INFORME TRABAJO PRÁCTICO

Para cátedra BIOTECNOLOGÍA

UTN-FRM

AÑO 2018

INTRODUCCIÓN A LA
MICROBIOLOGÍA, MEDIOS DE
CULTIVO Y ESTERILIZACIÓN.

OBSERVACIÒN MICROSCÒPICA Y
TINCIÒN
Según procedimiento experimental:
TP Laboratorio N°1 y 2 año 2018

SARADETCH, AGNES (LEG 38649)

LARDONE, FLORENCIA (LEG 40204)
FIGUEROA, MAXIMILIANO (LEG 38436)
OLAZÁBAL, PAULA (LEG 41146)

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INFORME:
INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA, MEDIOS DE CULTIVO Y
ESTERILIZACIÓN. OBSERVACION MICROSCÒPICA Y TINCIÒN.

INTRODUCCION:

Un medio de cultivo debe contener todas aquellas sustancias necesarias para el desarrollo del
microorganismo que se quiere cultivar. Para prepararlo es necesario seguir cuidadosamente las
indicaciones dadas sobre concentración, temperaturas de extracción, PH, condiciones de
esterilización, etc, con el fin de obtener un medio en el que puedan reproducirse en cualquier
oportunidad.
Los medios de cultivo se dividen en dos categorías, simples y complejos, de acuerdo a si son
de fórmula química conocida o no. Se pueden conservar en estado líquido (caldos y mostos) o
solidificados (con agar o gelatina). También podemos clasificarlos como medios comunes
(apropiados para la mayoría de los microorganismos) o especiales (mejorados, selectivos,
diferenciales, de enriquecimiento, etc).
Las inoculaciones o siembras de microorganismos pueden hacerse en medios líquidos o sólidos
(distribuidos en tubos, cajas de Petri, frascos, etc).
Los tubos pueden prepararse para siembra en punción o estrías y las cajas de Petri se pueden
sembrar en medios solidos o colocar cierta cantidad de muestra en el fondo y luego colocar el
medio agarizado en estado liquido (entre 45°C y 50°C) y dejar que se solidifique rotando
suavemente para su uniforme distribución.
La siembra de los microorganismos se realiza por medio de pipetas o ansas con forma de aguja,
gancho u ojal.
Se trabaja siempre entre dos mecheros prendidos para asegurar una atmosfera inerte, es
necesario que todo el material experimental este exento de microorganismos vivos, para que las
manifestaciones que se evidencien se puedan asignar con seguridad a la muestra inoculada.
La esterilización de los materiales empleados en microbiología puede realizarse por varios
métodos físicos (por medio de calor) o químicos.
Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población heterogénea de
micoorganismos. El objetivo del aislamiento es obtener colonias bien separadas (las colonias
se forman a partir de una sola “unidad formadora de colonias”) de las que se conseguirá un
cultivo puro. Una vez obtenidos los cultivos puros se podrán estudiar las características
macroscópicas, microscópicas, fisiológicas, etc. de un microorganismo en particular. En el
presente trabajo aislaremos colonias por estriado en pico de flauta.
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que
la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.

OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Conocer las técnicas de esterilización de materiales y medios de cultivo.
• Realizar siembra de microorganismos en los distintos medios.
• Observación de microorganismos (focalización microscópica)
• Realizar tinción de Gram.

Se divide la experiencia en 5 etapas:

ETAPA Nº1: Preparación de medios de cultivo, esterilización y vaciado.
ETAPA Nº2: Estriado, siembra e incubación.
ETAPA Nº3: Lectura y aislaciòn de colonias.
ETAPA Nº4: Tinciòn y morfología bacteriana.
ETAPA Nº5: Observación microscópica

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DESARROLLO:
ETAPA Nº1: Preparación de medios de cultivo, esterilización y vaciado:

Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes que en concentraciones
adecuadas y con condiciones físicas óptimas permiten un buen crecimiento de los
microorganismos. Contienen una base mineral; fuente de carbono, nitrógeno y azufre
• Formula básica de los medios de cultivos: agua cloruro de sodio, peptona. Extractos de
carne o de levadura.
• El agar no se utiliza como nutriente solo para darle solidez a los medios de cultivos.
• Para el crecimiento de las bacterias hay que proporcionarles: los medios de cultivos
apropiados la temperatura óptima y la atmósfera requerida.

