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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

(CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO)

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Características dos analitos X Análise
cromatográfica

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Cromatógrafos Comerciais

Fabricante: Agilent 3
Cromatógrafos Comerciais

Fabricante: Varian Fabricante: Shimadzu

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Componentes de um cromatógrafo líquido

5
Componentes de um cromatógrafo líquido

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FASE MÓVEL
• A fase móvel passa pela fase estacionária, que está
dentro de uma coluna (cromatografia em coluna), e os
componentes da amostra são separados pela
diferença de afinidade entre as duas fases.

FASE MÓVEL: SOLVENTES LÍQUIDOS

• Solventes orgânicos
• Solvente aquoso: água e soluções tampão.
• Misturas de solventes: é necessário verificar a
compatibilidade entre os solventes.

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ESCOLHA DO SOLVENTE
Parâmetros devem ser considerados para a escolha do solvente:

• Viscosidade: Viscosidade elevada acarreta em dificuldades no


bombeamento e elevam a variação da pressão
• Compressibilidade
• Pressão de vapor
• Toxicidade
• Índice de Refração
• Corte de UV (cut off): espectro de absorção UV-VIS; comprimento
de onda abaixo do qual o solvente absorve mais que uma unidade
de absorbância em uma cela de 1 cm de caminho óptico; impurezas
podem alterar muito o valor do cut off

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PROPRIEDADES DOS SOLVENTES

IR: índice de refração (muito importante quando utilizado o detector


de índice de refração) 9
ESCOLHA DO SOLVENTE

• Os analitos devem se dissolver na FM para que sejam


transportados através da coluna

• Imiscibilidade com a FE

• Inércia química com a FE e os componentes da amostra

• Pureza condizente com o detector utilizado.

• Mistura de solventes devem produzir soluções homogêneas :


fator importante nas análises por gradiente

• Sistemas não miscíveis prejudicam o desempenho da bomba,


da coluna e induzem ruídos no detector além de alterar os
tempos de retenção e prejudicar as análises quantitativas.
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ESCOLHA DO SOLVENTE
FORÇA DOS SOLVENTES

A interação das moléculas analisadas (analitos) com o


solvente (FM) e consequentemente suas solubilidades
depende basicamente das forças intermoleculares:
• Dispersão (van der Waals)
• Interação dielétrica (interação íon-dipolo)
• Dipolo – dipolo
• Ligação de hidrogênio

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FASE MÓVEL - FILTRAÇÃO
• A fase móvel não pode conter partículas para evitar
danos à bomba, injetor e coluna: necessário a filtração
antes de armazenar a fase móvel no reservatório.

• A escolha do filtro é função da natureza da fase móvel.


Usualmente utiliza-se membranas de nylon (0,20 e
0,45 µm), celulose (0,22 µm) ou Teflon (1 e 1 ,5 µm).

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FASE MÓVEL:
REMOÇÃO DE GASES DISSOLVIDOS
• A fase móvel deve ser degaseificada para evitar a formação de
bolhas no processo de separação, o que pode interferir no
desempenho da análise.

As técnicas de degaseificação são:


i. Irradiação de ultrassom
ii. Refluxo com resistência de aquecimento
iii. Aplicação de vácuo (pressão negativa)
iv. Purga com gás hélio ou gás nitrogênio
v. Uso de membrana semipermeável e vácuo in line.

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BOMBA CROMATOGRÁFICA
• Transporta a fase móvel desde o reservatório, coluna e até aos
detectores

Características:

• Alta reprodutibilidade e exatidão de pressão, bombeamento e


mistura de solventes

• Vazão contínua de 0,01 a 10 mL min-1

• Vazão constante e independente da pressão na coluna


cromatográfica

• Alta resistência à corrosão: inércia química a solventes

• Opera em altas pressões (até 12000 psi, dependendo do fabricante)


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BOMBA CROMATOGRÁFICA
• A vazão constante é essencial para a separação de analitos

• Alta pressão é necessária para impulsionar o solvente através da


coluna cromatográfica, vencendo a enorme resistência imposta pela
fase estacionária.

• Normalmente, se utilizam bombas recíprocas com um ou dois


pistões para minimizar a pulsação

• Preferencialmente, devem operar com programação de vazão e


deve ser possível a interrupção do processo em pressões fora dos
limites máximos e mínimos pré-estabelecidos.

• É importante introduzir fatores de correção de compressibilidade


para a fase móvel utilizada, ainda que os líquidos tenham baixa
compressibilidade.

