capaci-
tipo viridans. Em relação à metodologia X19. A aglutinação transmissível foi tam- dade aglutinante). A conclusão explicita-
usada, o exudato faríngeo era emulsifi- bém confirmada por Zoeller e Meersse- mente enunciada nesse trabalho foi a de
cado em caldo simples, deixado repousar man (1927) embora somente em estrep- que um fator filtrável estava presente
por 2-3 h, adicionado a idêntico volume tococos e não em outras espécies. tanto nos produtos de pacientes com
de meio de cultura, filtrado em filtro de Em 1929, Sacquépée et al. influ- escarlatina como de animais experimen-
Chamberland L3 e o teste de esterilidade enciados pela idéia de que a aglutinação talmente infectados, o qual era absorvido
feito pela incubação por 48 h, possivel- transmissível era devida a adsorção, pos- por estreptococos indiferentes que pas-
mente a 37 oC. Estreptococos a serem sivelmente de um virus filtrável, tentaram savam a ser aglutinados como soro de
transformados eram então cultivados inativá-lo com iodo, um conhecido agente convalescente de escarlatina. O fator de
nesse meio por 24 h. Antes dessa cultura, antiviral. O tratamento com iodo não inati- transformação resistia ao aquecimento o
esses estreptococos aglutinavam com vou a propriedade transformante de um que sugeria que não era um elemento
soro de escarlatinoso com títulos de 1:10 filtrado de urina de escarlatinoso. O fil- vivo, e era igualmente resistente ao trata-
a 1:40. Após a cultura com produtos de trado resistia ainda ao aquecimento a 100 mento com iodo, sugerindo que a agluti-
pacientes com escarlatina os títulos aglu- oC por 10 min. Esses autores verificaram nabilidade transmissivel era devida a “ab-
tinantes subiam para 1:500-1:1000. ainda que o Streptococcus transformado sorção e integração do elemento especí-
Outros sub-cultivos em meio enriquecido mantinha a propriedade aglutinante fico” ao invés de adsorção à célula bacte-
com aqueles produtos aumentavam mesmo após 10 mezes de repiques no riana.
ainda mais esses títulos. A conclusão laboratório ou 10 passagens em agar san- Inevitavelmente, após a publicação
mais relevante desse trabalho foi a de gue. do Feature Article em ASM News, recebi
que a propriedade aglutinante era perma- Travassos (1930) no Instituto Butan- de Joshua Lederberg, Premio Nobel,
nentemente incorporada pelos estrepto- tan, São Paulo, discutiu a hipótese viral então Presidente da Rockefeller Univer-
cocos desde que ela resistia a subcultivos para justificar o fenômeno de Canta- sity, a seguinte nota com algumas sepa-
sucessivos dessas bactérias em meio cuzène e Bonciu, na época referido como ratas.

14
Ao: Dr Travassos 26a,b; 33,39,56 ...(lista anexa).
8/17/79 Desculpe mas não tenho separatas das revisões
maiores. Você tem razão: cientistas geralmente não retem
História da Transformação por muito tempo uma perspectiva histórica.
Agradeço por relembrar alguns detalhes adicionais no seu
Acho que você gostaria que eu trouxesse à sua atenção artigo à ASM.
que esse trabalho inicial foi realmente extensivamente
revisto em publicações anteriores e.g. referências # 11, 17, Joshua Lederberg

Um fac-simile dessa nota foi repro- em 1997. Comenta Hausmann que afirmação não corresponde à realida-
duzida por Rudolf Hausmann no seu Lederberg “opinou que estes trabalhos de!.
livro História da Biologia Molecular tra- [incluindo os de Cantacuzène e Bonciu]
duzido de “...und wollten versuchen, foram bastante discutidos em revisões; Em resposta a Nota de Joshua
das Leben zu verstehen...” e publicado mas [que] fazendo-se um levantamento Lederberg, respondi com a carta abaixo
pela Sociedade Brasileira de Genética da literatura científica, vê-se que esta traduzida:

Prezado Prof. Lederberg laboratórios por pelo menos 6 anos. Tendo em vista as limita-
ções de métodos e critérios da época (1926), imaginei que a
Muito grato pelo Memo/Reply e separatas anexas. contribuições em conjunto de todos os trabalhos citados no
A maioria das revisões sobre Transformação bacteriana artigo da ASM eram tão confiáveis e relevantes quanto a de
começam com declarações como: “a transformação bacteri- Griffith (1928), com o primeiro trabalho tendo sido publicado
ana foi observada pela primeira vez por Griffith” (Bact.Rev., 2 anos antes. Por que então esses trabalhos não são geral-
16: 31, 1952) ou “a primeira transducção bem-autenticada foi mente citados em paralelo ao de Griffith para introduzir o con-
a transformação de tipos de pneumococos” (Physiol.Revs., ceito da Transformação bacteriana? Depois de uma breve
32: 403, 1952). Livros texto em Microbiologia obviamente exumação do trabalho de Cantacuzène e Bonciu (1926) em
seguem a mesma linha e pode-se perguntar se a contribuição sua excelente revisão no Heredity (1948), ele caiu nova-
de Griffith foi absolutamente única na introdução de um novo mente em quase completo esquecimento nas mentes da mai-
conceito que não apareceria de outras contribuições contem- oria dos microbiologistas. E de fato, além de contestar a prio-
poraneas devido a dados experimentais insuficientes ou não ridade de Griffith de acordo com o exposto acima, a série de
confiáveis. É evidente, no entanto, que as descobertas sub- trabalhos do artigo da ASM ainda nos surpreende com altas
sequentes de Avery e outros, usando o modelo de Pneumo- eficiências dos fenômenos de transformação relatadas, e a
coccus, trazem um corpo de evidências formidavel que tende possibilidade de transformação inter-espécies nas condi-
a minimizar outros esforços contemporâneos ao trabalho de ções usadas por Cantacuzène & Bonciu e outros.
Griffith.
O artigo da ASM teve como objetivo provocar uma reavali-
De modo fortuito eu focalizei no trabalho de Cantacuzène ação dessas contribuições históricas de tal forma que uma
e Bonciu (1926) lendo a Nota de meu pai (Joaquim Travas- descrição simples de resultados foi dada, sem comentários,
sos) publicada em 1930 num periódico prestigioso regional. para permitir uma reavaliação e criticismo sem preconceitos.
O que chamou minha atenção foi que a publicação sobre a Agradeço novamente pela sua atenção e interesse.
transformação de streptococos não foi um trabalho isolado
desde que inspirou contribuições subsequentes de outros Luiz R. Travassos, Professor UFRJ

Passaram-se anos e em 1999 recebi berg, agora Professor-emeritus da Roc- nossa correspondência.
novamente outra carta de Joshua Leder- kefeller University procurando reviver a Em uma de suas cartas escreveu:

15
“Eu tomei conhecimento de algumas publicações do labora- Eu não estava a par do seguimento (“follow-up”) de seu pai
tório de Cantacuzene desde 1945. Existe uma tradição ainda no Brasil.
mais extensa da “paraglutinação” de filtrados ou culturas mixtas
desde, talvez, 1908 (Kuhn-Woithe). Mas eu as achei dificeis de Tome nota também de Sanfelice (1893) o qual tenho alguma
interpretar na ausência de reprodução precisa, e tendo aglutina- confiança que se tratava de uma transferência de toxigenicidade
ção como única marca. Algumas experiências podem ter sido mediada por fagos; mas poderia ser uma contaminação de espo-
exemplos válidos de transducção. Outras eu suspeito serem a ros. Gostaria de reconhecer nossa divida para com esses pione-
seleção por colicinas de bacteriófagos, ou outros inibidores, iros em sua luta para constituir uma base conceitual para o que
para variantes rugosas (aglutináveis): é dificil dizer. chamamos hoje de genética bacteriana. Na eventualidade, foi
Há ainda o trabalho de Theobald Smith (1894) que pode ter Griffith 1928 ? Avery et al. 1944 que conduziu ao caminho de
sido uma antecipação, mas muito dificil de interpretar em retros- construção continua até o presente. Obrigado por trazer essa
pectiva. matéria a nossa atenção.”

Na verdade, do que foi dito e argumen- plate” para transcrição. Esse fato era Dawson, M.H. & Sai, R.H.P. 1931 In vitro transforma-
tion of pneumococcal types. I. A technique for inducing
tado para explicar o esquecimento histó- importante na determinação do destino do transformation of pneumococcal types in vitro.
rico do trabalho de Cantacuzène e Bonciu, DNA ao ser incorporado e importante J.Exp.Med., 54: 681-699.
nenhuma justificativa relevante foi apre- marco no entendimento da transformação. Alloway, J.L. 1931 The transformation in vitro of R pneu-
mococci into S forms of different specific types by the
sentada além do fato de que existiam Conforme ele próprio relatou, Lacks ficou use of filtered pneumococcus extracts. J.Exp.Med., 55:
outras publicações anteriores, mais ou surpreso ao ler na tese de Pierre Schaeffer 91-99.
menos criticáveis por envolverem fenôme- publicada em 1961 e apresentada à Uni- Travassos, L.R. 1979 Bacterial transformation revisi-
ted: Familiar and unfamiliar results of the 1920-1930
nos outros que não da transformação pura versidade de Paris: “Une hypothèse est decade. ASM News, 45: 420-422.
e simples. Dois fatos parecem sempre ter proposée d'après laquelle la pénétration Cantacuzène, J. & Bonciu, O. 1926 Modifications
sido deixados de lado: 1) as preparações de la molécule d'ADN dans la bactérie subies para dês streptocoques d'órigine non scarlati-
neuse au contact de produits scarlatineux filtres.
contendo o principio transformante dos requiert une structure à double chaîne, C.R.Acad.Sci. (Paris) 182: 1185-1187.
vários trabalhos da decada de 1920-1930 alors que la synapse, dont dépend Martin, R. & Lafaille, A. 1926 Action de produits scarlati-
eram aquecidas ou tratadas com iodo, o l'intégration, requiert au contraire une neux filtrés sur l'agglutinabilité des streptocoques non
scarlatineux et de divers autres microbes par le sérum
que presumivelmente eliminava elemen- chaîne polynucléotidique unique”. Levou des convalescents de scarlatine. C.R. Soc.Biol., 95:
tos vivos ou toxinas termo-lábeis de ação certo tempo para reconhecer que mentes 284-286.
seletiva (virus, bacteriófagos, proteinas); diferentes podem chegar a resultados con- Cantacuzène, J. & Bonciu, O. 1927 Modifications
subies par des bacteries autres que les streptocoques
2) várias sub-culturas foram realizadas vergentes e até iguais e que devem convi- au contact de produits scarlatineux filtrés. C.R. Soc.Bi-
para garantir absorção e integração do ver com isso. ol. 96: 1443-1446.
principio ativo, bem como diluição de qual- O reconhecimento dos dados científi- Zoeller, C. & Meersseman, F. 1927 Le phénomène
d'agglutinabilité transmissible. C.R. Soc.Biol., 96: 760-
quer produto simplesmente adsorvido às cos independentemente de sua origem e 761.
bactérias. de seus autores, e a sua citação precisa é Sacquépée, E., Liégois, M. & Fricker, J. 1929 Recher-
Em seu Guest commentary ao Journal uma atividade essencial que somente eno- ches sur l'agglutinabilité conférée au streptocoque par
les filtrats de produits scarlatins. C.R. Soc. Biol., 100:
of Bacteriology (2003) Sanford A. Lacks brece o pesquisador e a Ciência, contribu- 1187-1189.
disse que o entendimento científico é um indo igualmente para um relato histórico Travassos, J. 1930 Nota sobre o phenomeno de agglu-
grande edificio para o qual muitos contri- justo e fidedigno. tinabilidade transmissivel de Cantacuzène e Bonciu.
Brasil Medico, 44: 699-702.
buem. Seu trabalho sobre o mecanismo Hausmann, R. 1997 História da Biologia Molecular.
molecular da incorporação de DNA na Sociedade Brasileira de Genética, Gráfica e Editora
transformação é um reflexo disso. Em Referências F.C.A., Ribeirão Preto, Brazil
Smith, T. 1894 Modification, temporary and perma-
1962, Lacks propos que uma fita do DNA Griffith, F. 1928 The significance of pneumococcal
nent, of the physiological characters of bacteria in
types. J. Hyg., 27: 113-159
duplex era degradada e que a outra fita mixed cultures. Trans.Assoc.Amer.Physicians 9: 85-
Avery, O.T., MacLeod, C.M. & McCarty, M. 1944 Stu- 109.
entrava na célula (Lacks, 1962). Esta con- dies on the chemical nature of the substance inducing
Sanfelice, F 1893 Untersuchungen uber anaerobe Mik-
versão a uma fita única explicava a eclipse transformation of pneumococcal types. Induction of
roorganismen. Z. Hyg. Infektionsk. 14: 339-393.
transformation by a desoxyribonucleic acid fraction iso-
da atividade transformante imediatamente lated from pneumococcus type III. J.Exp.Med., 89: Lacks, S.A. 2003 Rambling and scrambling in bacterial
após a incorporação do DNA, uma vez que 137-158. transformation a historical and personal memoir. J.
Bacteriol., 185: 1-6
DNA desnaturado era pobremente incor- Dawson, M.H. 1930 The transformation of pneumococ-
cal types. II. The interconvertibility of type-specific S Lacks, S. 1962 Molecular fate of DNA in genetic trans-
porado pelas células e não servia de “tem- pneumococci. J.Exp.Med., 51: 123-147. formation of pneumococcus. J.Mol.Biol., 5: 119-131.