COMPOSICIÒN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: (ver ANEXO I y II)

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
• Se transfiere el medio a un erlenmeyer y se agrega la cantidad de agua destilada
establecida.
• se disuelven los grumos que puedan formarse y se lleva la suspensión a baño maría hasta
que el medio se torne transparente, se cubre el erlenmeyer con un tapón de algodón. Se
cubre el tapòn con material impermeable y se esteriliza en autoclave a 121ºC durante
15 minutos.
• Si se utiliza de inmediato, dejar enfriar a temperatura alrededor de 45ºC.
• En caso de que el medio solidifique, fundirlo nuevamente a baño maría antes de su uso.
• Preparar placas de Petri con agar nutritivo fundido y mantenido a 45 °C.
• Esperar que el medio solidifique y luego secar las placas invertidas en estufa a 37 °C.

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ETAPA Nº2: Estriado, siembra e inoculación.

• EQUIPO NECESARIO
o Cajas de Petri
o Ansa de ojal
o Mechero de Bunsen
o Medio de cultivo agarizado
o Muestras para análisis.
o Estufa de incubación (a 25°C)
o Equipo de protección personal: guantes, anteojos de seguridad, guardapolvo.

MUESTRAS PARA ANALISIS:

MUESTRA Nº 1: Solución de levadura en agua.
MUESTRA Nº 2: Agua de acequia.
MUESTRA N°3: Saliva.

OBSERVACIONES:
MANEJO DE MUESTRAS:
• Desde que la muestra es recogida hasta su procesamiento es fundamental que no se
contamine, que no se produzca una proliferación excesiva de flora bacteriana y que los
posibles microorganismos presentes en la muestra permanezcan viables.
• Para esto es importante que la muestra sea recogida, transportada y manipulada de forma
adecuada.
• Las muestras deben ser inoculadas en el medio de cultivo adecuado.
• Si no pueden ser inoculadas al llegar al laboratorio, deben ser conservadas de forma
adecuada.
• Como norma general, las muestras deben ser refrigeradas a 4-6 ºC. El período de
refrigeración varía con el tipo de muestra.
• Con la refrigeración se pretende evitar un crecimiento excesivo de los microorganismos
y mantenerlos viables.
DILUCION DE MUESTRAS:
La carga microbiana de las muestras puede llegar a entorpecer la observación debido a la gran
cantidad de microorganismos que crecen en los medios de cultivo; por este motivo es
conveniente realizar diluciones para poder obtener una siembra donde sea más fácil contabilizar
las colonias.

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• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

• Limpiar el área de trabajo de la mesada con alguna sustancia desinfectante y

encender los mecheros.
• Tomar la caja de Petri con el medio de cultivo solido (agarizado), colocar entre dos
mecheros bunsen encendidos para asegurar una atmosfera inerte.
• Calentar el ansa de inoculación hasta que quede color rojo intenso para eliminar
cualquier microorganismo,
• Dejar que el asa se enfrié durante 3-5 segundos.
• Recoger una muestra del cultivo bacteriano a partir de un caldo o una placa Petri.
• Levantar la tapa de la placa Petri que se va a sembrar en un ángulo de 45°, tocar con
el ansa el medio y pasarlo a través de la superficie de la placa con un movimiento
zigzagueante.
• Se adopta el Estriado por cuadrantes: se divide la parte inferior de la caja Petri en
cuatro partes iguales. Se esteriliza el ansa y se estría el 1er cuadrante con el
procedimiento básico de S. Se trabaja en el sentido de las agujas del reloj, estriando
cuadrante por cuadrante; Estriar para aislar implica una sola inoculación de una
sección de la placa de Petri y a continuación, disminuir la colonia arrastrando
microorganismos de la sección inicial de dos o tres secciones adicionales, achicando
eficazmente la población de microorganismos.
• Las placas de Petri son un ambiente rico en nutrientes, por lo que es importante la
utilización de técnicas estériles en todo momento. Nunca dejar la placa de Petri
abierta. Siempre exponer el ansa de inoculación a las llamas antes y después de
transferir las bacterias de un medio a otro.
• Incubar las placas INVERTIDAS en estufa a 37ºC hasta la clase siguiente.

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OBSERVACIONES:
Otra metodología de siembra es realizarla por vertido en placa.
Consiste en depositar en una placa de Petri vacía un pequeño volumen conocido de muestra y
a continuación añadir el medio de cultivo fundido y atemperado, mezclando por rotación suave
de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirán homogéneamente en el medio
de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

• RESULTADOS OBTENIDOS:
RESULTADO DE LA SIEMBRA EN CAJA DE PETRI:

MUESTRA N°1: Levadura

MUESTRA N°2: Agua de acequia

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 MUESTRA N°3: Saliva

OBSERVACIONES:
Las colonias son masas visibles de células que se forman por división de una o varias células.
El desarrollo de colonias sobre superficies de agar permite al microbiólogo identificar las
bacterias porque las especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto característico.
El tamaño, forma, textura y color de una colonia es propio de cada organismo.
La morfología de la colonia de una bacteria puede variar según el medio en que crezca la
bacteria.

