Edwin Barbosa

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN
TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.
MONITOREO DE LA PRODUCCIÓN DE
β-FRUCTOFURANOSIDASAS A PARTIR DE LA
LEVADURA Kluyveromyces marxianus SLP1
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE
MAESTRO EN CIENCIA Y
TECNONOLOGÍA
EN LA ESPECIALIDAD DE
BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA
PRESENTA
I.Q. EDWIN JARET BARBOSA HERNÁNDEZ
GUADALAJARA, JALISCO JUNIO 2017.
1
TÍTULO
MONITOREO DE LA PRODUCCIÓN DE β-FRUCTOFURANOSIDASAS A

PARTIR DE LA LEVADURA Kluyveromyces marxianus SLP1
Presenta: I.Q. Edwin Jaret Barbosa Hernández
Tutor Académico: Dr. Enrique Jaime Herrera López
Tutor en planta: Dra. Anne Christine Gschaedler Mathis
Asesor: M. en C. y T. Alejandro Arana Sánchez
2
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, agradezco a mis padres, que han estado siempre ahí brindándome su apoyo y
consejo, a quienes debo y dedico todo cuanto soy. Mi madre, fuente infinita de cariño y
comprensión, y a quien debo mi parte más humana. Mi padre, la persona que más admiro, pues
con el ejemplo me ha demostrado que las metas propuestas se pueden lograr con inteligencia,
esfuerzo y dedicación, y siempre seguir mirando más allá. Ambos son mi respuesta a las
preguntas: ¿Quién es tu héroe? ¿Qué quieres ser de grande? Madre… Padre… GRACIAS.
A Kika y a Rodo, mis hermanos. Mis eternos cómplices y mis mejores amigos. Para quienes no
busco ser un ejemplo, sino quien camina a su lado para celebrar sus triunfos y apoyar en los
fracasos; y quizá de vez en vez, atreverme a ofrecerles un consejo. Ellos, mi motor para ser la
mejor versión de mí mismo. GRACIAS.
A mi novia Martha, quien me ha dado su apoyo incondicional y me ha motivado a crecer siempre

personal y profesionalmente.
A Richie, infatigable oído de mis logros y frustraciones durante esta etapa, y quien siempre tuvo
para mí unas palabras de aliento.
Al Dr. Enrique Herrera, quien tuvo fe en mí. Cuya personalidad sencilla, afable y práctica, así
como su apoyo y consejo me permitieron llegar a buen puerto en esta etapa de mi desarrollo
profesional.
Al Dr. Alejandro Arana, quien tuvo la paciencia de transmitirme sus conocimientos y de quien
adopté la forma de trabajo y pensamiento analítico. No habría avanzado tanto en mi proyecto de
tesis sin su incondicional asesoría dentro y fuera de CIATEJ, y cuya amistad atesoraré por
siempre.
A la Dra. Anne Gschaedler, por sus oportunos consejos que me permitieron crecer en mi
formación académica.
Al Dr. Jorge Pliego, cuyo apoyo en el diseño del sistema de control automático de nivel para el
biorreactor y su atenta disponibilidad para enseñarme a usar el SIA fueron decisivos en el logro
de los objetivos de este proyecto.
3
A los miembros del jurado, el Dr. Melchor Arellano Plaza y el Dr. Javier Placido Gaviño; por
sus acertados consejos para la corrección de este trabajo de investigación.
A todos mis compañeros y amigos de CIATEJ, con quieres compartí alegrías, frustraciones y
una que otra bebida espirituosa, y que sin duda hicieron más amena mi estadía en el laboratorio
y cuyas amistades deseo seguir cultivando. Agradecimiento especial para mis amigos Hazael y
Luis Jorge, que siempre estuvieron a bien resolver mis dudas y ayudarme con los problemas de
software y electrónica que se me presentaron en este proyecto.
Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ)