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BOMBA CROMATOGRÁFICA

Pistão de Safira para


bomba de HPLC

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BOMBA CROMATOGRÁFICA
Princípio de funcionamento

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BOMBA CROMATOGRÁFICA
• BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO

• A composição da fase móvel é mantida


constante durante toda análise cromatográfica.

• Pode ser só um solvente ou uma mistura de


solventes.

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BOMBA CROMATOGRÁFICA
• BOMBEAMENTO POR GRADIENTE
• Alteração da composição da fase móvel, sem alteração da
vazão total, com a finalidade de diminuir tempo de análise
e/ou melhorar a separação dos analitos da amostra.

• O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão


ou a alta pressão.

• No caso de baixa pressão, utiliza-se uma única bomba e a


seleção do solvente ocorre através de válvula de múltiplas
vias.

• No caso do bombeamento de alta pressão, cada solvente tem


uma bomba específica.
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INJETOR

• A injeção de amostra é realizada com auxílio de válvulas


especiais que permitem introdução com grande precisão
e exatidão de volumes que variam, em geral, de 5 a 20
µL.

Composição do injetor pode ser de:

i. Aço inoxidável
ii. PEEK (Poliéter-Éter-Cetona)
iii. Resina perfluorada

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LOOP PARA INJEÇÃO DA AMOSTRA

Da bomba Para coluna Da bomba Para a coluna

Loop da amostra

Carregar a amostra Injetar a amostra 21


Seleção do tipo de modalidade cromatográfica em
função da polaridade dos analitos medida pelo log P

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FASE ESTACIONÁRIA
• As FE são constituídas de material sólido, granulado,
finamente dividido e densamente empacotado dentro de um
tubo feito de material inerte, normalmente aço.
• O material sólido pode estar revestido ou ligado
quimicamente a um líquido.

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FASE ESTACIONÁRIA

FASE NORMAL = Fase Polar


• Composição: sílica, alumina

FASE REVERSA = Fase Não Polar


• Composição: sílica gel, C18, C8…

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FASE ESTACIONÁRIA

Fase/Modo Uso (%)

Fase reversa 50,6


Fase normal 24,1
Troca Iônica 14,1
Exclusão por tamanho 6,6
Quiral 3,5
Hidrofóbica 1,1

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FASE ESTACIONÁRIA

CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL

Hexano, diclorometano, isopropanol, metanol

Aumento da força do solvente

CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA

Água, metanol, acetonitrila, tetrahidrofurano (THF)


Aumento da força do solvente
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FASE ESTACIONÁRIA NORMAL
• Grupos Funcionais Polares são ligados à matriz de
sílica. A técnica, em geral, substitui com
vantagens a Cromatografia por Adsorção.

Grupos funcionais mais comuns:


✓ DIOL
✓ CIANO
✓ AMINO

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Interações dos analitos com fase
estacionária polar

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Características da Fase Normal

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Micrografia de 5 µm de sílica

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Corte transversal do bastão cilíndrico
de sílica monolítica e sua ampliação

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Características da Fase Normal

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Força de eluição em Fase Normal

• Retenção aumenta com aumento da polaridade dos solutos


• Agentes de supressão iônica melhoram a resolução
cromatográfica
# Ácido acético ou fórmico para analitos ácidos.
# Amônia ou trietilamina para analitos básicos

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FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Fase estacionária menos polar que a fase móvel

Solventes mais comuns utilizados


• Água (solvente mais fraco)
• Acetonitrila (ACN)
• Metanol (MeOH)
• Tetrahidrofurano (THF)

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Relação entre polaridade do solvente e tempo
de retenção em modo de fase reversa

Eluente: Metanol / Água

60/40

70/30

80/20
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Fase estacionária reversa: orientações para a
otimização da separação dos picos cromatográficos

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FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Adequada para compostos não iônicos, compostos
polares a mediamente apolares.
• Ordem de eluição (ordem crescente): Analitos mais
polares → Analitos mais apolares

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FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Os grupos funcionais ligados à base de sílica são
apolares. Os analitos são atraídos para a superfície
pelos seus grupos funcionais não polares. O analito
mais polar elui primeiro, seguidos pelos outros em
ordem decrescente de polaridade.

Grupos funcionais mais comuns:


• Butil
• Octil
• Fenila
• Octadecil: responsável pela maioria das separações
em fase reversa.