16
Ciência in Foco

RNA
INTERFERÊNCIA
A nova corrida do ouro.
Carlos F. M. Menck
Depto. de Microbiologia,
Professor Titular do Instituto de Ciências Biomédicas
Av. Prof. Lineu Prestes 1374 - CEP 05508-900
São Paulo- SP - Brasil

Redescobrindo o metabolismo da grupos dos pesquisadores americanos grande potencial tecnológico (Elbashir
célula. Andrew Z. Fire e Craig C. Mello publica- et al, 2001). Descobriu-se também que
A revelação de que a molécula de ram em conjunto resultados de seus tra- pequenas moléculas de RNA são sinteti-
RNA tinha atividade catalítica, em mea- balhos com o modelo biológico Caenor- zadas nas células, a partir do seu geno-
dos dos anos '80, já nos havia alertado habditis elegans (um verme nematóide), ma, de modo a produzir estruturas simi-
que estas provavelmente desempe- revelando que pequenas moléculas de lares a grampos, formando moléculas de
nham funções muito mais relevantes do RNA dupla-fita (RNAdf) poderiam silen- RNAdf (conhecidos como microRNA, ou
que simples mensageiros ou fábricas de ciar a expressão de genes (Fire et al, miRNA) que controlam a expressão de
proteínas. Porém, ainda não estávamos 1998). Os experimentos apresentados genes celulares, mudando radical-
preparados para mudanças tão drásti- chamam atenção pela simplicidade. Ao mente a forma com que o metabolismo
cas na forma de como a célula controla analisar os efeitos já conhecidos de inibi- celular deve ser investigado. Em 2006,
seu metabolismo. O início da descoberta ção de expressão gênica por moléculas apenas 8 anos após sua descoberta, os
começou com fatos inusitados, e difíceis de RNA simples fita anti-senso e também Dres. Fire e Mello receberam o Prêmio
de explicar, em plantas, mais especifica- senso (similar aos dados de co- Nobel de Medicina.
mente petúnia, no início da década de supressão), os pesquisadores descobri-
'90. Foram construídas plantas transgê- ram que o uso simultâneo das duas molé- Mecanismos de ação de RNAi
nicas que super-expressavam genes culas tinha um efeito sinergístico. Alguns A via metabólica de processamento
para produção de pigmentos, e se espe- experimentos e controles suplementa- pelo RNAi está ilustrado na figura 1. A
rava que estas gerassem flores com colo- res revelaram que a molécula efetora ilustração separa os processos celula-
ração violeta escuro (em comparação era, na verdade, o RNAdf, e o significado res endógenos, e aqueles induzidos arti-
com plantas selvagens que têm flores vio- desta descoberta foi muito bem avaliado ficialmente por moléculas exógenas.
leta-claro). Entretanto, para surpresa e discutido. Pela abilidade do RNAdf de Nos processos celulares (figura 1A),
dos pesquisadores, as plantas apresen- interferir na expressão genética, o meca- genes que codificam grupos de
tavam flores brancas, devido à ausência nismo começou a ser chamado de RNA microRNAs são transcritos a partir da
de síntese do pigmento, por silencia- interferência, ou simplesmente RNAi. RNA polimerase II, como microRNAs pri-
mento do transgene e do gene endóge- Alguns poucos anos mais tarde mários (pri-miRNAs), que podem cor-
no! (2001) confirmou-se a existência do responder a moléculas com compri-
Esse fenômeno de silenciamento mesmo mecanismo em células huma- mento de milhares de nucleotídeos, que
gênico em plantas também foi obser- nas, o que evidenciou a alta importância são poliadeniladas e recebem o 5'-cap,
vado em outros organismos, ficando evolutiva da via de RNAi em eucariontes como os RNAs mensageiros celulares.
conhecido como co-supressão. Porém, em geral, e abriu perspectivas de uso Porém, ainda dentro do núcleo, esses
o mecanismo de silenciamento era des- desse mecanismo como base para silen- pri-miRNAs são clivados por RNAses
conhecido. Alguns anos mais tarde, os ciamento gênico em mamíferos, com (Drosha ou Pasha) e processados para

17
formar estruturas de RNAdf em grampo,
conhecidos como pre-microRNAs (pre- Dicer
miRNAs) com cerca de 70 bases. Estas
moléculas são exportadas ao citoplasma siRNA
siRNA e RISC
(pela enzima Exportina-5) e são nova-
transcrição
mente clivadas por uma RNAse III,
Dicer, resultando em duplexes de 19 a
23 pares de base. Drosha degradação
Essas moléculas de RNAdf se asso- do mRNA
ciam ao complexo RISC (do inglês “RNA pri-miRNA

Induced Silecing Complex”), que pro-


miRNA e RISC
move a interação com moléculas de
Dicer
RNAs mensageiros que sejam comple-
mentares a uma das fitas da duplex (co-
nhecido como RNA guia). Dois mecanis- bloqueio da
pre-miRNA tradução
mos de silenciamento, a partir dessa inte-
miRNA maduro
ração, são bem conhecidos para silencia-
mento gênico: bloqueio da tradução e Figura 1a: Mecanismos de ação de RNAi em células:
São apresentados dois tipos de moléculas de RNAi endógenos: miRNA,
degradação da fita alvo. Enquanto a pri- que bloqueia tradução e siRNA que promove a degradação do mRNA;
meira ocorre principalmente em molécu-
las de miRNA cuja complementaridade é
apenas parcial, em alguns casos a simila-
ridade entre a molécula de miRNA e parte Pelo menos um terceiro mecanismo Emprego do mecanismo de RNAi
do RNA mensageiro alvo é total, resul- de silenciamento pode também ocorrer, para estudos funcionais.
tando na clivagem e degradação especí- ao nível transcricional. Nesse caso, foi Além de ser uma descoberta que revo-
fica deste transcrito. É importante salien- demonstrado que duplexes de RNA lucionou a nossa forma de ver as células,
tar que, em casos de complementação tendo similaridade com promotores gêni- o uso de RNAi como ferramenta para ini-
incompleta, moléculas de miRNA podem cos também pode resultar na metilação bir a expressão de genes específicos
regular centenas de genes, e cada gene desse promotor ou mesmo remodela- também revolucionou nossa forma de
alvo pode ser regulado por múltiplos mento da cromatina, com conseqüente determinar o papel de genes em células
miRNAs, demonstrando a complexidade redução dos níveis de transcrição de vários organismos, incluindo huma-
dessa rede de regulação gênica. daquele gene (Morris et al, 2004). no. Para isso foram desenvolvidas
várias estratégias que permitem a redu-
ção de expressão de genes específicos
Vírus siRNA exógeno (“knock-down”), através de moléculas
recombinante
de RNAi complementares (figura 1B).
Para células humanas, pode-se, por
Dicer exemplo, transfectar pequenas molécu-
siRNA las de RNAdf (19 a 30 bp) diretamente
shRNA siRNA nas células em cultura, visando a degra-
Genoma viral dação específica de um gene. Essas
moléculas, conhecidas como siRNA
(“small interfering RNA”), precisam ter
algumas características de seqüência
transcrição
particulares para serem ativas e o silen-
siRNA e RISC
ciamento de seu gene alvo possibilita a
obtenção de várias informações da fun-
degradação
ção exercida pela proteína que ele codi-
do mRNA fica na célula, através de uma aborda-
gem genética simples. Atualmente,
Figura 1b: Moléculas de RNAi podem ser introduzidas a partir de várias empresas de biotecnologia ofere-
vetores exógenos, seja através de vetores (em geral virais) recombinantes cem moléculas de siRNA, cujas seqüên-
(que codificam shRNAs), ou então através de duplexes (siRNA) exógenos.
cias são obtidas através de algoritmos

18
Outros modelos como exemplos.....

Injeção intramuscular
Injeção intraocular
Injeção intravenosa

Aplicação intranasal
Injeção intraperitonial

Figura 2: Vias possíveis de introdução


de moléculas de RNAi em animais, como
protocolos pré-clínicos.

próprios, para qualquer gene que o cli-


ente pretenda silenciar. Outra caracte-
rística importante é o tamanho da duplex
que deve ter 19 a 30 pb, uma vez que
tamanhos maiores podem induzir res-
postas interferon em células animais.
Vários desses algoritmos são livres para vem processos de recombinação homó- pela falta de resultados rápidos, o que
uso (“free-ware”) e podem ser acessa- loga, muito pouco eficientes em células era perfeitamente compreendido por
dos diretamente na internet. Para a maio- de mamíferos, e praticamente impossí- aqueles que trabalharam no projeto
ria de genes humanos (e de alguns veis de serem realizadas em células genoma e que conheciam as limitações
outros organismos), as empresas pro- humanas. Logo, o emprego dessas abor- das informações geradas. Uma das
põem 3 moléculas de siRNAs previa- dagens envolvendo os mecanismos de razões para a demora na obtenção de
mente desenhados, com garantia de que RNAi abriu perspectivas de se realizar resultados concretos em termos de pro-
pelo menos dois desses podem reduzir estudos de genômica funcional para célu- dutos, que poderiam resultar em melho-
em pelo menos 70% a expressão do las humanas, nos quais podem ser obti- ria de saúde, foi a falta de ferramentas
gene alvo. das, pelo menos teoricamente, informa- que nos permitissem intervir no genoma.
Alternativamente, vetores (em geral ções sobre toda e qualquer sequência do No entanto, uma luz parece ter sur-
derivados de vírus como adenovírus, genoma humano. gido com a descoberta da ação de RNAi
retrovírus ou vírus adeno-associados) em células humanas e de outros mamífe-
podem ser transduzir genes que expres- Interferindo na expressão gênica ros. Apesar, desta descoberta não datar
sam uma molécula de RNA palindrômi- in vivo. mais do que 6 anos, muito rapidamente
ca, que pode gerar uma duplex de RNA Em 2001, ao se anunciar pela pri- se mostrou que vetores virais ou peque-
na forma de grampo, conhecida como meira vez, com estardalhaço na mídia, nas moléculas de siRNA podem atuar
shRNA ( do inglês “short hairpin RNA”). a conclusão do sequenciamento do diretamente in vivo, o que já resultou em
Como o siRNA, shRNA tem como obje- genoma humano, a expectativa de que a mais de uma centena de trabalhos cientí-
tivo o silenciamento do gene alvo em informação gerada fosse útil para cura ficos publicados, no quais testes (a
estudo. Essa estratégia apresenta como de doenças de origem genética se espa- maior parte deles com resultados positi-
vantagens a possibilidade de uma efici- lhou rapidamente. Essa excitação rapi- vos) mostram o funcionamento de RNAi
ente transdução, pelo vírus, do gene de damente se transformou em frustração em experimentos com animais. Mesmo
shRNA, e, no caso de retrovírus, a obten-
Tabela 1: ALGUNS ALVOS PARA TERAPIA COM siRNA
ção de linhagens celulares que apresen-
tam o silenciamento do gene alvo de Tipo de doença Alvo Rota de administração
modo permanente. Neovascularização ocular VEGF Intravítrea
É importante destacar que a maior Doenças respiratórias Genes virais
parte dos genes identificados com o (RSV, Influenza) Intranasal

sequenciamento do genoma humano Hepatites virais Genes virais


(HBV e HCV) Intravenosa
não apresenta função conhecida. Além
Hipercolesterolemia APOB Intravenosa
disso, as estratégias de inativação
Tumores em geral Vários alvos, com foco em genes
gênica por nocaute (“knock-out”) envol- envolvidos em controle do ciclo celular Intratumoral

19
que na maior parte das vezes sejam siste na redução de expressão em genes estudos com siRNA em animais, e
empregados camundongos, há vários diferentes do alvo (Jackson et al, 2003) alguns são apresentados na tabela 1 (e
casos de experimentos pré-clínicos com em uma célula contendo siRNA, fenô- ilustrado na figura 2). Um orgão que tem
primatas não humanos (Zimmermann et meno este chamado de efeito “off- sido focado nesses estudos é o olho, e
al, 2006), e mesmo alguns Protocolos Clí- target”. Aparentemente, este efeito doenças genéticas associadas. A possi-
nicos em Fase I (de segurança no uso em ocorre pelo reconhecimento de sequên- bilidade de introdução localizada do
humanos), alguns já concluídos, sem cias similares, mas não idênticas, ao siRNA diretamente por injeção ocular,
que se verificasse nenhum efeito tóxico. alvo, que são encontradas na região 3' reduzindo a necessidade de material
É possível que em mais dois ou três anos não traduzida de vários genes, através (em relação a aplicações sistêmicas)
seja lançado o primeiro produto farma- do mecanismo de miRNA. Várias são as favorece o desenvolvimento e sucesso
cológico formado apenas por uma abordagens para superar o problema de desses estudos. Destacam-se proces-
pequena molécula duplex de RNA, que “off-target”, sendo que a identificação de sos de inibição do gene VEGF (“vascular
atue silenciando a expressão de um dois siRNA para um mesmo gene alvo endothelial growth factor”), que pode pro-
gene. Essa velocidade no desenvolvi- pode assegurar que o gene é responsá- mover vascularização próxima a retina,
mento de um produto baseado em siRNA vel pelo fenótipo celular observado. o que está associado à doença de dege-
é espantosa e deve-se a vários fatores, Uma vez definida uma ou mais neração macular relacionada a idade
incluindo os extensos trabalhos anterio- moléculas de duplexes de siRNA eficien- (AMD, do inglês “age-related macular
res para terapia gênica e a alta eficiência tes no silenciamento do gene alvo, o degeneration”), que provoca a perda de
dessas moléculas na modulação da desafio é a forma de entrega dessas visão em milhões de idosos no mundo
expressão gênica. Entretanto, várias bar- moléculas em um organismo. O uso de inteiro. Várias empresas farmacêuticas
reiras ainda têm que ser superadas, duplexes de RNA (siRNA) ou vetores já concluíram testes pré-clínicos em ani-
incluindo a informação recente de que a virais (shRNA) deve ser escolhido mais e iniciaram protocolos clínicos
transdução de shRNA, através de vírus dependendo do objetivo do trabalho. Fase I com humanos, sendo que pelo
adeno-associados, resultou na morte Moléculas pequenas e artificiais de menos alguns desses protocolos já con-
hepática dos animais. Provavelmente, siRNA estão se tornando cada vez mais cluíram essa Fase e está recrutando paci-
essa morte ocorreu devido a saturação populares pela versatilidade e facilidade entes para Fase II.
do mecanismo de RNAi, interferindo com com que se pode introduzi-las nas célu- A facilidade de introdução de molécu-
a exportação de miRNAs endógenos do las e in vivo. Além disso, são considera- las de siRNA em pulmão, através de ina-
núcleo para o citoplasma (Grim et al, das como drogas pequenas e assim lação com administração intranasal, tam-
2006). poderão ser usadas em pouco tempo bém tem propiciado resultados promis-
como produtos farmacêuticos comuns, sores. Doses relativamente baixas de
Desenvolvimento de Terapia por sem as questões de biossegurança nor- siRNA, com ou sem reagentes de trans-
siRNA. malmente levantadas para vetores vira- fecção como lipossomos, tem se mos-
O primeiro desafio a ser vencido para is. Questões como a instabilidade da trado eficientes na inativação de genes
o desenvolvimento desse tipo de terapia molécula de siRNA (sobretudo in vivo) virais que provocam doenças respirató-
é a definição de um gene alvo. Vários são está sendo contornada através de modi- rias. Entre os vírus alvos desses experi-
os problemas de saúde que resultam de ficações químicas que aumentam o mentos de terapia, destacamos o vírus
expressão aumentada de um ou mais tempo de ação, mantendo ou mesmo respiratório sincicial (RSV, que já está
genes, entre eles, tumores, hipercoles- melhorando suas características farma- sendo testado em protocolo clínico em
terolemia, infecções virais, etc (Tabela co-cinéticas, sem reduzir seu efeito no Fase I, pela empresa Alnylam Pharma-
1). E estes têm sido extensivamente silenciamento gênico. Além disso, pro- ceuticals) e mesmo o vírus influenza
investigados em trabalhos com células e cessos de entrega têm tido sucesso atra- H5N1, que provoca a temida gripe aviá-
em animais. A seleção de duplexes que vés do uso de vesículas de lipossomos e ria.
modulem especificamente o gene alvo complexos com polissacarídeos, que Outros alvos incluem a redução da
pode ser trabalhosa, e, como foi dito aci- além de aumentar a eficiência do pro- apoliproteína B (APOB) no fígado, o que
ma, existem atualmente vários algorit- cesso de entrega do siRNA nos tecidos em macacos resultou em significativa
mos que podem ser usados para obter do animal, também garantem a estabili- redução de colesterol no sangue. Vários
várias sequências candidatas para cada dade da molécula. vírus mortais como hepatite B, hepatite
gene. Essas sequências devem ser tes- C, rotavírus e HIV (vírus da imunodefi-
tadas em laboratório, preferencialmente Principais alvos para terapia por ciência humana, AIDS), também têm
através de culturas celulares. Um pro- RNAi: em busca do ouro. sido considerados excelentes alvos para
blema importante nessa escolha con- Vários são os alvos já testados para terapia com siRNA. Esses resultados
com vírus têm sido muito promissores,