y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el financiamiento de mis
estudios de maestría con la beca 407127.
4
RESUMEN
Este proyecto de tesis tuvo como objetivo principal encontrar las condiciones apropiadas para
obtener la máxima producción de β-fructofuranosidasas a partir de la levadura Kluyveromyces
marxianus SLP1; así como el desarrollo de estrategias para el monitoreo de la actividad β-
fructofuranosidasa en la misma levadura.
Primeramente, se realizó un estudio para determinar los parámetros cinéticos del crecimiento de
la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1, así como estudiar la producción de las β-
fructofuranosidasas en dependencia de la complejidad de las cadenas de monosacáridos de la
fuente de carbono, desde glucosa y fructosa hasta sacarosa, inulina y fructanos de agave (FA).
La mayor actividad enzimática se logró con inulina y FA.
Se llevó a cabo un análisis por superficie de respuesta sobre dos cultivos en estado continuo con
el objetivo de determinar las mejores condiciones del proceso de fermentación que favorezcan
la producción de las β-fructofuranosidasas. Los factores del primer cultivo en continuo fueron
temperatura (26, 30 y 34 °C), velocidad especifica de crecimiento (0.05, 0.225 y 0.4 h -1) y
concentración de glucosa de alimentación (20, 40 y 60 g/L). Para el segundo continuo se
consideró la temperatura (30, 34 y 38 °C) y la velocidad específica de crecimiento (0.05 y 0.09
h-1). Las mejores condiciones fueron 34 °C, 0.05 h-1 y 20 g/L, donde se consiguió un valor de
actividad enzimática de hasta 800 U/ml, que es la máxima producción reportada en la literatura
con glucosa como fuente de carbono.
Un par de cultivos en lote alimentado fueron diseñados para producir β-fructofuranosidasas bajo
condiciones limitadas de glucosa. Se observó que la actividad fue mayor a una velocidad
específica de crecimiento de 0.05 h-1, y se redujo por la falta de oxigenación a µ < 0.05 h-1.
Finalmente, se desarrolló una metodología para la determinación de actividad β-

fructofuranosidasas en un sistema de análisis de inyección secuencial (SIA, por sus siglas en
inglés). Además, se empleó el método desarrollado para monitorear la actividad enzimática en
línea durante el segundo cultivo en estado continuo, acoplando el biorreactor y el sistema SIA.
Aunque se presentó una alta variabilidad en el análisis, el sistema SIA tiene el potencial de ser
un sistema fiable para el monitoreo de la actividad en línea.
5
ABSTRACT
The main objective of this project was to find appropriate conditions to obtain the maximum β-
fructofuranosidases production using the yeast strain Kluyveromyces marxianus SLP1; as well
as the development of strategies for monitoring β-fructofuranosidase activity during the culture.
First, it was carried out a study to evaluate the behavior and growth kinetics of Kluyveromyces
marxianus SLP1, as well as the production of the β-fructofuranosidases changing the carbon
source with increasing molecular complexity like glucose, fructose, sucrose, inulin and agave
fructan (AF). The highest enzymatic activity was achieved using inulin and AF.
A response surface analysis was carried out for two chemostats in order to determine the best
conditions process to maximize the β-fructofuranosidases production. The factors of the first
chemostat were temperature (26, 30 and 34 °C), specific growth rate (0.05, 0.225 and 0.4 h-1)
and glucose concentration in media feed (20, 40 and 60 g/l). The temperature (30, 34 and 38 °C)
and the specific growth rate (0.05 and 0.09 h-1) were considered for the second chemostat. The
best conditions obtained were 34 °C, 0.05 h-1 of specific growth rate and 20 g/l of sugar
concentration feed, achieving an enzymatic activity value up to 800 U/ml, which is the highest
value reported in the literature with glucose as a carbon source.
Fed batch cultures were carried out to produce β-fructofuranosidases under limited glucose
conditions. The highest enzymatic production was observed at a specific growth rate of 0.05 h-
1
, and decreased when it was limited by oxygen and μ < 0.05 h-1.
Finally, a methodology for the determination of the β-fructofuranosidases activity was

developed using a sequential injection analysis system (SIA). In addition, the developed method
to monitor the enzymatic activity in line during the second chemostat was used, coupling the
bioreactor and the SIA system. Although there was high variability in the analysis, the SIA
system has the potential to be a reliable system for monitoring on-line activity.
6
MARCO
Este trabajo se llevó a cabo bajo el proyecto SPECTRE (spectroscopies for the evaluation and
control in real time of biological cells physiological state), que fue un desarrollo de colaboración
entre Francia y México con el objetivo de desarrollar un sistema en línea capaz de monitorear
el estado fisiológico de los microorganismos durante fermentaciones o cultivos celulares. El
responsable del proyecto SPECTRE en México fue la Dra. Anne Christine Gschaedler Mathis,
actual directora de CIATEJ Unidad Zapopan.
En el estudio de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1 para la producción de β-