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ETAPA Nº3:

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS:
Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos
de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no
cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por
escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células
similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá
como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.
Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible
diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de
bacteria, se estudian sus características sembrándolas en medios de cultivo especiales.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Siembra en agar inclinado (pico de flauta) por estriado.
• Flamear el ansa.
• Obtener material a sembrar.
• Apoyar el ansa sobre la superficie del agar y estriar con el diseño mostrado en D.

OBSERVACIONES:

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ETAPA Nº4: Tinción y morfología bacteriana.

La coloración de Gram. tiene interés taxonómico ya que divide las bacterias en dos grandes
grupos, bacterias Gram positivas y bacterias gram negativas.
La pared de todas las bacterias (Gram positivas y Gram negativas) posee una capa rígida
llamada peptidoglicano o mureína. Éste es un polisacárido formado por dos aminoazúcares: N-
acetilglucosamina (NAG) y N-acetilmurámico (NAM) que se unen alternadamente por enlaces
β1-4: NAG-NAM-NAG-NAM-NAG y un pequeño grupo de aminoácidos: L-alanina, D-
alanina, D-glutámico y, lisina o ácido diaminopimélico (DAP). Esta estructura se repite a lo
largo de toda la pared. La estructura básica del peptidoglicano está constituida por largas
cadenas adyacentes del polisacárido y estas cadenas se conectan entre sí a través de puentes
peptídicos formados por los aminoácidos mencionados.
en la coloración de Gram:
Se verán:
• las bacterias Gram positivas: azul violáceas
• las bacterias Gram negativas: rojas rosadas

La diferencia radica en la composición química y en la estructura física de la pared celular de

las bacterias. Las bacterias Gram positivas no tienen lípidos en su pared, las Gram negativas sí
lo tienen y en abundancia. Con cristal violeta (CV) se tiñen todas. Al agregar el mordiente, éste
forma un complejo con CV que mejora la tinción.
Al agregar el decolorante alcohol, en las bacterias Gram negativas disuelve los lípidos de la
pared, penetra en el protoplasma y quita el complejo cristal violeta – iodo y en las bacterias
Gram positivas, que no tienen lípidos en su pared, el decolorante produce deshidratación del
peptidoglicano compactándolo, no ingresa al protoplasma y no puede remover el complejo CV
– iodo. Estas bacterias permanecen azules violetas.

OBSERVACION:
Las levaduras teñidas al Gram se ven positivas, aunque presentan una pared celular con una
estructura química distinta a la pared de las bacterias Gram positivas.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
• Preparación de extendidos y coloración por el método de Gram.
o Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos.
o Preparar extendidos de los microorganismos indicados
o Tomar material de la colonia elegida, con un ansa previamente esterilizada a la
llama y suspender este material en una gota de agua colocada en la mitad del
portaobjetos.
o Extender el material sobre la superficie del portaobjeto.
o Dejar secar al aire junto a la llama del mechero.
o Fijar con calor pasando el preparado por sobre la llama SIN QUEMARLO.
o Cubrir el extendido con una solución del colorante violeta de genciana. Dejar
en contacto 2 minutos.
o Volcar el colorante.
o Lavar con agua.
o Secar y Observar al microscopio óptico.
o Se deberán reconocer las características morfológicas y tintoriales de las
distintas bacterias.

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CLASIFICACIÒN
Forma:
Esférica (COCOS)
Alargada (BACILOS)
Bacilos cortos (COCOBACILOS)
Agrupamiento:
Aislado (individual)
Diplos
Tetradas
Cadenas
Racimos
Empalizada

ETAPA Nº5: observación microscópica.

Los microscopios son instrumentos ópticos o electrónicos con un elevado poder resolutivo, que
posibilita la observación de los microorganismos, células y otras estructuras microscópicas, al
proporcionar una imagen aumentada virtualmente del tamaño real a total magnitud que
posibilitan su observación a través de su empleo.
Se fabrican dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. De cada tipo se comercializan
diferentes modelos y aditamentos especiales para proporcionar determinados efectos, aunque
todos tienen respectivamente el mismo principio.
Los microscopios ópticos son instrumentos de laboratorio, diseñados básicamente con una sola
lente o mediante un sistema de lentes de aumentos, que son ubicados alineadamente en el eje
óptico del microscopio para que proporcionen una imagen virtual ampliada de los objetos
microscópicos examinados, lo que hace posible su observación, siempre que se utilice una
adecuada iluminación.
los compuestos funcionan mediante la combinación de varias lentes, que conjuntamente con
una fuente de iluminación, forman parte de un sistema óptico, que tiene como soporte a un
sistema mecánico, provisto de diversas piezas y aditamentos que deben ser manipulados para
lograr y mantener el enfoque de la preparación, recorrerla y observar la cantidad de campos
microscópicos que sean pertinentes.