20
porém pode haver problemas para o seu foram divulgados dados que indicam que deve ser analisada com otimismo caute-
bom funcionamento. Isto porque o meca- moléculas de dsRNA direcionadas a algu- loso, e ainda requer intenso trabalho de
nismo de RNAi pode ser novo para nós, mas regiões do promotor celular podem pesquisa, mesmo porque precisamos
mas acredita-se que a origem desse ativar genes e não silenciá-lo. Essas conhecer melhor o próprio mecanismo
mecanismo nas células ocorreu prova- moléculas foram batizadas como RNAa celular de RNAi.
velmente a bilhões de anos, como uma (“RNA activators”), o que pode ampliar
estratégia de combate a infecções virais. ainda mais a complexidade do sistema
Com isso, os vírus puderam, com o tem- (Li et al, 2006). Além disso, apesar dos Referências:
po, evoluir sistemas de defesa contra a mecanismos de RNAi serem descritos Barik S, Bitko V. Prospects of RNA interference the-
maquinaria celular. De fato, vários exem- apenas para eucariontes, recentemente rapy in respiratory viral diseases: update 2006.
Expert Opin Biol Ther. 2006 Nov;6(11):1151-60.
plos já mostraram que os vírus como foram propostos sistemas de RNAi simi-
RSV, HIV e vaccinia têm mecanismos lares para bactérias (Marakova et al, Dykxhoorn DM, Lieberman J. Knocking down dise-
ase with siRNAs. Cell. 2006 Jul 28;126(2):231-5.
específicos para suprimir a maquinaria 2006).
de RNAi celular e que existe, de fato, Da mesma forma, o uso de mecanis- Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A,
Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs
uma importante interface de relações mos de RNAi para processos terapêuti- mediate RNA interference in cultured mammalian
patógeno-hospedeiro, nas quais as molé- cos tem avançado muito rapidamente, cells. Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8.
culas de miRNA são efetores críticos (Ba- mas ainda temos um longo caminho a Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE,
rik e Bitko, 2006; Scaria et al, 2006). percorrer. Durante a década de '80, arti- Mello CC. Potent and specific genetic interference
by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.
A inibição da expressão de vários gos sobre Terapia Gênica anunciavam a Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11.
genes-alvo tem sido proposta como pos- 4a Revolução da Medicina. Apesar de
Grimm D, Streetz KL, Jopling CL, Storm TA, Pandey
sível terapia para vários tipos diferentes alguns resultados positivos terem sido K, Davis CR, Marion P, Salazar F, Kay MA. Fatality in
de tumores. Os alvos para combate ao alcançados, as dificuldades encontra- mice due to oversaturation of cellular
microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature.
câncer envolvem uma grande quanti- das e os problemas criados pela introdu-
2006 May 25;441(7092):537-41.
dade de vias: oncogenes, mediadores ção de vírus recombinantes em organis-
Jackson AL, Bartz SR, Schelter J, Kobayashi SV, Bur-
de ciclo celular e apoptose, genes envol- mos, infelizmente, não permitiram que chard J, Mao M, Li B, Cavet G, Linsley PS. Expres-
vidos em degradação e estabilidade pro- essa revolução ocorresse como previs- sion profiling reveals off-target gene regulation by
teica, angiogênese, moléculas relacio- to. O conhecimento acumulado, no RNAi. Nat Biotechnol. 2003 Jun;21(6):635-7. Epub
2003 May 18.
nadas a invasão metastática e adesão entanto serviu de base para a rápida
Li LC, Okino ST, Zhao H, Pookot D, Place RF, Ura-
celular. Além disso, siRNA também pode obtenção de resultados promissores
kami S, Enokida H, Dahiya R. Small dsRNAs induce
auxiliar no tratamento com radiação ioni- com RNAi. Além disso, o pequeno tama- transcriptional activation in human cells. Proc Natl
zante e agentes quimioterápicos. Nesse nho dessa molécula permite que seu tra- Acad Sci U S A. 2006 Nov 14;103(46):17337-42.
caso os alvos para silenciamento são tamento seja similar ao dispensado a dro- Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI,
genes que codificam proteínas anti- gas farmacêuticas, normalmente usa- Koonin EV. A putative RNA-interference-based
immune system in prokaryotes: computational
apoptóticas, de multi-resistência a dro- das em processos terapêuticos. É possí- analysis of the predicted enzymatic machinery, func-
gas e mesmo envolvidas no reparo de vel que essa Revolução Médica esteja tional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothe-
DNA, pois estas atuam na defesa da prestes a acontecer, finalmente tical mechanisms of action. Biol Direct. 2006 Mar
16;1:7.
célula aos agentes terapêuticos, que na (Dykxhoorn and Lieberman, 2006).
Morris KV, Chan SW, Jacobsen SE, Looney DJ.
maior parte das vezes atua causando Alguns sites de empresas que tem traba- Small interfering RNA-induced transcriptional gene
lesões no genoma celular (Pai et al, lhado com RNAi fazem grandes promes- silencing in human cells. Science. 2004 Aug
2005). sas (“RNAi pode auxiliar a combater toda 27;305(5688):1289-92.

e qualquer doença genética humana”, Pai SI, Lin YY, Macaes B, Meneshian A, Hung CF, Wu
TC. Prospects of RNA interference therapy for can-
Conclusões www.sirna.com), chegando a propor o
cer. Gene Ther. 2006 Mar;13(6):464-77.
O avanço obtido em tão pouco tempo uso de siRNA para reduzir o crescimento
Scaria V, Hariharan M, Maiti S, Pillai B, Brahmachari
de pesquisa na área é impressionante, de pêlos, em áreas em que isso for inde- SK. Host-virus interaction: a new role for
mesmo dentro da dinâmica ciência da sejado. Essa proposta, com o “knock- microRNAs. Retrovirology. 2006 Oct 11;3:68.
Biologia. A forma como enxergamos a down” do gene “hairless” (cuja versão Zimmermann TS, Lee AC, Akinc A, Bramlage B, Bum-
célula eucarionte mudou completa- mutada foi identificada em famílias cujos crot D, Fedoruk MN, Harborth J, Heyes JA, Jeffs LB,
John M, Judge AD, Lam K, McClintock K, Nechev LV,
mente nos últimos anos, e aparente- afetados não apresentam pêlos), per-
Palmer LR, Racie T, Rohl I, Seiffert S, Shanmugam
mente estamos apenas iniciando nossas mite se antever um mercado bilionário, S, Sood V, Soutschek J, Toudjarska I, Wheat AJ,
descobertas de como funcionam os que visa um objetivo mais estético do Yaworski E, Zedalis W, Koteliansky V, Manoharan M,
Vornlocher HP, MacLachlan I. RNAi-mediated gene
mecanismos de RNAs regulatórios na que médico. Entretanto, a aplicação de silencing in non-human primates. Nature. 2006 May
célula. Por exemplo, recentemente terapia baseada na molécula de siRNA 4;441(7089):111-4. Epub 2006 Mar 26.

21
Ciência in Foco

SEGURANÇA
DE ALIMENTOS
Novas ferramentas de gestão
dos riscos microbiológicos.
Bernadette Dora Gombossy de Melo Franco
Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Universidade de São Paulo

Histórico cia depende de prévia implantação das Bo- alimentos podem ser importados livremente
Durante décadas, os riscos associados as Práticas de Higiene. O principal foco do desde que não comprometam o nível de pro-
ao consumo de alimentos contendo micror- sistema HACCP é identificar e controlar as teção ao consumidor exigido pelo país im-
ganismos patogênicos eram avaliados ex- etapas de um processo produtivo que afe- portador. Esse nível de proteção estabeleci-
clusivamente através de padrões e critérios tam a produção de um alimento seguro, vi- do em um país denomina-se ALOP (Appro-
microbiológicos pré-estabelecidos. Para is- sando não ultrapassar limites que possam priate Level of Protection, ainda sem tradu-
so, agencias de vigilância da segurança colocar em risco a saúde da população. ção oficial para o português). No rastro do
dos alimentos e estabelecimentos produto- Embora todos os produtores que se preo- Acordo Sanitário e Fitossanitário e da Análi-
res de alimentos recorriam a análises mi- cupam com a segurança dos alimentos que se de Risco, o Codex Alimentarius oficiali-
crobiológicas para determinar se os alimen- produzem tenham sistemas HACCP im- zou novas ferramentas de gestão dos ris-
tos estavam de acordo com esses padrões plantados, é difícil correlacionar os limites cos microbiológicos, como os FSO (Food
e critérios e, conseqüentemente, se eram estabelecidos com os impactos à saúde pú- Safety Objectives) e PO (Performance
seguros do ponto de vista de saúde do con- blica, principalmente em países com dados Objectives) e os PC (Performance Criteria)
sumidor. No entanto, logo se percebeu que epidemiológicos precários. Também não é e MC (Microbiological Criteria), ainda sem
análises laboratoriais são uma ferramenta possível avaliar se planos HACCP seme- tradução oficial para a língua portuguesa,
muito limitada para assegurar a segurança lhantes, aplicados a processos produtivos descritos em seguida.
dos alimentos, principalmente quando o ín- diferentes, garantem um mesmo nível de
dice de contaminação é baixo. Por exem- proteção (ICMSF, 2002). Essas limitações, ALOP (Appropriate Level of Protection)
plo, em um processamento industrial em e a necessidade de estimar de forma mais Segundo a OMS, define-se ALOP como
que se produz um lote de alimento no qual adequada o impacto potencial da seguran- o nível de proteção considerado adequado
existe uma unidade contaminada para cada ça dos alimentos junto à saúde pública e os por um país que estabelece uma medida sa-
duzentas unidades produzidas (0,5%), mes- custos econômicos associados a doenças nitária ou fitossanitária para proteger a saú-
mo se forem analisadas 100 unidades do lo- transmitidas por alimentos, resultou no de- de humana, animal e de plantas em seu ter-
te, a probabilidade de aprovar esse lote é senvolvimento de uma nova ferramenta de ritório (ICMSF, 2002; ILSI, 2004). Um ALOP
61% (ICMSF, 2002). Os padrões e critérios gestão de segurança, denominada Análise pode ser expresso pelo número de casos
microbiológicos possuem maior aplicação de Risco. anuais aceitáveis (ou toleráveis) de uma de-
em produtos acabados, com pouca ou ne- A partir de 1995, com o Acordo Sanitário terminada enfermidade causada por um mi-
nhuma contribuição para a solução de pro- e Fitossanitário, da Organização Mundial crorganismo em um alimento para cada
blemas durante um processo produtivo do Comércio, a Análise de Risco tornou-se 100.000 habitantes de um país. Um ALOP
(REIJ & SCHOTHORST, 2000). uma estratégia importante na área de segu- envolve, portanto, três elementos: o alimen-
Era, portanto, necessário que os produ- rança alimentar (WTO, 1995). Esse Acordo to, o patógeno e o consumidor. Para ser es-
tores de alimentos agissem de forma pró- visa proteger a saúde humana, animal e de tabelecido, é necessário conhecer a fre-
ativa, utilizando outras ferramentas para as- plantas, impedir o protecionismo e prevenir qüência de determinada doença, o alimento
segurar a segurança dos alimentos. Nessa a criação de barreiras desnecessárias ao mais comumente envolvido e as caracterís-
esteira surgiu o sistema HACCP, cuja eficá- comércio internacional. Segundo o acordo, ticas das pessoas afetadas (idade, condi-