fructofuranosidasas participaron como estudiante de Doctorado el M. en C. Alejandro Arana
Sánchez y como estudiante de Maestría Edwin Jaret Barbosa Hernández. Vale la pena
mencionar que ambos estudiantes trabajaron en paralelo en sus proyectos de tesis, por lo que
comparten parte de los datos experimentales, pero enfocándolos a sus objetivos particulares y
concluyendo de manera independiente.
7
ÍNDICE DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 16
2. ANTECEDENTES ........................................................................................................... 18
2.1. Levaduras .................................................................................................................. 18
2.1.1. Generalidades de las levaduras ............................................................................ 18
2.2. Kluyveromyces marxianus ............................................. ¡Error! Marcador no definido.
2.2.1. Generalidades de la Kluyveromyces marxianus ................................................... 19
2.2.2. Metabolismo de Kluyveromyces marxianus ......................................................... 20
2.2.3. Crecimiento y termotolerancia de Kluyveromyces marxianus ............................. 21
2.2.4. Aplicaciones biotecnológicas de Kluyveromyces marxianus ............................... 22
2.3. β-fructofuranosidasas ............................................................................................... 23
2.4. Producción de β-fructofuranosidasas en Kluyveromyces marxianus .................... 24
2.5. Sistemas de cultivo .................................................................................................... 25
2.5.1. Sistemas de cultivo en lote (batch) ...................................................................... 26
2.5.2. Sistemas de cultivo en lote alimentado (fed-batch) ............................................. 28
2.5.3. Sistemas de cultivo en estado continuo ................................................................ 30
2.6. Monitoreo de bioprocesos ........................................................................................ 32
2.6.1. Espectroscopia dieléctrica .................................................................................... 33
2.6.2. Sistema de análisis y conteo de células (CASY®)................................................ 34
2.6.3. Sistema de análisis por inyección secuencial (SIA) ............................................. 35
2.7. Optimización estadística de bioprocesos, MSR. ..................................................... 37
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................... 39
4. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................ 40
5. HIPÓTESIS ...................................................................................................................... 41
8
6. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 42
6.1. Objetivo principal ..................................................................................................... 42
6.2. Objetivos específicos ................................................................................................. 42
7. METODOLOGÍA ............................................................................................................ 43
7.1. Microorganismo ........................................................................................................ 43
7.2. Medios de cultivos ..................................................................................................... 43
7.3. Banco de trabajo del microorganismo .................................................................... 45
7.4. Activación de cepa .................................................................................................... 45
7.5. Preparación del inóculo ............................................................................................ 46
7.6. Preparación del biorreactor e instrumentación ..................................................... 46
7.7. Técnicas analíticas .................................................................................................... 47
7.7.1. Monitoreo de biomasa .......................................................................................... 47
7.7.2. Consumo de sustrato ............................................................................................ 50
7.7.3. Actividad β-fructofuranosidasa ............................................................................ 51
7.8. Cultivos en lote en biorreactor ................................................................................ 52
7.9. Cultivos en estado continuo en biorreactor ............................................................ 53
7.10. Cultivos en lote a temperatura óptima ................................................................... 55
7.11. Cultivos en lote alimentado ...................................................................................... 56
7.12. Monitoreo de actividad β-fructofuranosidasa en línea.......................................... 57
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN...................................................................................... 60
8.1. Cultivos en lote en biorreactor y pruebas con diferentes fuentes de carbono..... 60
8.1.1. Cultivo en lote con glucosa como fuente de carbono........................................... 60
8.1.2. Cultivo en lote con fructosa como fuente de carbono .......................................... 63
8.1.3. Cultivo en lote con sacarosa como fuente de carbono ......................................... 65
8.1.4. Cultivo en lote con inulina como fuente de carbono ............................................ 67
9
8.1.5. Cultivo en lote con fructanos de agave como fuente de carbono ......................... 70
8.1.6. Comparativa entre actividad enzimática y fuente de carbono .............................. 72
8.2. Cultivos en estado continuo en biorreactor ............................................................ 73
8.2.1. Primer cultivo en continuo ................................................................................... 73
8.3. Cultivos en lote a 34 °C en biorreactor ................................................................... 82
8.4. Cultivos en lote alimentado en biorreactor ............................................................ 85
8.4.1. Primer cultivo en lote alimentado ........................................................................ 86
8.4.2. Segundo cultivo en lote alimentado ..................................................................... 90
8.5. Monitoreo en línea de la actividad β-fructofuranosidasa ..................................... 94
8.5.1. Metodología para la curva de calibración en el sistema SIA ............................... 94
8.5.2. Metodología para la determinación de actividad β-fructofuranosidasa en el sistema