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FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Composição da Fase Estacionária

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Distribuição espacial dos componentes
da fase estacionária (C18)

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Efeito da temperatura na fase estacionária

41
NOVAS FASES ESTACIONÁRIAS (POLAR, APOLAR ??)

42
NOVAS FASES ESTACIONÁRIAS (POLAR, APOLAR ??)

43
NOVAS FASES ESTACIONÁRIAS (POLAR, APOLAR ??)

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Interações entre analitos quirais
(enantiômeros) e a fase estacionária

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Mecanismos de Separação
Em função da fase estacionária utilizada tem-se os
seguintes mecanismos de separação:

• Adsorção
• Partição
• Troca iônica
• Exclusão
• Bioafinidade
• Mistura de mecanismos
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Mecanismos de Separação

47
Mecanismos de Separação

48
Fases Quimicamente Ligadas

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Relação entre tempo de retenção e
polaridade da fase estacionária e analitos

C18 (ODS) OH

Weak
Strong
CH3

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MECANISMO DE EXCLUSÃO POR TAMANHO

O tamanho das moléculas do


soluto determinam a entrada ou
não nos poros da fase estacionária.

Fase
Estacionária

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MECANISMO POR EXCLUSÃO
• Principais
analitos:

✓ Polímeros
✓ Proteínas
✓ Peptídeos
✓ Carboidratos
✓ Ácidos
Nucleicos

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MECANISMO POR TROCA IÔNICA
• A separação baseia-se na interação eletrostática dos componentes da
amostras com grupos iônicos da FE.
• A FE é normalmente uma resina de poliestireno-divinilbenzeno a qual estão
ligados grupos iônicos, ou a FE é sílica recoberta com uma fina camada de
poliestirenodivinilbenzeno onde grupos iônicos estão ligados.

• Os grupos quimicamente ligados presentes em todo tipo de material de


troca iônica são:
• SO32- : trocadores fortes de cátions
• CO2- : trocadores fracos de cátions
• NR3+: trocadores fortes de ânions
• NH2R+: trocadores fracos de ânions

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MECANISMO DE ADSORÇÃO
• Utiliza partículas porosas em geral de 5 micra ou 10
micra

• Indicada para substâncias com massa molecular menor


que 2000 Daltons

• Solventes mais utilizados são de média e baixa


polaridade

• Adsorventes mais utilizados: alumina e principalmente


sílica.
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CROMATOGRAFIA POR INTERAÇÕES
HIDROFÍLICAS (HILIC)
• HILIC é considerada uma cromatografia de partição, mas não
de adsorção ou dessorção: utiliza elevados níveis de solventes
orgânicos e colunas especiais
• Usa a fase estacionária hidrofílica e fase móvel com mistura
de solvente orgânico e água
• HILIC permite reter compostos que são fracamente retidos
por cromatografia de fase reversa.

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Fases estacionárias para HILIC

56
Relação entre HILIC e demais
modalidades de cromatografia

57
Tipos de interações presentes na cromatografia
por interações hidrofílicas (HILIC)

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Pré-Coluna / Coluna de Guarda
É uma pequena coluna instalada antes da coluna analítica.

IMPORTANTE: Sempre usar pré-colunas para proteger e


aumentar a vida da coluna analítica

CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS:
• Protege a coluna analítica contra contaminações
químicas e reter materiais que por reações químicas
podem precipitar sobre a fase estacionária.
• Mesmo material de empacotamento da coluna
• Comprimento Típico: 25 mm

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Pré-coluna e Coluna de Guarda

Coluna de Guarda

Pré-coluna

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COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
• A separação é efetuada nas colunas cromatográficas, feitas em aço
e resistentes a altas pressões (até 500 atm)

• Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária


conveniente, geralmente sílica ou seus derivados, com
granulometria de 3, 5, 7 ou 10 µm de diâmetro médio.

• Devido a queda de pressão elevada nos tubos, as colunas são


relativamente curtas e de paredes espessas.
COMPRIMENTO: 3 – 60 cm
DIÂMETRO INTERNO: 0,2 – 8 mm

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COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
• Como o tempo de retenção depende da temperatura, as
colunas devem ser mantidas termostatizadas em um
forno onde pode-se selecionar a temperatura apropriada
para a separação

• Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua


eficiência, estão sendo introduzidas colunas de diâmetro
interno de 1 – 3 mm, de forma que possa operar-se com
fluxos menores, resultando em diminuição substancial
do custo de operação e aumento de sensibilidade.

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Influência do diâmetro interno da
coluna na quantificação dos analitos

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DERIVATIZAÇÕES: REAÇÕES PÓS-COLUNA

• Para a detecção de alguns componentes, principalmente a baixas


concentrações, é preciso transformá-los em derivados que apresentem maior
sensibilidade para um determinado detector.