22
ções imunológicas, presença de outras pa- tração de um perigo microbiológico em um cessário ter evidencias da existência de um
tologias, etc), o que somente é possível alimento no momento do consumo de for- perigo real ou potencial nesse alimento, co-
quando se faz uma Análise de Risco. ma a atender o ALOP estabelecido (ICMSF, nhecer a microbiota da matéria prima, co-
2002; ILSI, 2004). Exemplos: enterotoxina nhecer os efeitos do processamento, deter-
Análise de Risco estafilocócica em queijo: <1 g/100g, aflato- minar as probabilidades e consequencias
Uma Análise de Risco tem três compo- xina em amendoim: <15 g/kg, L. monocyto- da contaminação e multiplicação durante
nentes, a Avaliação do Risco, a Gestão do genes em alimentos prontos para consumo: manipulação, saber as condições em que o
Risco e a Comunicação do Risco, do qual <100/g, Salmonella em produtos à base de alimento será armazenado e consumido, a
participam autoridades sanitárias, produ- frango, prontos para consumo: ausência categoria dos consumidores em risco, a rela-
tores, comunidade cientifica e consumido- em 100g. ção custo/benefício do uso do critério, bem
res (ICMSF, 2002; ILSI, 2004). como o uso pretendido do alimento. Segun-
Na Avaliação de Risco, determina-se PO (Performance Objectives) do o Codex Alimentarius, o estabelecimento
qual(is) o(s) perigo(s) de relevância em de- Um FSO, estabelecido para um alimen- de MCs deve levar em conta a importância
terminado alimento, qual o perfil do consu- to no momento de seu consumo, precisa do perigos microbiológico, a metodologia
midor, qual a concentração do(s) perigo(s) ser transformado em um parâmetro mensu- analítica a ser adotada, o plano de amostra-
nesse alimento, qual a concentração do pe- rável durante a cadeia produtiva. Assim, o gem, os limites e a tolerância de resultados
rigo que causa danos potenciais ao consu- PO corresponde a um objetivo de desem- que não atendem esses limites. São exem-
midor (avaliação dose-resposta) e qual a penho a ser atingido em um determinado plos de MCs: Listeria monocytogenes em
gravidade desses danos, chegando-se en- momento da cadeia produtiva de um ali- queijo fresco: máximo 100/g, Salmonella
tão a uma estimativa de risco. mento. Como um FSO, um PO deve aten- em produtos a base de frango prontos para
Na Gestão do Risco, são estabeleci- der o ALOP estabelecido. Exemplo: carca- consumo: ausência em 25g.
das as estratégias para manter os perigos ças de frango crus positivas para Salmonel-
microbiológicos sob controle. Nessa eta- la: máximo 15%. Conclusões
Sopram novos ventos na área de segu-
rança microbiológica de alimentos. De uma
"Na Gestão do Risco, são estabelecidas época em que os perigos microbiológicos
nos alimentos eram monitorados usando pa-
as estratégias para manter os perigos drões microbiológicos estabelecidos ape-
microbiológicos sob controle." nas em função do que era operacionalmen-
te alcançável, estamos passando para uma
nova fase, em que os critérios microbiológi-
cos dependem de informações relaciona-
pa, o gestor de risco, tendo em vista os da- PC (Performance criteria)
das com a saúde da população, como
dos gerados na Avaliação de Risco, verifi- Um PC corresponde à mudança na fre-
ALOPs, FSOs, POs e PCs. Mais do que
ca quais as opções possíveis para gerir es- quencia e/ou concentração de um perigo
nunca é necessário o trabalho interativo de
se risco (HACCP, Boas Práticas de Higie- em um alimento que deve ser obtida atra-
governos, cientistas, industriais e consumi-
ne, etc.), implementa essas ações e moni- vés da aplicação de uma ou mais medidas
dores.
tora seu funcionamento para saber se o ris- de controle, de forma a se alcançar um PO
co está, de fato, sendo controlado. A tarefa ou FSO. Entende-se por medida de contro-
do gestor de risco é avaliá-lo levando em le toda e qualquer ação que pode prevenir Referências Bibliográficas
CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION (CAC). Joint
conta não apenas características científi- ou eliminar um perigo ou reduzí-lo a um ní- FAO/WHO Food Standards Progamme. Codex Commit-
cas, mas também considerações sociais, vel aceitável. Exemplos: redução 12D de tee on Food Higiene. Principles and Guidelines for the
éticas e econômicas, decidindo quais Clostridium botulinum em conservas de bai- Conduct of Microbiological Risk Assessment. CAC/GL
30-1999. Secretariat of the Joint FAO/WHO Food Stan-
ações são necessárias e quais ações são xa acidez, redução 5D de Escherichia coli dards Programme. Rome: Food and Agriculture Organi-
possíveis. O157:H7 em cidra de maçã, redução 6D de zation of the United Nations. 1999.
Na Comunicação do Risco, as partes in- Listeria monocytogenes em alimentos refri- ILSI. Food Safety Objectives Role in Microbiological Fo-
od Safety Management. ILSI Europe Report Series. ILSI
teressadas (consumidores, produtores, go- gerados prontos para consumo. Europe 2004
vernos) são informadas a respeito da gra- I N T E R N AT I O N A L C O M M I S S I O N O N
vidade do problema, quando existente. MC (Microbiological Criteria) MICROBIOLOGICAL SPECIFICATIONS FOR FOODS
(ICMSF) Microorganisms in Foods 7 - Microbiological
Um MC é um padrão microbiológico que Testing in Food Safety Management. New York: Kluwer
FSO (Food Safety Objective) define a aceitabilidade do produto, ou lote Academic/Plenum Publishers. 2002..
Exaustivos trabalhos conjuntos da de produtos, baseado na ausência, presen- REIJ, M.W., SCHOTHORST, M. Critical notes on micro-
biological risk assessment of food. Braz. J. Microbiol.
ICMSF e Codex Alimentarius permitiram ça ou número de microrganismos por unida- v.31, p.1-8, 2000.
chegar a uma definição de consenso para de de massa, área ou lote. Um MC depen- WORLD TRADE ORGANIZATION. The WTO Agree-
esse novo conceito de gestão: um FSO cor- de, portanto, de análise laboratorial. Para se ment on the application of Sanitary and Phytosanitary
Measures (SPS Agreement). Disponível em
responde à máxima freqüência ou concen- estabelecer um MC para um alimento é ne- http://www.wto.org

23
Consensos

TESTES DE SENSIBILIDADE
IN VITRO A ANTIFÚNGICOS
2006
Introdução
A importância clínica das infecções Coordenadora
causadas por fungos aumentou de modo Arlete Emily Cury
substancial nas últimas décadas, devido Universidade de São Paulo
a vários fatores, como doenças ou trata-
mentos com perfil imunossupressor, e
uso excessivo de antibióticos (6, 55, 56,
63).
A incidência relativamente alta de in-
fecções graves, sobretudo as causadas
por fungos oportunistas e emergentes,
1 2 4
como espécies de Candida, Aspergillus,
Pichia e zigomicetos, é cada vez mais Colaboradores
preocupante, em vista do elevado grau 1. Claudete Rodrigues Paula
de mortalidade causado por essas infec- Universidade de São Paulo
ções e das dificuldades no seu controle, 2. Márcia de Souza Carvalho Melhem
além dos custos de hospitalização. Instituto Adolfo Lutz
Pesquisas realizadas nos Estados
3. Maria do Rosário Rodrigues Silva
Unidos e na Europa demonstram que Universidade Federal de Goiás
desde a década de 1979 até os dias atua-
is, a incidência de micoses invasivas cau-
4. Maria José Soares Mendes Giannini
Universidade Estadual Paulista
sadas por Candida aumentou 40 vezes,
ocupando o 3° ou o 4° lugar do total de
septicemias nosocomiais, e as causa- com a disponibilidade de novos antifún- mal de sensibilidade e o valor modal da
das por Aspergillus aumentou 6,5 vezes, gicos e estratégias terapêuticas, a de- CIM. Tomando-se esta curva como base,
com índices de mortalidade de até 40% e tecção de resistência poderia ser vital no quando um teste resulta em um valor de
85%, respectivamente. Estes índices de- momento de eleger uma alternativa tera- CIM alto, situado no extremo ou fora do
vem ser considerados alarmantes, por- pêutica (31,49,51,79). gráfico, do ponto de vista microbiológico
que a maioria dos pacientes que morrem Do ponto de vista microbiológico e clí- o isolado é resistente, pois não está den-
por infecção fúngica invasiva tem doen- nico, o conceito de sensibilidade e resis- tro dos limites de sensibilidade da maio-
ça subjacente para as quais, atualmen- tência é aplicado para classificar um iso- ria dos membros de sua espécie. A sensi-
te, existem tratamentos eficazes (2, 13, lado como sensível ou resistente (63). bilidade de isolados de Candida, e de ou-
15, 51, 80, 97, 100). No aspecto microbiológico, uma cepa é tros gêneros de leveduras, varia confor-
As falhas no tratamento dessas infec- considerada resistente a um antifúngico me a espécie e, dentro de uma mesma es-
ções podem ser atribuídas à resistência quando a concentração inibitória mínima pécie podem existir cepas com perfis de
clínica ou à resistência microbiológica. A (CIM) é mais elevada que a habitualmen- sensibilidade diversos. A resistência po-
determinação de correlação entre am- te encontrada para a espécie dessa ce- de ser de três tipos: intrínseca, primária
bas as resistências ainda é bastante limi- pa. Para definir a CIM habitual do anti- ou secundária. A intrínseca é dita quan-
tada, o que aumenta a importância de es- fúngico frente a essa espécie, é neces- do nenhum membro de uma espécie é
tudos para se conhecer o perfil de sensi- sário realizar um número representativo sensível ao antifúngico, ou seja, todos
bilidade de cepas clínicas e o espectro de testes com diferentes isolados e dese- são insensíveis. Denomina-se resistên-
de ação dos antifúngicos. Além disso, nhar a distribuição gráfica da curva nor- cia primária quando, dentro de uma espé-

24
cie normalmente sensível a determinado alguns deles foram até agora suficiente- Leitura do teste
antifúngico, encontra-se uma cepa com mente avaliados em estudos amplos e A leitura do teste é visual e na técnica
resistência natural contra o mesmo, sem bem conduzidos a fim de comprovar boa de microdiluição usa-se um espelho pa-
necessidade de contato prévio com a dro- reprodutibilidade intra e inter- ra comparar a turvação em cada cavida-
ga. laboratorial, além de correlação com a de a do controle de crescimento, sem adi-
Resistência secundária ocorre quan- evolução clínica dos pacientes. Os mais ção de droga. Valores de 0 a 4 são atribu-
do uma cepa, previamente, sensível de- conhecidos e difundidos são os do Natio- ídos de acordo com o grau de inibição,
senvolve resistência à droga após ter si- nal Committee for Clinical Laboratory considerando a seguinte equivalência: 0
do exposta a ela. Do ponto de vista clíni- Standards (NCCLS), denominado, des- = oticamente claro, significando inibição
co pode haver isolados considerados re- de 2005, Clinical and Laboratory Stan- total de crescimento, 1 = levemente tur-
sistentes em termos microbiológicos, dards Institute (CLSI), publicados a par- vo, 2 = proeminente redução da turva-
mas que respondem à terapia, desde tir de 1985, sob a forma de documentos. ção, 3 = leve redução da turvação, 4 = au-
que a concentração do fármaco no local Para provas de sensibilidade aos anti- sência de inibição. A CIM para anfoterici-
da infecção pode estar muito mais eleva- fúngicos com leveduras a última versão na B é a menor concentração que inibiu
da do que as CIMs encontradas para de 2002 é a M27-A2 (73) e suplemento totalmente o crescimento, correspon-
aqueles isolados. Portanto, um isolado M27-S2 publicado em 2006 , e para fun- dendo ao valor 0. O valor de CIM para os
resistente do ponto de vista clínico é gos filamentosos a M38-A de 2004 (74). azólicos e 5FC é a menor concentração
aquele que continua a crescer e levar à Entretanto, sua aplicação é restrita a que resulta em proeminente redução da
sintomatologia, apesar da concentração alguns fármacos, para determinados gê- turvação, ou seja, valor 2 . Na microdilui-
do fármaco ser máxima no local da infec- neros e espécies de fungos e a correla- ção, o valor 2 corresponde à 50% de ini-
ção (31). A classificação de uma levedu- ção entre os resultados destas provas e bição. Esse critério de leitura, para dro-
ra como resistente deveria levar em con- a resposta in vivo, ainda não está total- gas azólicas minimiza o erro decorrente
ta, além da CIM, a concentração do anti- mente estabelecida. Além disso, sua exe- do fenômeno trailing ou crescimento resi-
fúngico no sítio da infecção (7,67). A rela- cução é complexa e requer tempo pro- dual, apresentado por algumas espéci-
ção numérica do CIM com a concentra- longado para leitura de resultados, o que es, p.ex. C.tropicalis. Este ocorre quan-
ção da droga obtida in vivo é denomina- limita, entre outros fatores, a utilização do a turvação se mantém, mesmo com o
da CIM farmacodinâmico. das mesmas como provas rotineiras. aumento da concentração da droga.
Na última década foram avaliados vá- No Brasil, a Agencia Nacional de Vigi- A leitura de inibição do crescimento
rios métodos para provas de sensibilida- lância Sanitária (ANVISA) adquiriu os di- da levedura por ação da droga é realiza-
de in vitro a antifúngicos e alguns deles reitos autorais, para a língua portugue- da após 48 horas de incubação para leve-
são atualmente indicados como referên- sa, dos documentos CLSI/NCCLS M27- duras do gênero Candida spp. e 72 horas
cia, servindo para validar outras provas, A2 e M38-A e tornou-os disponíveis, atra- para Cryptococcus spp. Esse período po-
incluindo sistemas comerciais. De modo vés do site: http://www.anvisa.gov.br. de ser reduzido, respectivamente, para
geral, um mesmo método não contempla 24h e 48h, como referido no documento.
o estudo de distintos tipos de fungos, i.e., Método CLSI M27-A2 e Modifica- Para a maioria dos isolados, a diferença
leveduras e fungos filamentosos (bolo- ções: Características Gerais entre leitura de 24 horas versus 48 horas
res) e, para tanto, foram necessárias al- Técnica utilizada e agentes avalia- é mínima e não altera o perfil de sensibili-
gumas modificações técnicas. Mesmo dos dade (i.e. não se altera quando o isolado
assim, os estudos de sensibilidade para O M27-A2 é o método mais bem estu- é lido como “sensível” ou “resistente”).
fungos filamentosos ainda podem ser dado e o documento pertinente contém Entretanto, alguns isolados mostram au-
considerados precários quando compa- técnicas de diluição em meio líquido, ma- mento significativo de CIM ao longo do
rados aos de leveduras. crodiluição em tubos de ensaio e micro- tempo (p.ex., para fluconazol varia de
Devido a diversos fatores, a aplica- diluição em placas de microtitulação, pa- 0,5 µg/mL com 24 horas de incubação a
ção dos testes de sensibilidade para fun- ra determinar a CIM. Foi desenvolvido pa- 256 µg/mL com 48 horas).
gos ainda é limitada e os estudos relacio- ra testes com leveduras, incluindo espé- Para auxiliar a resolução desse pro-
nados aos mesmos podem ser conside- cies de Candida e de Cryptococcus, fren- blema a metodologia M27-A2 para Can-
rados muito aquém daqueles estabeleci- te à anfotericina B, 5-fluorocitosina e azó- dida proporcionou tanto limites de CIM
dos para bactérias. Os testes de sensibi- licos, incluindo cetoconazol, fluconazol, com 24 horas quanto com 48 horas de in-
lidade a antifúngicos devem ser realiza- itraconazol, voriconazol, além de posa- cubação para as duas cepas controle de
dos a partir de cultivo puro, após a identi- conazol e ravuconazol, estes últimos ain- qualidade (CQ) e oito agentes antifúngi-
ficação do isolado, de modo ideal em es- da não comercializados no Brasil. Indica cos sistêmicos.
pécie, e sua manutenção até a análise de- o uso de meio líquido RPMI-1640, inócu- O ideal é que as placas sejam lidas
ve seguir normas específicas para ga- lo inicial de 1-5 x 106 cel/mL, ajustado com 24 horas de incubação se houver
rantia da qualidade das provas (27). por espectrofotômetro a 530nm, incuba- crescimento suficiente.
ção a 35°C, uso de
Métodos de referência cepas-controle ATCC. É essencial uti- Interpretação dos resultados
Entre os testes preconizados para de- lizar os reagentes do modo como reco- Os antifúngicos para os quais existe
tectar resistência a antifúngicos, apenas mendado. consenso (73) quanto aos pontos de cor-