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El sistema mecánico consta de las siguientes partes:

1. Base o pie.
2. Brazo.
3. Tubo óptico.
4. Revolver portaobjetivos.
5. Platina
6. Tornillos.

Los principios básicos en que se sustenta el empleo utilitario de los microscopios son
esencialmente de:
• Su poder de resolución.
• La capacidad de formar imágenes.
El poder de resolución es equivalente a la potencia de observación, lo cual está delimitado por
la menor distancia entre dos puntos muy próximos entre sí, en que es posible observarlos
separadamente.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
• Cerciorarse de que el aumento del lente ocular es el pertinente para el tipo de
microscopía que va a realizar.
• Rote el revolver portaobjetivos y coloque sobre el hueco de la platina el lente objetivo
de menor aumento.
• Accione el tornillo del elevador y suba el condensador.
• Mueva la palanquita y abra el diafragma.
• Si el microscopio fuera monocular, mirando por la lente ocular, proceda a mover
convencionalmente el espejo de manera que los rayos de luz procedentes de la fuente
de iluminación se reflejen y los desvíen hacia el condensador, lo cual se podrá constatar
cuando el campo microscópico se observe completamente iluminado.
• Si el microscopio carece de espejo por disponer de una lámpara acoplada en su base,
Bastará con encenderla.
• Si fuera un microscopio binocular, previamente, mueva lateralmente los lentes hasta
Hacerlos coincidir con la distancia intrapupilar, que logrará con exactitud cuando vea
un solo campo,
• Coloque la lámina portaobjetos con la preparación sobre la platina y fíjela con las
pinzas.
• Con ayuda de los tornillos de desplazamientos laterales o frontales mueva la preparación
hasta situarla debajo del lente objetivo.
• aproxime, con ayuda del tornillo macrométrico el lente objetivo seco, hasta que quede
a 4 ó 5 mm de la preparación. Si fuera a utilizar el lente de inmersión
• Mirando por el lente ocular, proceda a separar lentamente el lente objetivo de la
preparación con ayuda del tornillo macrométrico hasta que logre avizorar la imagen
microscópica. Seguidamente gire el tornillo micrométrico hasta que el enfoque sea
nítido.

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 • Si el enfoque se realizó con objetivo seco de poco aumento y se requiere un objetivo de
más aumento, rote el revolver portaobjetivos y sitúe sobre la preparación el lente
requerido. Si el microscopio está debidamente ajustado, al cambiar el lente objetivo
debe quedar enfocado el mismo campo pero con menos radio de observación.
• Ajuste la altura del condensador y la abertura del diafragma a las necesidades de
iluminación de la microscopía que vaya a efectuar.
• Para recorrer la preparación y observar los campos necesarios, accione con su mano
derecha los tornillos de la platina y desplace la lámina en diferentes direcciones, y con
su mano izquierda accione el tornillo micrométrico para ir corrigiendo el enfoque
cuando la lámina esté en movimiento.

RESULTADOS OBTENIDOS:

OBSERVACION MICROSCOPICA PREVIA: (Observación en fresco)

MUESTRA N°1: Levaduras

MUESTRA N°2: Agua de acequia

OBSERVACIÒN:
La morfología de los microorganismos puede examinarse de dos formas: observando
microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando células muertas teñidas
con colorantes. El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas
de sus características (morfología, tamaño, movimiento, etc).
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OBSERVACION DE MUESTRAS LUEGO DE TINCIÒN:

MUESTRA N°1: Levaduras

MUESTRA N°2: Agua de acequia.

MUESTRA Nº3: Saliva.

OBSERVACION:
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio
que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.

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CONCLUSIONES:
,
• El medio de cultivo debe ser seleccionado de acuerdo a la finalidad de la siembra.
• Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio.
• Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios
y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
• El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de
cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al
enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de
las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.
• La técnica de siembra por estriado a partir de un inóculo poco denso, favorece la
obtención de colonias aisladas.
• Las tinciones de los microorganismos favorecen la observación al microscopio óptico
de determinadas estructuras que incluyen la visualización de cápsulas, endosporas,
flagelos etc.
• El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver
con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula
y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización
de colorantes. Éstos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células
o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como
flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

• La morfología de los microorganismos puede examinarse de dos formas: observando

microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando células muertas teñidas
con colorantes. El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas
de sus características (morfología, tamaño, movimiento, etc). Sin embargo, las
microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fácilmente al
microscopio óptico normal cuando se encuentran suspendidos en agua, de ahí que se
utilicen colorantes para incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de esta
forma hacerlos visibles.

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