SIA……………………………………………………………………………………….98
8.5.3. Monitoreo en línea de la actividad β-fructofuranosidasa de un cultivo en

continuo…………………………………………………………………………………105
9. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 108
10. PERSPECTIVAS ........................................................................................................... 109
11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 110
12. ANEXOS ......................................................................................................................... 119
10
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 2.1. Parámetros de crecimiento de algunas cepas de Kluyveromyces. ............................ 22
Tabla 2.2. Lista resumen de cepas de K. marxianus productoras de fructanasa/inulinasa. ....... 25
Tabla 7.1. Composición del medio YPD ................................................................................... 43
Tabla 7.2. Composición del medio químicamente definido ...................................................... 44
Tabla 7.3. Compuestos del reactivo DNS.................................................................................. 50
Tabla 7.4. Combinación de factores para el diseño experimental 23......................................... 54
Tabla 7.5. Condiciones de los experimentos aplicados en el segundo cultivo en continuo. ..... 55
Tabla 8.1. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática
para el cultivo en lote utilizando glucosa como fuente de carbono .......................... 62
para el cultivo en lote utilizando fructosa como fuente de carbono.......................... 64
para el cultivo en lote utilizando sacarosa como fuente de carbono ......................... 66
para el cultivo en lote utilizando inulina como fuente de carbono ........................... 68
para el cultivo en lote utilizando FA como fuente de carbono ................................. 71
Tabla 8.11. Resultados de biomasa y actividad enzimática del primer cultivo en estado continuo.
................................................................................................................................... 74
Tabla 8.12. Análisis de varianza para la actividad enzimática .................................................. 76
Tabla 8.13. Condiciones y resultados para el segundo cultivo en continuo. ............................. 80
Tabla 8.14. Protocolo para un punto de la curva de calibración en el SIA ............................... 95
Tabla 8.15. Protocolo para el blanco de la muestra en el SIA ................................................... 98
Tabla 8.16. Protocolo para la determinación de la actividad β-fructofuranosidasa en el SIA .. 99
Tabla 8.17. Protocolo para el módulo de dilución 1:10........................................................... 100
11
Tabla 8.18. Comparativa técnica en microplaca vs sistema SIA............................................. 103
Tabla 8.19. Protocolo para succión de sobrenadante desde biorreactor .................................. 106
Tabla 8.20. Comparativa técnica en microplaca vs sistema SIA en línea. .............................. 107
12
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1. Filogenia de la levadura Kluyveromyces marxianus ............................................... 20
Figura 2.2 Levadura Kluyveromyces marxianus SLP1 ............................................................. 20
Figura 2.3. Estructura general de los fructanos ......................................................................... 24
Figura 2.4. Fases de crecimiento microbiano ............................................................................ 27
Figura 2.5. Comportamiento de la biomasa en un cultivo en lote alimentado .......................... 29
Figura 2.6. Coeficiente de mantenimiento a alta concentración de biomasa ............................ 30
Figura 2.7. Concentración de biomasa y sustrato limitante en estado estacionario a distintos