25
te são: fluconazol, itraconazol e 5- quelas preconizadas nos métodos de re- Modificações no método
fluorocitosina, conforme expresso na ta- ferência. O método europeu de referência, indi-
bela 1. Frente a anfotericina B a maioria das cado pelo grupo europeu European Com-
Esses parâmetros baseiam-se em va- espécies de Candida é inibida em valo- mittee on Antibiotic Susceptibility Testing
lores de doses séricas, estudos realiza- res de CIM entre 0,25 e 1,0 µg/mL. Entre- (EUCAST) para avaliar leveduras fer-
dos principalmente em pacientes com tanto, deve-se ressaltar que o método mentadoras, traz modificações no senti-
candidíase orofaríngea e em alguns ca- M27-A2 não permite de modo consisten- do de suprir algumas falhas encontradas
sos de infecções profundas. A correla- te detectar cepas resistentes. Valores de no método norte-americano de referên-
ção entre resistência in vitro e in vivo é CIM > 1,0 µg/mL merecem atenção por- cia. Propõe encurtar o período de incu-
mais evidente na candidíase orofarín- que podem indicar resistência. Estudos bação, aumentar a concentração do inó-
gea. A discordância para outras formas é com outros meios, tais como Antibiotic culo e realizar leitura acurada, por meio
atribuída às numerosas variáveis que in- Medium 3 suplementado com 2% de gli- de espectrofotometria, para calcular a ini-
fluem na resposta ao tratamento e na cose, mostraram a possibilidade de de- bição (104). Mesmo assim, apresenta li-
complexidade dos pacientes com infec- tecção mais segura de resistência, mas mitações técnicas como as descritas pa-
ções invasivas, mas os estudos de corre- esse meio apresenta substancial varia- ra o M27-A2, incluindo dificuldades para
lação relacionados aos mesmos foram bilidade entre lotes. detectar a resistência à anfotericina B,
realizados sem especificação por doen- ocorrência de crescimento residual (trai-
ça de base e incluindo poucas cepas Correlação “in vitro-in vivo” ling) em testes com azólicos e fluorocito-
com resistência in vitro (31,108). Para vo- Quando as provas de sensibilidade sina. Mostra correlação com os valores
riconazol, existe a sugestão do CIM com são utilizadas como subsídio a clinica na de CIM obtidos com o método de referên-
valor igual ou maior a 4µg/mL para clas- detecção de resistência aos antifúngi- cia, porém difere quanto aos pontos de
sificar cepas resistentes e menor ou cos, a correlação entre os resultados obti- corte propostos pelo CLSI, os quais não
igual a 1µg/mL para cepas sensíveis, dos e a resposta à terapêutica não é, de podem ser aplicados para classificar as
sendo CIM de 2µg/mL relativo a cepas modo geral, considerada boa. Os pontos cepas avaliadas pelo método EUCAST.
com sensibilidade dependete da dose de corte estabelecidos pelo CLSI para in- Para EUCAST os pontos de corte pro-
(S-DD). terpretar os resultados dessas provas postos para fluconazol são: > 16 µg/mL
com fluconazol, itraconazol, fluorocitosi- para cepas resistentes, 4 ou 8µg/mL pa-
*Sensibilidade dependente de do- na e voriconazol são aplicáveis apenas ra S-DD e < 2 para cepas sensíveis.
se em infecções por leveduras e têm utilida-
Os mesmos pontos de corte são utili- de limitada, dependendo da forma clini- Método CLSI M38-A: Característi-
zados em testes com isolados de ca (30,42,79,108). cas Gerais
Cryptococcus spp., para os quais pa- Esse método é capaz de detectar re- Técnica utilizada e agentes avalia-
rece existir certa correlação entre CIM sistência in vitro a antifúngicos azólicos. dos
elevada e falha de tratamento (73,111). Os dados disponíveis indicam que existe O documento M38-A descreve um mé-
Entretanto, há propostas diferentes da correlação entre resistência in vitro e fa- todo de microdiluição para determinar
preconizada no método de referência, lha terapêutica, porém não há entre sen- sensibilidade em alguns fungos filamen-
sendo indicada CIM de 16µg/mL como sibilidade e falha terapêutica (42). tosos, incluindo Aspergillus spp, Fusari-
preditor de falha terapêutica para fluco- Estudos relacionados aos métodos um spp, Pseudallescheria boydii, Spo-
nazol (3); este valor é menor que o pro- de referência continuam em andamento, rothrix schencki e Rhizopus spp., causa-
posto no documento M27-A2 (NCCLS, de tal modo que recentemente o CLSI pu- dores de infecções invasivas. Não exis-
2002). blicou o documento M27-S2 (24), um su- te, porém, comprovação definitiva de
As pesquisas com anfotericina B se plemento do M27-A2, que inclui critérios que o meio de cultura e o procedimento
encontram em fase menos avançada de para interpretação dos resultados em tes- para a preparação do inóculo, indicados
desenvolvimento. Observou-se apenas tes de microdiluição, com pontos de cor- no documento, sejam os mais adequa-
certa correlação entre fracasso terapêu- te para os novos antifúngicos sistêmicos dos. O meio de cultura recomendado é o
tico e CIM = 2 ug/mL (76)) ou = 0,38 atualmente disponíveis. A correlação en- mesmo indicado no documento M27-A2
ug/mL (20), mas esses trabalhos foram tre esses resultados e a resposta clínica, e o inóculo deve ser ajustado, com auxí-
realizados com técnicas diferentes da- ainda deve ser mais bem avaliada. lio de espectrofotômetro, para conter 0,4
x 104 a 5 x 104 UFC/mL. Entretanto, a
Tabela 1. Pontos de corte para interpretar os testes de sensibilidade em leveduras densidade óptica (DO) a 530nm, requeri-
(73). Dados em µg/mL da no ensaio, depende do tamanho dos
conídios ou esporangiosporos do fungo
Antifúngico Sensível S-DD (*) Intermediária Resistente em estudo. Há necessidade de adição de
Fluconazol >=8 16-32 - >=64 Tween 20, como agente surfactante, pa-
ra preparar inóculo de Aspergillus spp.
Itraconazol <=0,125 0,25-05 - >= 1 Os principais problemas relaciona-
5-fluorocitosina <=4 - 8-16 >= 32 dos ao teste incluem: dificuldade na
padronização do inóculo, crescimen-
*Sensibilidade dependente de dose

26
to lento de algumas espécies, fungos dos valores de CIM é maior que 64 teste, também requer rigoroso controle
que não produzem esporos e ausência µg/mL, sendo exceções apenas alguns do pH, ao redor de 7,0 ± 0,3, para preser-
de pontos de corte. Embora estudos adi- isolados de fungos dimórficos e derma- var a capacidade inibitória.
cionais recomendem outros processos tófitos. Para itraconazol, voriconazol e 3. Inóculo e cepas controle. Embo-
de mensuração (UFC/mL e cel/mL) no posaconazol o ponto de leitura é bem de- ra os métodos de referência descrevam
preparo do inóculo (43,54,98), não exis- finido e os valores de CIM, para a maioria com precisão todos os procedimentos pa-
te, ainda, um consenso para que substi- dos fungos filamentosos, estão entre ra preparar e executar os testes, deve-se
tuam aquele indicado no método de refe- 0,03 e 16 µg/mL. Ainda não foram defini- ressaltar a importância da realização de
rência. dos pontos de corte para testes contagem em placa ou em hematocitô-
Além disso, esse teste apresenta as com esses fungos e os dados disponí- metro, a partir da suspensão inoculada,
mesmas limitações técnicas apontadas veis de estudos in vivo são muito limitados. para se comprovar a isenção de erros na
para os testes de sensibilidade em le- preparação do inóculo quando na im-
veduras (31,49). Correlação “in vitro-in vivo” plantação do método. Também é impor-
Os valores adotados para interpretar tante lembrar que cepas-controle devem
Leitura do teste os resultados desse teste baseiam-se ser incluídas em todas as provas a fim de
As placas de microtitulação são incu- nos propostos para leveduras. Entretan- validar os resultados.
badas a 35°C e podem ser lidas após 24 to, nos últimos anos foram relatados ca- 4. Leitura dos resultados. Quando
horas para espécies de Rhizopus; 48 ho- sos de falhas terapêuticas com itracona- se realiza leitura visual em provas com le-
ras para espécies de Aspergillus, Fusari- zol em infecções por Aspergillus com veduras, o erro mais comum é interpretar
um e Sporothrix; 72 horas para Pseudal- CIM = 8 mg/L (32,34). Para anfotericina crescimento residual, observado com
lescheria boydii (fase sexuada de Sce- B, alguns autores verificaram que CIM = azólicos, como significativo de resistên-
dosporium apiorpermum). A turvação de- 2 mg/L para espécies de Aspergillus ou cia. Isto só pode ser evitado com capaci-
ve ser avaliada com auxílio de espelho e de Rhizopus, isoladas de modelos ani- tação adequada.
comparada com o controle de cresci- mais, era compatível com resistência te- 5. Procedimentos em situações es-
mento sem adição de droga. A classifica- rapêutica (33). peciais. Uma das principais limitações
ção numérica varia de 0 a 4, como descri- das provas de sensibilidade a antifúngi-
to para leveduras no M27-A2. A CIM para Execução dos Testes: recomenda- cos é o fato de não serem aplicáveis a to-
anfotericina B, itraconazol, voriconazol e ções das as espécies. Fungos de crescimento
para posaconazol é a menor concentra- 1. Identificação do isolado. Isolados lento como Cryptococcus, Geotrichum,
ção com classificação 0 (oticamente cla- de leveduras devem ser identificados, no Trichosporon e muitas espécies filamen-
ra). A CIM para 5-fluorocitosina, flucona- mínimo, em Candida albicans, Candida tosas não crescem bem nos meios de cul-
zol ou para cetoconazol é a menor con-
centração com classificação 2 ou inferior
(50% de redução de crescimento). "Os principais problemas no teste da
microdiluição incluem: dificuldade na padronização
Interpretação dos resultados
Para anfotericina B o ponto de leitura
do inoculo, crescimento lento de algumas
é bem definido e os valores de CIM nos espécies, fungos que não produzem esporos
testes com a maioria dos fungos filamen- e ausência depontos de corte."
tosos se encontram entre 0,5 e 2,0
µg/mL.
Entretanto, algumas espécies como spp. ou outro gênero, para se proceder à tura recomendados para estudos de sen-
Aspergillus terreus, Acremonium stric- avaliação apenas com aqueles antifúngi- sibilidade, o que influi na confiabilidade
tum, Pseudallescheria boydii e Scedos- cos para os quais existe reconhecida re- do resultado, diminuindo sua utilidade te-
porium prolificans são inibidas somente sistência do isolado em questão. rapêutica. Modificações nos métodos de
em valores de CIM de 2 a 16 µg/mL. 2. Antifúngicos. Os antifúngicos de- referência para contemplar fungos de
Embora poucos dados estejam disponí- vem ser obtidos em forma de principio ati- crescimento lento foram propostas
veis, valores de CIM acima de 2 µg/mL fo- vo, solicitando-os às respectivas empre- (27,31,107), mas nenhuma delas foi até
ram associados a fracassos terapêuti- sas produtoras ou adquirindo-os de um agora validada. Por isso, a decisão em
cos em casos de aspergilose invasiva. O distribuidor credenciado. Devem ser utilizá-las requer que os resultados se-
meio RPMI pode, no caso de fungos fila- acompanhados de informações perti- jam interpretados com cautela.
mentosos, também ser inadequado para nentes como número do lote, potência, 6. Informe dos resultados. Os re-
detectar resistência a anfotericina B. Pa- prazo de validade e condições de con- sultados dos testes de sensibilidade aos
ra 5-fluorocitosina a maioria dos valores servação. As preparações para uso clíni- antifúngicos devem ser informados co-
de CIM é maior que 64 µg/mL, sendo as co não devem ser empregadas, uma vez mo o de outros antibiogramas quantitati-
únicas exceções alguns isolados de que podem conter excipientes ou formu- vos, referindo o valor de CIM. Os méto-
Aspergillus e fungos demáceos. De mo- lações indesejáveis. O processamento dos recomendados pelo CLSI também
do similar, para o fluconazol a maioria dos antifúngicos, em qualquer etapa do permitem informar se o isolado é: “sensí-