• Isso é necessário quando o analito:


• Não é bom cromóforo
• Não é bom fluoróforo
• Não é eletroquimicamente ativo

Nestes casos efetua-se reações específicas, formando derivados que possam


apresentar algumas das seguintes propriedades:
➢ Alta constante de equilíbrio de formação
➢ Rápida velocidade de formação
➢ Espectro UV-VIS de alta sensibilidade
➢ Fluorescência
➢ Eletroquimicamente ativos

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Derivatização pós-coluna

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DETECTORES
• O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que
registra a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser
registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a
quantidade do analito analisado.

Um detector adequado deve possuir as seguintes características:


• Alta Sensibilidade
• Estabilidade: Mudanças de temperatura e vazão de fase móvel não
devem alterar o sinal
• Reprodutibilidade
• Resposta Linear A resposta do detector deve variar linearmente
com a concentração do analito numa extensa faixa de concentração

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DETECTORES

• Resposta rápida aos analitos


• Não contribuir para o alargamento do pico: O volume da
cela do detector deve ser o menor possível para evitar a
perda de eficiência do sistema. Celas de baixo volume,
contribuem positivamente com a sensibilidade
• Confiabilidade
• Facilidade de manuseio
• Não destrutivo: Condição necessária para cromatografia
preparativa
• Seletividade: Habilidade relativa de um detector medir um
composto e não outro

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DETECTORES

Os principais detectores utilizados em HPLC são:

➢ Índice de refração
➢ Espectrometria UV-Visível
➢ Fluorescência
➢ Eletroquímico
➢ Espectrometria de massa

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Detector de Índice de Refração
• Na passagem do analito pelo detector pode ocorrer a alteração do índice
de refração (IR) da fase móvel.

• A detecção só é possível quando o índice de refração do analito é diferente


do IR da fase móvel.

• Em geral, pode ser utilizado quando os analitos não absorvem na região do


UV-VIS.

APLICAÇÃO: Análises de carboidratos em geral.

Apresenta as seguintes desvantagens:


❑ Baixa sensibilidade
❑ Não permite a utilização em análises por gradiente (pois o IR varia com a
composição da fase móvel)
❑ Temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura) 69
Detector de UV-Visível (UV-VIS)
• Baseia-se na absorbância da luz pelo analito ao passar pelo
detector.

• Detector seletivo, pois só detecta as substâncias que absorvem no


comprimento de onda em que o detector for ajustado.

• Detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das


substâncias absorvem radiação UV-Vis (entre 190 nm e 800 nm).

APLICAÇÕES: olefinas, aromáticos, compostos contendo ligações


C=O, C=S, N=O.

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Detector de UV-Visível (UV-VIS)
CONSIDERAÇÕES
➢ A fase móvel utilizada não pode absorver no comprimento de onda
selecionado
➢ A pureza da fase móvel é extremamente importante (traços de impurezas
podem absorver intensamente no comprimento de onda utilizado):
UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC
➢ Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto de
interesse absorve e outros não.
➢ Permite a utilização de análise por gradiente: escolha do comprimento de
onda onde os constituintes da fase móvel não apresentam variação de
absorbância.
➢ Permite obter o espectro de absorbância de cada componente separado
interrompendo o fluxo da fase móvel e assim selecionar o melhor
comprimento de
onda.
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Detector DAD (REDE DE DIODOS)
• Nesse tipo de detector, toda a radiação passa pela cela.

• A radiação emergente é dispersada em uma grade


holográfica e os comprimentos de onda resultantes são focalizados
em uma rede de fotodiodos (256 a 1024 fotodiodos).

• Assim, todo o espectro do analito pode ser armazenado. Pode-se


reproduzir um cromatograma para um determinado comprimento de
onda ou produzir uma série de espectros em intervalos de tempo fixos.

APLICAÇÕES:
➢ Substâncias que absorvem na região do UV-Visível.
➢ Muito importante na determinação de impurezas nas sínteses e
controle de qualidade de princípios ativos de produtos farmacêuticos.
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Detector DAD (REDE DE DIODOS)

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Detector Eletroquímico
No processo eletroquímico, um par de eletrodos é colocado na cela e
um potencial suficientemente elevado é aplicado provocando uma
reação de oxidação ou redução. Isto gera uma corrente elétrica que é
medida em um detector eletroquímico. A corrente gerada é
proporcional a concentração da substância.

Detector Amperométrico: O analito flui pela superfície do eletrodo


onde uma fração das espécies eletroativas é oxidada ou reduzida (15 a
20 %).

Detector Coulométrico: o analito flui através de um eletrodo de grafite


poroso onde praticamente 100 % das espécies eletroativas são
oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade é muito maior (10 15
fentomol)

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Detector Eletroquímico
Aplicações:
Para possibilidade de muitas substâncias serem oxidados
ou reduzidos quando se aplica um potencial elétrico.