27
vel”, “sensível dependente de dose” ou ria, os pontos de corte para sensibilidade
“resistente”, seguindo os pontos de corte ou resistência são estabelecidos com as Sistemas comerciais
recomendados nos documentos perti- técnicas de referência. Com o objetivo Existem vários sistemas comerciais
nentes. de atender a esses requisitos, foram de- para realizar testes de sensibilidade aos
7. Uso na rotina. É recomendável senvolvidos métodos considerados rápi- antifúngicos, incluindo, entre outros,
que as técnicas de diluição em caldo co- dos, incluindo o método preconizado pe- ASTY (Kyokyuto Pharma-Centical, Ja-
mo as dos métodos de referência sejam lo CLSI no documento M44-A (72). Embo- pão), ATB FUNGUS 2 (Api-BioMérieux,
realizadas por laboratórios que tenham ra alguns deles tenham demonstrado França), Candifast (International Micro-
um número elevado de isolados, além de boa concordância com os de referência, bio, Itália), Etest (AB Biodisck, Suécia),
experiência suficiente na execução dos o que pode permitir que sejam úteis no Fungitest (Bio-Rad, Farança), Integral
testes. Executá-las de modo esporádico auxílio a recomendações terapêuticas, Systems Yeast (Liofilchen Diagnostics,
impede um controle efetivo do teste, o esses métodos também devem ter con- Itália), Mycostandard (Institut Pasteur,
que pode produzir erros. Quando se tem trole de qualidade adequado (27,39,49). França), Mycototal (Behring Diagnostic,
um número baixo de isolados ou neces- França) e Sensititre Yeast One (Trek Di-
sidade de técnicas de menor complexi- Método CLSI M44-A agnostic System, EUA). Apenas o Etest,
dade indica-se o uso de métodos dispo- O M44-A descreve uma prova sensí- o ATB Fungus 2 e o Candifast têm distri-
níveis no comércio para analisar a sensi- vel e prática, validada para testes de buidores no Brasil.
bilidade aos azólicos. Estes métodos, de sensibilidade em Candida spp., utili- Diversos desses sistemas foram bem
difusão por discos, fitas e microdiluição zando discos impregnados com flucona- estudados, mas apenas alguns deles de-
devem ser executados dentro de progra- zol ou com voriconazol. Este método ain- monstraram potencial suficiente para se
mas de qualidade interno e externo, jun- da não foi validado para provas com ou- constituir em uma alternativa para os la-
to a um laboratório de referência. Esses tros gêneros de leveduras e com fungos boratórios assistenciais. Entre estes se
métodos permitem fornecer informa- filamentosos. O documento inclui crité- destacam o ATB FUNGUS 2, o Sensititre
ções de modo relativamente rápido, que rio de interpretação para os diâmetros de YeastOne e o Etest, os quais mostraram
podem ser de utilidade clínica. halos obtidos com discos de fluconazol e boa reprodutibilidade e indiscutível capa-
8. Restrições (27,49) • Ainda exis- valores esperados para cepas-padrão. cidade em detectar a resistência in vitro
tem dificuldades técnicas para se detec- Indica o uso de agar Müeller-Hinton su- aos azólicos, sobretudo ao fluconazol,
tar resistência a anfotericina B; plementado com 0,2% de glicose e 0,5 quando comparados ao método de refe-
• O crescimento residual (trailing) des- µg/mL de azul de metileno. O agar Müel- rência para leveduras (11,38).
crito em testes com fármacos fungistáti- ler-Hinton é facilmente encontrado no co-
cos, como os azólicos e a fluorocitosina, mércio e mostra aceitável reprodutibili- ATB FUNGUS 2®
ainda não está controlado; dade entre lotes, a glicose proporciona Este método de microdiluição para le-
• A interpretação dos resultados deve adequado crescimento para a maioria veduras apresenta boa correlação com
ser feita com cuidado. Não existem pon- das leveduras e a adição do azul de meti- os de referência norte-americano e euro-
tos de corte para muitas espécies e anti- leno realça a definição do halo. O pH do peu. Consiste de uma cartela plástica
fúngicos; meio deve estar entre 7,2 e 7,4 à tempe- com cânulas contendo diversas concen-
• Essas técnicas mostram baixa cor- ratura ambiente e após gelificação. O inó- trações de 4 antifúngicos: fluconazol,
relação in vitro-in vivo em casos de culo é ajustado com espectrofotômetro e itraconazol, anfotericina B e 5-
micoses invasivas; o teste é incubado a 35°C, por 24 horas. fluorcitosina. O inóculo da levedura é
• O método M38-A não pode ser utili- Algumas cepas para as quais ocorre preparado com solução salina 0,85%
zado com fungos filamentosos que não crescimento insuficiente após 24 horas com base na escala 2 de MacFarland e a
produzam conídios ou esporangiospó- podem requerer leitura após 48 horas de reação de inibição de seu crescimento
ros, requerendo, para tanto, adaptações incubação. Discos de papel contendo flu- ocorre após 24-48 h de incubação à
ou modificações. conazol (25 µg) ou voriconazol (1 µg) en- 35ºC. A leitura é realizada a “ olho nu”
contram-se comercialmente disponíve- com base na turvação obtida em cada câ-
Métodos Rápidos is. O teste é de baixa complexidade, equi- nula. Os resultados são fornecidos em
Os procedimentos indicados nos refe- valente ao antibiograma, e seu custo não CIM (µg/mL) de cada droga.
ridos documentos do CLSI e EUCAST é elevado, sendo, portanto, adequado co-
não são aplicáveis a estudos de sensibi- mo método de triagem. Sensititre®YeastOne
lidade rotineiros como os realizados em Essa prova somente classifica os iso- Este é um método de microdiluição
laboratórios clínicos. Estes requerem lados em “sensível”, “sensível depen- em caldo, baseado no padrão M27-A2.
testes de execução simples, leitura fácil dente de dose” e “resistente”, não sendo Cada teste consiste de uma placa de
e resultado rápido para que tenham utili- possível determinar com precisão valo- microtitulação descartável a qual con-
dade terapêutica, além de custo relativa- res de CIM (66,72,75,84). Recomenda- tém concentrações de seis agentes anti-
mente baixo. Entretanto, a utilização des- se que todas as cepas que aparecem co- fúngicos, incluindo anfotericina B, ceto-
ta prova só pode ser indicada quando mo “resistentes” sejam confirmadas por conazol e itraconazol (0,008 a 16
apresenta boa concordância com a téc- meio do método de microdiluição M27- µg/mL), além de fluconazol (0,125 a 256
nica de referência, uma vez que, em teo- A2 (16,39,49). µg/mL) e 5-fluorocitosina (0,03 a 64

28
µg/mL). O teste contém azul de Alamar no pode ocorrer sob forma de colônias de todologia são necessários, ainda, estu-
como indicador colorimétrico, o qual me- tamanho menor no interior da elipse de dos mais amplos, relacionados à repro-
lhora a leitura do ponto de inibição medi- inibição do que as do exterior. Essas colô- dutibilidade dos resultados e à concor-
ante mudança de cor azul para rosa. Os nias não devem ser consideradas para dância destes com a resposta terapêuti-
resultados são expressos em CIM e estu- determinação da CIM (1,27). ca (106).
dos comparativos com os métodos CLSI Com anfotericina B, toda colônia no
mostraram resultados equivalentes interior da elipse de inibição, indepen- Indicações dos testes de sensibili-
(28,61,87,94). dentemente de seu tamanho, deve ser dade a antifúngicos
De modo geral, o Sensititre YeastOne considerada para a leitura da CIM. Não Casos individuais
é um teste reprodutível, fácil de ser exe- existem pontos de corte para interpreta- Considerando-se o desempenho das
cutado, os pontos de leitura são clara- ção dos resultados obtidos nesta técnica técnicas comerciais, assim como as limi-
mente visíveis. Os reagentes apresen- comercial, mas recomenda-se que se- tações acima citadas para os métodos
tam prazo de validade amplo e o teste jam seguidos os indicados nos métodos de referência, a realização de provas de
também pode ser aplicado a fungos fila- de referência (1,27). Este teste parece sensibilidade a antifúngicos em labora-
mentosos, sobretudo aqueles com ele- ser o mais indicado para detectar resis- tórios assistenciais é recomendada ape-
vada produção de esporos como Asper- tência a anfotericina B (83,110). nas em situações especiais. Estas reco-
gillus (17). Etest é simples de ser realizado e os mendações se baseiam em pareceres
antifúngicos podem ser individualmente de especialistas, frente a evidências ci-
Etest® analisados. Foi amplamente avaliado entíficas da importância da aplicação
Este é um método de difusão em ágar tanto para leveduras quanto para fungos destas provas para a decisão terapêuti-
que utiliza uma tira contendo um gradi- filamentosos e a maioria dos trabalhos ca. Assim, estes testes são recomenda-
ente de concentração do antimicrobia- demonstrou uma concordância aceitá- dos para cepas provenientes de infec-
no, de tal modo que permite a determina- vel com os métodos do CLSI e EUCAST ções invasivas e de pacientes com al-
ção de CIM. Etest é utilizado para prova (10,28,35,65,70,94). A correlação entre gum tipo de imunossupressão. Também
de sensibilidade com vários antibacteri- os resultados in vivo-in vitro em casos de são indicados em casos de fracasso tera-
anos e está também disponível para candidíase vaginal (25) e bucal (102) foi pêutico ou pacientes que receberam pro-
agentes antifúngicos, incluindo anfoteri- alta. filaxia antifúngica prévia. Todas as amos-
cina B, 5-fluorocitosina, cetoconazol, tras de leveduras pertencentes a espéci-
itraconazol, voriconazol e caspofungina, Execução dos Testes: Recomen- es pouco freqüentes, das quais se des-
com gradiente de concentração varian- dações conhece o perfil de sensibilidade in vitro
do de 0,002 a 32µg/mL, e fluconazol, 1. Todos os procedimentos devem se- devem ser submetidas ao teste. Nessas
com gradiente de 0,016-256 µg/mL. guir as normas de biossegurança em mi- situações, os testes de sensibilidade po-
As dificuldades do Etest em provas crobiologia, as quais devem estar conti- dem auxiliar a eleger o tratamento mais
para fungos estão usualmente relacio- das em um protocolo normalizado do la- adequado ou a variar a estratégia tera-
nadas à escolha do meio de cultura a ser boratório. pêutica específica, aumentando a dose
utilizado e à definição do valor de CIM, 2. Embora os métodos rápidos pos- do antifúngico, utilizando outro fármaco
correlacionado à zona de inibição de sam ser uma alternativa para laboratóri- ou instaurando uma terapia combinada.
crescimento. O agar RPMI, suplementa- os assistenciais, só devem ser emprega- Além disso, a detecção de resistên-
do com 0,2% de glicose de acordo com o dos aqueles para os quais existem estu- cia em uma espécie isolada de determi-
CLSI, é recomendado por diversos auto- dos demonstrando boa correlação com nado caso individual, pode servir como
res e pelo fabricante (1,9,19). Recente- os métodos de referência. um dado importante para vigilância de re-
mente, o uso do agar Müller-Hinton, sistência na espécie em questão
acrescido de azul de metileno, foi preco- Outros Métodos Rápidos (14,31,40,42,49,57,59).
nizado como uma alternativa menos one- As dificuldades relacionadas à exe-
rosa e mais eficaz que o cução das técnicas de referência tam- Estudos epidemiológicos
RPMI (10,85). bém estimularam a pesquisa de outros Os estudos epidemiológicos são con-
Nesse teste, a CIM é a concentração métodos, considerados rápidos, para siderados fundamentais. A vigilância epi-
de antifúngico no ponto de intersecção aplicação em provas de sensibilidade a demiológica das infecções fúngicas hos-
da elipse de inibição de crescimento com antifúngicos. pitalares e ambulatoriais pode auxiliar
a tira. A leitura pode ser subjetiva devido Entre esses métodos, destaca-se a ci- no conhecimento de possíveis reserva-
ao efeito “trailing” observado com algu- tometria de fluxo, que é mais bem estu- tórios, vias de transmissão e fatores de
mas cepas. Como resultado, os valores dada tanto em testes com leveduras risco da infecção, assim como do perfil
de CIM podem ser superiores aos espe- (4,18,44,99,106) como com fungos fila- de sensibilidade das diferentes espécies
rados, sendo importante repetir qual- mentosos (91,106). Os resultados des- e sua incidência.
quer resultado interpretado como “resis- sas provas podem ser obtidos em pou- Esses estudos devem ser realizados
tente”, em paralelo com a cepa-controle cas horas e sua concordância com méto- de modo periódico e os dados relativos à
ou confirmá-lo por outro método (39). Em do de referência foi considerada boa. distribuição de espécies e ao perfil de
testes com azólicos e 5FC, esse fenôme- Entretanto, para aplicação prática da me- sensibilidade devem ser informados às

29
autoridades de saúde pública. Deste mo- ra isolamento, manutenção e identifica- cimes clínicos dessa natureza seja rara-
do, podem ser estabelecidos quais são ção dos agentes, além de tipo de pacien- mente solicitada. Em estudos brasilei-
os tratamentos iniciais mais adequados te e hospital, pode-se traçar um perfil limi- ros, a maioria dos isolados de candidía-
ou se estes devem ser modificados quan- tado da ocorrência de resistência no Bra- se bucal foi obtida de pacientes portado-
do foi identificada uma espécie cuja sen- sil. O gênero Candida constitui o agente res de HIV. Esses estudos referem-se às
sibilidade é previsível. Exemplo desta úl- prevalente dessas infecções, seguindo- regiões sul e sudeste, no período dos últi-
tima situação inclui o isolamento de C. se Trichosporon spp. e Rhodotorula spp. mos dez anos e os testes mais emprega-
krusei de paciente tratado com flucona- O agente de candidemia prevalente é C. dos foram os de difusão em disco (72) e
zol. Embora essa levedura tenha resis- albicans, sendo as outras espécies, em microdiluição (73). Pesquisas publica-
tência inata ao fluconazol, é sensível a freqüência variável: C.parapsilosis, C. das nos anos de 2004 e 2006 (5,68) mos-
anfotericina B e aos novos azólicos, co- guilliermondii, C. tropicalis, C. glabrata, tram um percentual maior de isolados de
mo o voriconazol. Em algumas espécies C. krusei, C. lusitaniae, C. obtusa, C. fa- C. albicans com perfil SDD (sensível de-
de Aspergillus não-fumigatus, sobretu- mata, C. lypolitica e C. rugosa. De modo pendente de dose) e resistentes ao flu-
do, A. terreus e A. flavus, assim como em geral, estudos brasileiros mostram que conazol do que de isolados sensíveis,
Fusarium spp e Scedosporium apiosper- as taxas de resistência desses isolados sendo que alguns apresentaram resis-
mum, é comum a resistência à anfoterici- a antifúngicos azólicos são baixas, al- tência cruzada a outros azólicos. Em es-
na B, mas não aos novos azólicos. Nes- cançando menos de 3%, excetuando-se tudos anteriores (21,101) os resultados
se contexto, a identificação do isolado C.glabrata, que tem habilidade para de- revelaram índices menores de isolados
em espécie minimiza a importância de re- senvolver resistência (8, 23, 52, 69, 90, SDD e resistentes. Esses dados suge-
alização do teste de sensibilidade 92 ,105). rem que o aumento de valores de CIM
(27,31,79,108). Apesar de a maioria dos isolados de ocorreu em função do tempo e, provavel-
No Brasil, existem diversos estudos C. albicans ser sensível ao fluconazol e mente, à maior exposição dos pacientes
epidemiológicos bem fundamentados e ao itraconazol, alguns deles podem apre- a esses azólicos.
conduzidos, relacionados ao perfil de sentar resistência adquirida a esses tria- Em relação, à candidíase bucal pelas
sensibilidade in vitro aos antifúngicos. A zólicos de primeira geração espécies não-albicans, o quadro é seme-
grande maioria foi realizada com cepas (25,36,60,64,81,86,88,89). Portanto, lhante ao descrito em estudos no exteri-
isoladas de pacientes das regiões su- amostras provenientes de pacientes tra- or, em que C. glabrata e C. krusei apre-
deste e centrooeste do país. Alguns des- tados com esses antifúngicos, devem ter sentam os menores índices de sensibili-
ses trabalhos, publicados nos últimos sua sensibilidade avaliada in vitro, no ca- dade (5,21,101). Por outro lado, há tam-
três anos, mostram aumento na resistên- so de falha terapêutica. Além disso, a re- bém interesse em se pesquisar a sensi-
cia ao fluconazol e itraconazol em Candi- sistência não é restrita a esses antifúngi- bilidade de isolados da microbiota da ca-
da não-albicans, e o surgimento de no- cos, havendo também resistência cruza- vidade bucal de indivíduos com fatores
vos agentes causadores de fungemia da com os novos azólicos (25,41,71,79). de imunossupressão. Um estudo (53) re-
(22,23,78,80,81). Entretanto, a freqüên- A resistência em leveduras a anfoteri- alizado por meio do teste de difusão com
cia de resistência em cepas isoladas de cina B é raras vezes encontrada. discos em espécies não-albicans, mos-
infecção de corrente sanguínea no Bra- Entretanto, para algumas como Tri- trou a ocorrência de resistência ao fluco-
nazol (21,9%), principalmente em C. ru-
gosa (100%) e C. glabrata (57%).
"A vigilância epidemiológica das infecções fúngicas Em isolados de fluidos vaginais, foi
hospitalares e ambulatoriais pode auxiliar no também relatada sensibilidade diminuí-
conhecimento de possíveis reservatórios, vias de da aos azólicos, tanto em C. albicans co-
mo não-albicans (96). Pesquisadores
transmissão e fatores de risco da infecção assim como que utilizaram o método EUCAST (29) ve-
do perfil de sensibilidade das diferentes espécies e rificaram que, entre as cepas estudadas,
sua incidência." 9,8% de C. albicans eram resistentes ao
fluconazol, e 11,7% e 23,5% de não-
albicans eram resistentes, respectiva-
sil, ainda é difícil de avaliar, devido a dis- chosporon asahii os valores de CIM des-
mente, ao fluconazol e ao itraconazol
tintos fatores. A infecção não é de notifi- se antifúngico são altos (=4µg/mL), po-
(50).
cação compulsória e, portanto, as taxas dendo ser ainda maiores (20µg/mL) em
No Brasil, muitos estudos apontam
são subestimadas. Alguns trabalhos usa- cepas isoladas de sangue (93). A resis-
que a maioria dos isolados humanos de
ram métodos inadequados para manu- tência secundária a anfotericina B está
C. neoformans é sensível in vitro ao flu-
tenção, purificação e identificação acu- bem comprovada em C. lusitaniae, uma
conazol e ao itraconazol, mas até 50%
rada de espécies, ou parâmetros (meio espécie pouco freqüente, mas descrita
das cepas são resistentes a 5-
de cultura, formulação das drogas, ce- como agente de fungemia em trabalhos
fluorocitosina (45,58,77,95,103). Alguns
pas-padrão, etc) não recomendados pa- brasileiros (8,52).
autores (46) encontraram um intervalo
ra avaliar a sensibilidade aos antifúngi- A resistência a antifúngicos em isola-
de CIM de fluconazol de 0,5 a 16 µg/mL
cos (62). Mesmo com essas restrições e dos bucais e vaginais tem sido também
para isolados clínicos. Assim, as fre-
sem considerar o método laboratorial pa- pesquisada, embora a avaliação de espé-