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Detector ELSD – Espalhamento
evaporativo de luz
• Detector universal para substâncias não voláteis.

• Baseado na habilidade das partículas causarem espalhamento


(scattering) de fótons, quando atravessam um feixe de radiação
policromática.

• A fase móvel é primeiramente nebulizada e a mistura aerosol


resultante contendo as partículas dos analitos é dirigida a um feixe
de radiação com comprimento de onda previamente selecionado.

• As partículas causam espalhamento da radiação eletromagnética. É


gerado um sinal, que é proporcional à massa presente, e independe
da presença ou ausência de grupos cromóforos, fluoróforos ou
eletroativos.
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Detector ELSD – Espalhamento
evaporativo de luz
▪ Qualquer analito não volátil pode ser detectado.

▪ Pode ser usado acoplado a um espectrômetro de


massa, para fornecer uma análise completa da amostra.

Aplicações:
Lipídeos, ácidos graxos, carboidratos, polímeros,
esteroides, aminoácidos, aditivos de plásticos, produtos
farmacêuticos...

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Detector ELSD – Espalhamento
evaporativo de luz

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Detector CORONA
❖ Superior em desempenho em relação aos outros detectores, exceto
espectrômetro de massas.

❖ O eluente é primeiramente nebulizado com nitrogênio, e as gotas são


secas para remover a fase móvel, produzindo as partículas dos
analitos.

❖ Uma corrente secundária de nitrogênio passa por um sistema de alta


voltagem e é carregado positivamente.

❖ Esta carga é transferida para as partículas do analito, que flui em


sentido oposto.

❖ A carga é transferida para um coletor onde é medida por um


eletrômetro altamente sensível, gerando um sinal que é diretamente
proporcional à quantidade de analito presente.

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Detector CORONA
❖ O fator de resposta do analito é independente da
estrutura química.

APLICAÇÕES:
• Ideal para uma larga faixa de aplicações de substâncias
não voláteis e semi-voláteis: fármacos, drogas,
carboidratos, lipídios, esteróides, peptídeos, proteínas,
polímeros.

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Detector CORONA

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COMPARAÇÃO DE DETECTORES
Possibility of
Selectivity Sensitivity
Gradient System
Light-absorbing
Absorbance ng Possible
substances

Fluorescence Fluorescent substances pg Possible

Differential
None µg Impossible
refractive index
Evaporative light
Nonvolatile substances µg Possible
scattering
Electrical
Ionic substances ng Partially possible
conductivity
Oxidizing / reducing
Electrochemical pg Partially possible
substances

Note: The table indicates general characteristics. There are exceptions.


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Comparação de Detectores

83
Técnicas de preparo de amostras
acopladas com LC

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SPE online - LC

85
SP online - LC

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MODULAÇÃO DA FASE ESTACIONÁRIA EM CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA ATRAVÉS DO ACOPLAMENTO DE COLUNAS

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MODULAÇÃO DA FASE ESTACIONÁRIA EM
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ATRAVÉS DO
ACOPLAMENTO DE COLUNAS

88
PROBLEMAS EM
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

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Entupimento de coluna
Causas
Deposição de partículas sólidas ou cristalização de substâncias na
fase estacionária

Medidas preventivas
➢ Filtrar as amostras
➢ Verificar se as amostras dissolvem no eluente
➢ Verificar o histórico de pressão na coluna

Ações corretivas
✓ Checar para componentes que podem entupir, além da coluna
✓ Rinsar com solvente apropriado
✓ Abrir a entrada da coluna e trocar o filtro.

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Deformações dos Picos
Causa Ação corretiva

Sobrecarga de amostra Reduzir o volume de injeção ou a


concentração das amostras
Solvente para a fase móvel Trocar o solvente, utilizando um de menor
é inadequado capacidade de eluição

Ruídos Rinsar a coluna

Influência de efeitos Rinsar a coluna


secundários na retenção Trocar a coluna

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Diminuição do Tempo de Retenção
Causas
➢ Composição da fase móvel (eluente)
➢ Vazão da fase móvel
➢ Temperatura da coluna

Ações corretivas
✓ Verificar a compatibilidade do analito com a fase móvel
(eluente)
✓ Se a coluna é identificada como a causa, rinsar ou troca
a coluna

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Ruídos na linha base
Causas
➢ Checar se a causa do problema não é a coluna
➢ Depois de remover a coluna, a causa pode ser a
fase móvel, sistema de liberação da fase móvel
(bomba ou degaseificador) ou o próprio detector.

Ações corretivas
• Se a coluna é identificada como a causa, rinsar ou
troca a coluna
• Revisar o controle da temperatura.

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