30
qüentes falhas da terapia com fluconazol padrões de sensibilidade a antifúngicos ficação adequada do perfil de resistên-
nos casos de meningite criptocóccica no país. cia das espécies induz ao estabeleci-
em pacientes portadores de AIDS refor- mento de diretrizes estratégicas de atua-
çam a hipótese que, mesmo no Brasil, ce- Recomendações Técnicas ção dos órgãos oficiais de vigilância epi-
pas de C. neoformans resistentes a esse Como regra geral recomenda-se que demiológica e sanitária para prevenção
azólico podem ser mais freqüentes do os testes de sensibilidade sejam realiza- e controle da disseminação de resistên-
que se acreditava. Valores de CIM relati- dos com um método de referência, uma cia microbiana.
vamente altos foram encontrados em iso- vez que demonstraram elevada reprodu- Apesar de ser prioritária a notificação
lados clínicos provenientes da região su- tibilidade entre laboratórios e foram ava- da resistência em amostras de fungos,
deste (São Paulo e Rio de Janeiro), mos- liados em estudos de correlação. Estes não deve se restringir às cepas hos-
trando que apesar de a maioria dos isola- testes devem ser realizados em institui- pitalares. As ações de todos os progra-
dos ser sensível, há uma tendência de au- ções sanitárias que as executam de mo- mas: municipal, estadual e/ou nacional
mento de CIM, podendo ser verificada a do rotineiro, seguindo um sistema estrito que contemplam diagnóstico de doen-
presença de percentuais de isolados de controle de qualidade dos resultados. ças causadas por fungos, como: Doen-
com perfil de SDD (47). Por outro lado, os métodos comerciais ças Sexualmente Transmissíveis e
Um estudo realizado com método que demonstraram boa concordância AIDS, Micoses Sistêmicas e Doenças
EUCAST em amostras clínicas de C. neo- com os métodos de referência e reprodu- Respiratórias devem ser ampliadas,
formans, provenientes de diferentes re- tibilidade inter-laboratorial, podem ser com vistas à capacitação de laboratoris-
giões do Estado de São Paulo, mostrou uma alternativa para alguns laboratórios tas dos serviços de saúde em testes de
diminuição da sensibilidade em isola- assistenciais, uma vez que detectam a re- resistência a antifúngicos, além da iden-
dos seqüenciais para fluconazol, 5- sistência aos azólicos com bastante con- tificação acurada do agente etiológico
fluorocitosina e anfotericina B (48). Em fiabilidade (28,35,61,70,87). Nestes ca- dessas infecções.
contraste, outro trabalho, empregando a sos, assim como em qualquer procedi- Por outro lado, a Micologia Médica en-
metodologia M27-A2, mostrou taxas al- mento laboratorial, é de suma importân- contra-se em uma fase de grande estí-
tas de sensibilidade para azólicos, inclu- cia a garantia de qualidade dos exames mulo à pesquisa de novos procedimen-
indo voriconazol, em isolados clínicos e por programas de controle de qualidade tos laboratoriais. Métodos que permitam
ambientais de C. neoformans (103). interno e externo. São aconselháveis es- caracterizar, em espécie, isolados de ca-
Os estudos com fungos filamento- tudos de comparação dos testes comer- sos graves ou determinar a sensibilidade
sos, em particular dermatófitos, têm mos- ciais com os padrões, o que permite co- aos antifúngicos nesses isolados, mas
trado que a maioria dos isolados é sensí- nhecer a confiabilidade dos resultados de modo rápido e confiável, são extre-
vel aos antifúngicos azólicos. Em uma dos estudos de sensibilidade para cada mamente necessários nos dias atuais. A
avaliação do perfil de sensibilidade de 53 instituição de saúde. execução dessas pesquisas deve ser
isolados clínicos de Trichophyton ru- A determinação do perfil de sensibili- considerada como prioritária, principal-
brum verificou-se, por meio do Etest, que dade de um isolado clínico pode servir à mente por órgãos governamentais.
para apenas quatro deles o fluconazol orientação terapêutica do caso em ques-
apresentou valores de CIM iguais ou su- tão e também pode servir como um dado Referências
periores a 256 µg/mL. (37). Em outra pes- importante para vigilância da resistência 1. AB Biodisk. Etest Technical Guide,
quisa com 68 isolados clínicos de T. ru- dos agentes etiológicos. Dada à gravida- http://www.abbdiodisk.com.
brum, utilizando metodologia EUCAST, de das infecções hospitalares por fun- 2. Abi-Said, D.; Anaissie, E.; Uzon, O.; Pinzcowski,
somente uma amostra oriunda de uma gos, em particular as de corrente sanguí- H.; Vartivarian S. The epidemiology of hematoge-
paciente com tinha da face mostrou re- nea por leveduras, o monitoramento da nous candidiasis caused by different Candida spe-
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sistência clínica e in vitro ao fluconazol e resistência em unidades assistenciais
ao itraconazol (12). que permita um delineamento regional e 3. Aller, A. I.; Martin-Mazuelos, E.; Lozano, F.; Go-
mez-Mateos, J.; Steele-Moore, L.; Holloway, W. J.;
Dados do perfil de sensibilidade das temporal, estratificado segundo tipo de Gutiérrez, M. J.; Recio, F. J.; Espinel-Ingroff, A. Cor-
espécies podem servir como orientação hospital, grupo de paciente e localização relation of fluconazole MICs with clinical outcome in
terapêutica e são essenciais para vigi- anatômica, serve de base para um pro- criptococcal infection. Antimicrob. Agents Chemot-
lância da resistência aos agentes anti- grama nacional de controle de infecção her., 44: 1544-8, 2000.
fúngicos. no ambiente hospitalar. Os laboratórios 4. Alvarez-Barrientos, A.; Arroyo, J.; Canton, R.;
Esses dados sugerem que, ao con- de hospitais devem ser capacitados e su- Nombela C.; Sanchez-Perez, M. Applications of
trário do que ocorre em outros países pervisionados, de modo uniforme, em flow citometry to clinical microbiology. Clin. Microbi-
ol. Rev. 13:167-195, 2000.
(36, 64, 82, 86, 109), em algumas re- métodos de identificação e testes de sen-
5. Alves, S. H.; Da Matta, D. A.; Azevedo, A. C.; Lore-
giões do Brasil o fluconazol e o itracona- sibilidade a antifúngicos para proverem
to, E. S.; Boff, E.; Santurio, J. M.; Guarro, J. In vitro
zol ainda podem ser boas opções para o resultados acurados e comparáveis. activities of new and conventional antimycotics aga-
tratamento inicial de determinadas infec- Centros de referência devem prover en- inst fluconazole-susceptible and non-susceptible
ções fúngicas e que é necessário o esta- saios padrões e educação continuada Brazilian Candida spp. isolates. Mycoses, 49: 220-
belecimento de um contínuo programa aos laboratoristas que alimentam um sis- 225, 2006.
de vigilância para identificar possíveis tema regional ou nacional sobre informa- 6. Anaissie, E.; Body, G. P.; Kantarjian, H. New spec-
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der, H. S.; Fluit, A. C.; Hollis, R. J.; Messer, A. S. 97. Rodero, L.; Dalel, G.; Cordoba, S.; Soria M.; litybased 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-
International surveillance of bloodstream infecti- Canteros, C.; Hochenfellner, F. Estúdio multicen- sulfophenyl)-5-(phenylamino) carbonyl]-
ons due to Candida species: frequency of occur- trico sobre candidiases nosocomial em la Repu- 2Htetrazolium hydroxide (XTT) assay and a modi-
rence and in vitro susceptibilities to fluconazole, blica Argentina. Rev. Arg. Microbiol., 31: 114-119, fied NCCLS method. Antimicrob. Agents and Che-
ravuconazole, and vancomicine of isolates col- 1999. mother., 49: 1364-1368, 2005.
lected from 1997 through 1999 in the SENTRY 98. Rodriguez-Tudela JL, Chryssanthou E, Petrik- 108. Viudes, A.; Cantón, E.; Pemán, J.; López-
Antimicrobial Surveillance Program. J. Clin. Mi- kou E, Mosquera J, Denning DW, Cuenca-Estrella Ribot, J. L.; Gobernado, M. Correlación entre las
crobiol. 39: 3254-3259, 2001. M. Interlaboratory evaluation of hematocytometer pruebas de sensibilidad in vitro a los antifúngicos
87. Pfaller, M.A.; Espinel-Ingroff, A.; Jones, R.N. method of inoculum preparation for testing anti- y la evolución clínica de los pacientes con candidi-
Clinical evaluation of the Sensititre YeastOne co- fungal susceptibilities of filamentous fungi. J Clin asis y criptococosis. Rev. Esp. Quimioter., 15: 32-
lorimetric antifungal plate for antifungal suscepti- Microbiol., 41: 5236-5237, 2003. 42, 2002.
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saconazole and ravuconazole. J. Clin. Microbiol., itzman, T.; Paz, E.; Keller, N.; Raveh, D. Rapid denbroucke-Grauls, C. M. J. E.; Verbrughb, H.
42: 4577-4580, 2004. flow-cytometric susceptibility testing of Candida A.;Voss, M. C.; Weersink, A. Y. L.; Hoogkamp-
88. Pfaller, M. A.; Lockhart, S. R.; Pujol, C. ; Swa- species. J. Antimicrob. Chemother., 55:106-109, Korstanje, J. A. A.; Meis, J. F. G. M. Occurrence of
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tes. J. Clin. Microbiol., 36: 1518 1529, 1998. das Clinicas da Faculdade de Medicina de Botu- Comparison of Etest and national committee for
89. Pfaller, M. A., Messer, S. A.; Hollis, R. J.; Jo- catu - São Paulo, Brasil. J. Mycol. Med., 15:13-21, clinical laboratory standars broth macrodilution
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crobiol. Infect. Dis., 33: 217-222, 1999. study of oral Candida species isolated from Aids 111. Witt, M. D., Lewis, R. J., Larsen R. A.; Milef-
90. Pukinskas, S. R. B. S. Infecção hospitalar por patients. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Brasil, 97: chik, E. N.; Leal, M. A. E.; Haubrich, R. H.; Richie,
leveduras em unidade de terapia intensiva infan- 253-257, 2002. J. A.; Edwards, J. E. Jr.; Ghannoum, M. A. Identifi-
til: abordagem epidemiológica. São Paulo, 2002 cation of patients with acute AIDS-associated
102. Silva, M. R. R.; Costa, M. R.; Miranda, A. T. cryptococcal meningitis who can be effectively tre-
(Dissertação. Mestrado. Faculdade de Saúde Pú- B.; Fernandes, O. F. L.; Costa,C. R.; Paula, C. R.
blica. USP). ated with fluconazole: the role of antifungal sus-
Evaluation of Etest and macrodilution broth met- ceptibility testing. Clin. Infect. Dis., 22: 322-328,
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34
SBM 50 anos

PROF. DR. LUIZ


RACHID TRABULSI

Marina Baquerizo Martinez


Sociedade Brasileira de Microbiologia- Presidente

Tânia T. Gomes do Amaral


UNIFESP-SP

Bernadette G. Franco
FCF-USP

Luiz Rachid Trabulsi, maranhanse, mé- nagem: Koserella trabulsii (J. Clin. Microbi- mes TAT et al. J Infect Dis, 1991. e Blake
dico formado pela Universidade Federal da ol., 21: 31-42, 1985) e Trabulsiella guamen- PA et al. J Infect Dis 1993).
Bahia em 1953, Doutor em Medicina, pela sis (J. Clin. Microbiol., 29: 1480-1481, Ainda na FM-USP, publicou trabalhos
Universitäts Klinic, Alemanha em 1957 e 1991). importantes onde relatou o encontro de
Doutor em Medicina pela Faculdade de Me- Foi um dos pesquisadores mais produti- amostras de E. coli isoladas de casos de
dicina da Universidade de São Paulo (FM- vos do Brasil, tendo publicado quase duas gastrenterites, que provocavam quadros de
USP) em 1959. Realizou seu Pós- centenas de trabalhos científicos nos perió- disenteria muito semelhantes aos provoca-
Doutorado no Centers for Disease Control dicos mais importantes de sua área de atua- dos por Shigella. Mostrou que essas amos-
and Prevention nos Estados Unidos. ção. Merece destaque ainda seu famoso li- tras causavam ceratoconjuntivite em olho
Em 1962, iniciou sua carreira docente vro “Microbiologia”, que se encontra na de cobaia e foram denominadas de E. coli
no Departamento de Microbiologia e Imu- quarta edição. Este livro é fundamental pa- enteroinvasora. O grupo do professor Tra-
nologia, da FM-USP como Professor Assis- ra a formação de milhares de alunos de cur- bulsi foi responsável pela descrição de cin-
tente Doutor e em 1964 obteve o título de Li- sos da área da saúde em todo o país. co novos sorotipos pertencentes a esse gru-
vre-docente. Em 1970 transferiu-se para a As suas maiores contribuições foram na po de E. coli diarreiogênica (O167:NM;
então Escola Paulista de Medicina, hoje epidemiologia e no diagnóstico da diarréia O152:NM; O144:NM; O136:NM; O29:NM).
UNIFESP. Junto com Prof. Dr. Erney P. Ca- infantil e adulta e no estudo da E. coli diarre- Mostrou, ainda, que todas as amostras de
margo e Prof. Dr. Nelson F. Mendes criou o iogênica. Suas principais contribuições fo- EIEC são incapazes de descarboxilar lisina
Programa de Pós-Graduação em Microbio- ram no estudo de diferentes aspectos da fa- e que a grande maioria, com exceção do so-
logia e Imunologia da UNIFESP, até hoje mília Enterobacteriaceae, na epidemiologia rotipo O124:H30, são imóveis (Silva RM; To-
uma referência para programas de Pós- da diarréia infantil e na epidemiologia, diag- ledo MR; Trabulsi LR. J Clin Microbiol, 1980
graduação em Microbiologia. Permaneceu nóstico, virulência, determinantes genéti- e Toledo MR; Trabulsi LR. J Clin Microbiol,
na UNIFESP até 1992, quando se aposen- cos e estrutura clonal de E. coli diarreiogê- 1983). Descreveu um novo sorotipo móvel,
tou e reiniciou nova atividade docente no nica. O145:H45 (Gomes et al., J Clin Microbiol,
Instituto de Ciências Biomédicas da USP, Em 1961, publicou o primeiro estudo so- 1987). Em 1982, mostrou que um plasmí-
onde permaneceu até 1997. Em seguida, bre o papel de E. coli enteropatogênica em deo de alta massa molecular determina a
transferiu-se para o Instituto Butantã, onde diarréia infantil no Brasil (Trabulsi, et al, Diar- capacidade de evocar cerato-conjuntivite
fundou e foi Diretor do Laboratório Especial réias infantis por colibacilos enteropatogê- (Silva et al, J Infect Dis, 1982) e em 1988,
de Microbiologia. Na USP, foi homenagea- nicos: estudos preliminares sobre a ocor- que os plasmídeos de invasão de Shigella e
do com o título de Professor Emérito do rência de certos grupos e tipos sorológicos EIEC apresentam um replicon comum (Sil-
Instituto de Ciências Biomédicas. em São Paulo”. Rev Inst Med Trop São Pau- va et al., Infect Immun., 1988).
Sua carreira foi marcada por vários e lo, 1961). Mais dois importantes estudos Várias foram as contribuições do grupo
merecidos prêmios, mas dos que ele mais epidemiológicos foram publicados, onde fo- do Prof. Trabulsi em E. coli enterotoxigêni-
se orgulhava eram as duas espécies bacte- ram mostrados os fatores de risco e prote- ca. Em 1979, descreveu-se pela primeira
rianas que receberam nomes em sua home- ção para diarréia provocada por EPEC (Go- vez que o sorogrupo 128ac continha amos-

35
tras enterotoxigênicas (Reis et al, Infect
Immun, 1979). O grupo foi responsável tam-
bém pela descrição e caracterização de um
subtipo de toxina LT (LT-II) em amostras hu-
manas e de alimentos (Guth et al, Infect
Immun, 1986).
Seus trabalhos mais conhecidos estão
relacionados à EPEC. Ele mostrou que
EPEC era responsável por aproximada-
mente 30% de todos os casos de diarréia
no primeiro ano de vida em São Paulo, que
a freqüência diminuía com o aumento da
idade dos pacientes e que os sorotipos pre-
d o m i n a n t e s e r a m O 111 a b : H N M ,
O111ab:H2 e O119:H6 (Zuliani et al, 1969;
Toledo et al, 1983; Gomes et al, 1989).
Sem dúvida, o trabalho de sua autoria mais
citado na literatura é o que mostrou a alta
correlação entre a expressão de adesão lo-
calizada em células HeLa e certos soroti-
pos de EPEC (Scaletsky et al, 1985).
Em agosto de 1995, em São Paulo-SP,
organizou em conjunto com o Dr. James B.
Kaper (CVD, Baltimore-USA) o 2 nd
INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON
ENTEROPATHOGENIC Escherichia coli.
Quatorze convidados internacionais e oito
Prof. Dr. Luiz Rachid Trabulsi
nacionais revisaram diferentes aspectos
das infecções por EPEC: epidemiologia, fa-
tores de virulência, diagnóstico e resposta
celular. Pela primeira vez, foi discutida a
ocorrência de amostras de EPEC atípicas, atípicas são mais relacionadas com as currículo, número que se multiplica enor-
onde se detectava o gene eae, porém o STEC (EHEC, produtoras de toxina Shiga) memente se for computados os pós-
plasmídio EAF não estava presente e as e, como as STEC, parecem constituir pató- graduados formados indiretamente, ou se-
amostras não eram produtoras de toxina genos emergentes. Como marcadores, ja, por seus ex-orientados, até a quarta ou
Shiga (Stx). A definição de EPEC típicas e mostrou que há sorogrupos comuns, mas quinta geração.
de EPEC atípicas foi resultado de discus- os sorotipos são diferentes e que o padrão Além de sua intensa dedicação ao ensi-
sões pelo grupo, habilmente conduzidas pe- de adesão em células epiteliais é diferente no e pesquisa, o Dr. Trabulsi doou muito do
lo Prof. Trabulsi, durante o simpósio (Proce- (Trabulsi et al., EID, 2002). seu tempo e de seu coração para ativida-
edings of the International Symposium on Ele foi responsável por outros inúmeros des que considerava muito especial: foi um
Enteropathogenic E. coli -EPEC, Rev. Mi- trabalhos que contribuíram para um melhor dos fundadores da Sociedade Brasileira de
crobiol, S. Paulo, 27, suppl. 1996). conhecimento sobre E. coli diarreiogênica. Microbiologia, da qual foi presidente em di-
Com a colaboração do Dr. Tom Whit- Contudo, o maior legado deste microbiolo- versas oportunidades. Presidiu também vá-
ham (The Pennsylvania State University, gista notável foi a sua capacidade de for- rios congressos de microbiologia, nacionais
USA), Dra. Kinue Irino (IAL-SP) pesquisa- mar e aglutinar pesquisadores. Um pouco e internacionais. Foi o editor da Revista de
dores da UNIFESP e alunos de Pós- antes de ir embora, deixou um presente pa- Microbiologia durante muitos anos.
Graduação, foram identificados os principa- ra seu grupo, um projeto sobre EPEC atípi- Tinha um carinho especial com a SBM e
is tipos clonais associados com diarréia e ca, mesmo longe continua formando pes- um desejo de ter uma revista de divulgação
foi avaliada a variação entre clones com re- quisadores de altíssimo nível, pois deixou científica publicada pela sociedade. Este
lação a fatores de virulência específicos uma escola. texto em memória ao Prof. Trabulsi abre a
(Campos et al., Infect. Immun. 1994, Rodri- A trajetória profissional do Dr. Trabulsi seção “Homenagens” da Microbiologia in
gues et al, Infect Immun, 1996; Gonçalves foi brilhante: era, e continuará sendo por mu- foco. Esperamos desta forma, fazer jus à
et al, Infect Immun, 1997, Dalla-Costa, et al, ito tempo, o primeiro nome a ser lembrado dedicação dele à SBM.
J Med Microbiol, 1998; Pelayo et al, J Med quando o assunto é Escherichia coli diarrei- A comunidade de microbiologistas do
Microbiol, 1999). Em 2002, publicou uma re- ogênica. Formou um enorme contingente Brasil, representada pela Sociedade Brasi-
visão sobre EPEC, onde ficou caracteriza- de alunos, entre mestres, doutores e pós- leira de Microbiologia, agradece esse gran-
do que EPEC típicas e atípicas diferem em doutores, deixando sementes em todos os de líder. Que seus ensinamentos e exem-
reservatórios, características genéticas, so- cantos desse país. Tem 80 orientações de plo de vida permaneçam entre nós para to-
rotipos e propriedades de virulência. EPEC mestrado e doutorado concluídas em seu do o sempre.

36
Emprego in Foco Agenda in Foco
Over the last 10 years a variety of tumor anti-
gens that are recognized by both humoral and cellu-
lar immune responses have been identified in
human tumors. Some of these antigens are cur-
rently being used for the development of immunot-
herapeutic approaches for cancer treatment. Howe-
BRASÍLIA É SEDE
ver, the amount of available information about tumor
antigens is increasing at an astonishing rate, and the
availability of a well-organized and professionally
DO 24º CONGRESSO
curated database for tumor antigens has become
indispensable for scientists in the field.
BRASILEIRO DE
The Academy of Cancer Immunology, with sup-
port from the Ludwig Institute for Cancer Research
(LICR), have setup a Cancer Immunome Database
MICROBIOLOGIA
that present through a single point of access infor-
mation about all of the gene products against which Acontece de 2 a 6 de outubro, no Centro de Convenções Ulysses Guimarães, em Bra-
an immune response has been documented in can- sília, o 24º Congresso Brasileiro de Microbiologia, que reunirá 3000 profissionais e acadê-
cer patients.
The National Laboratory for Scientific Computa- micos para o debate da Microbiologia no Brasil e América Latina.
tion LNCC/MCT and the James Kerr Programm of
the Ludwig Institute are now hiring one annotator to A Comissão organizadora do evento, coordenada pela Profa. Dra.Marina Martinez, Pre-
update and enlarge the Cancer Immunome databa- sidente da SBM, informa que as inscrições já estão abertas. Consulte o site - www.sbmicro-
se. The job will require scanning of the literature,
interpretation of the results, integration of meaning- biologia.org.br e veja a programação preliminar e as formas de participação.
ful information, and ability with bioinformatics tools
for a better annotation of the tumor antigens.
Venha a Brasília consolidar o 24º CBM como o maior Congresso da América Latina!!!
The annotator(s) will work in Petrópolis but will
have to take frequent trips to the Ludwig Institute in
São Paulo - Brazil to discuss progress and future
improvements.
The contract will be valid for 1 1/2 (one and a 13th INTERNATIONAL CONGRESS OF
half) year, with possibility of renewal according to the
availability of future fundings. IMMUNOLOGY INFECCIOSAS/AIDS
We are looking for a well motivated annotator Rio de Janeiro, Brasil 12/08/2007- 17/08/2007 Consulte o site:
with the following pre-requisites:
PhD degree
http://www.immunorio2007.org.br
Fluent English
Knowledge in genomics
Notions of tumor biology and immunology 47th ICAAC MEETING
Motivation for teamwork and to work continu- Chicago, IL, September 17 - 20, 2007 Consulte o site: www.asm.org
ously with a computer
Synthesis ability
Flexibility (trips to São Paulo and occasionally
New York)
14th INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON
Starting date: immediately HEALTH-RELATED WATER
Please send your CV by email together with a
motivation letter in English until 01th June to: MICROBIOLOGY
Date: 9 - 15 September 2007 Venue: Yayoi-Kodo, The University of Tokyo, JAPAN
Ana Tereza Ribeiro de Vasconcelos
(a/c Marcia Guglielmi)
Email: marciag@lncc.br
5º CONGRESSO BRASILEIRO DE
MICOLOGIA
Entre os dias 12 e 16 de novembro, a Sociedade Brasileira de Micologia (SBMy)
realiza o 5º Congresso Brasileiro de Micologia, com o tema central A Micologia
no Brasil:o começo,onde estamos e o que almejamos. O evento acontecerá em
Recife. Informações no site www.5micol.com
Notícias in Foco
A SBM tem a satisfação de comunicar à comu-
nidade científica que o Zoilo Pires de Camargo
(UNIFESP-SP) foi homenageado pela Medical
CURSOS DE ESPECIALIZAÇÃO
Mycology Society for the Americas, Divisão da Ame-
rican Society for Microbiology (ASM), pela sua obra
EM ANÁLISES CLÍNICAS E
acadêmica. A homenagem foi recebida durante o
107º General Meeting ASM, ocorrido em Toronto,- MICROBIOLOGIA
Canada, de 21 a 25 de maio 2007.(Isso seria uma Inscrições abertas no site www.sbmicrobiologia.org.br
notícia??)

37
COMO ASSOCIAR-SE
Procedimento:
O interessado deverá preencher a ficha de adesão, especificando a categoria (Estudante de graduação, Estudande de Pós-
Graduação ou Profissional).

Valores:
Estudantes: R$ 90,00 (Anual)
Profissionais: R$ 175,00 (Anual)

Formas de pagamento:
1. Depósito bancário identificado em nome da SOCIEDADE BRASILEIRA DE MICROBIOLOGIA (CNPJ 43.323.484/0001-
12) e envio de uma cópia do comprovante via FAX (11) 3813-9647:
Banco do Brasil: 001 - Agência: 3559-9 - c/c: 16509-3

2. Enviar a ficha de adesão por E-mail (cadastro@sbmicrobiologia.org.br), solicitando o boleto bancário.

FICHA DE ADESÃO
DATA:___________________________________________________________ ANO DE REFERÊNCIA:___________________________
Categoria: ( ) Estudante de Graduação ( ) Estudante de Pós-Graduação ( ) Profissional
Nome completo:__________________________________________________________________________________________________
RG:______________________________________________________ CPF:________________________________________________
Endereço Res:____________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________ Bairro:___________________________________
Cidade:__________________________________________________________ UF:___________ CEP:__________________________
TEL.:____________________________________________________ FAX:________________________________________________
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