valores de D .......................................................................................................... 31
Figura 2.8. Sistemas de cultivo.................................................................................................. 32
Figura 2.9. Esquema de la medición de la viabilidad y sonda de espectroscopia dieléctrica. .. 34
Figura 2.10. Sistema de análisis y conteo celular (CASY®) ..................................................... 35
Figura 2.11. Esquema de un sistema de análisis por inyección secuencial ............................... 36
Figura 2.12. Sistema SIA ........................................................................................................... 37
Figura 2.13. Visión gráfica de la metodología por superficie de respuesta .............................. 38
Figura 7.1. Rejilla de conteo de la cámara de Neubauer y recuadros contados ........................ 48
Figura 7.2. Descripción del sistema de análisis de inyección secuencial (SIA). ....................... 59
Figura 8.1. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con glucosa.......... 61
Figura 8.2. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con glucosa. ....... 62
Figura 8.3. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con fructosa. ........ 63
Figura 8.4. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con fructosa. ...... 64
Figura 8.5. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con sacarosa. ....... 65
Figura 8.6. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con sacarosa. ..... 66
Figura 8.7. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con inulina. .......... 68
Figura 8.8. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con inulina. ........ 69
13
Figura 8.9. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con FA. ................ 70
Figura 8.10. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con FA. ............ 71
Figura 8.11. Comparativa de actividad enzimática según la fuente de carbono. ...................... 72
Figura 8.12. Gráfico de efectos principales. .............................................................................. 77
Figura 8.13. Gráfica de interacciones entre factores. ................................................................ 77
Figura 8.14. Superficie de respuesta para la actividad enzimática en función de los factores
probados. .............................................................................................................. 78
Figura 8.15. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática a µ = 0.05 h-1. ................ 81
Figura 8.16. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote 1 a 34 °C. .......... 82
Figura 8.17. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote 1 a 34 °C. ......... 83
Figura 8.18. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote 2 a 34 °C. .......... 84
Figura 8.19. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote 2 a 34 °C. ......... 84
Figura 8.20. Actividad enzimática de muestras dializadas vs no dializadas. ............................ 85
Figura 8.21. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote alimentado 1. ..... 86
Figura 8.22. Biomasa total vs tiempo para el cultivo en lote alimentado 1. ............................. 87
Figura 8.23. Biomasa vs actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote alimentado 1.88
Figura 8.24. Actividad enzimática y velocidad específica de crecimiento para el cultivo en lote
alimentado 1. ........................................................................................................ 89
Figura 8.25. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote alimentado 2. ..... 90
Figura 8.26. Biomasa total vs tiempo para el cultivo en lote alimentado 2. ............................. 91
Figura 8.27. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote alimentado 2. ... 92
alimentado 2. ........................................................................................................ 94
Figura 8.29. Respuestas generadas por el SIA para la curva de calibración. ............................ 97
Figura 8.30. Curva de calibración SIA. ..................................................................................... 97
Figura 8.31. Respuesta SIA para la actividad β-fructofuranosidasa de una muestra. ............. 101
14
Figura 8.32. Respuesta SIA con y sin generación de burbujas espontaneas para la misma
muestra. .............................................................................................................. 102
Figura 8.33. Repetibilidad en actividad enzimática para la muestra B2. ................................ 102
Figura 8.34. Gráfica de medias entre las técnicas de microplaca y SIA. Muestras A. ............ 104
Figura 8.35. Gráfica de medias entre las técnicas de microplaca y SIA. Muestras B. ............ 104
Figura 8.36. Sistema de cultivo en continuo ........................................................................... 105
Figura 8.37. Biorreactor, sistema SIA y línea de acoplamiento. ............................................. 106
15
1. INTRODUCCIÓN
El monitoreo y control de parámetros en un proceso es de gran importancia a nivel laboratorio
e industrial para garantizar un alto rendimiento y una adecuada productividad. Un método de
monitoreo apropiado podría permitir obtener información de un cultivo, pudiéndose aplicar
estrategias para desarrollar, optimizar y controlar el proceso, garantizando la máxima eficiencia
y la calidad posible de un producto de interés [1].
Los procesos biotecnológicos han sido utilizados desde los inicios de la civilización para la
elaboración de alimentos y bebidas, aún con el desconocimiento de los individuos de esa época.
Actualmente, la biotecnología se emplea para producir una gran variedad de productos, tales
como metabolitos primarios y secundarios, células, tejidos, vacunas y proteínas terapéuticas;
empleando deferentes sistemas de células huésped. Por ejemplo, células bacterianas, células
vegetales y células eucariotas, como las levaduras; con requisitos específicos para el diseño de
biorreactores, composición de medios y control de procesos [2].
Los nuevos retos en la biotecnología demandan que el investigador cuente con los
conocimientos necesarios que le permitan favorecer la producción de metabolitos manipulando
las condiciones operacionales y nutricionales del cultivo. Este conocimiento se puede obtener
en especial a través del monitoreo de variables claves en el bioproceso. De modo que la
información obtenida con el registro de las variables pueda ser utilizada para convertirlas en
estrategias de optimización; por ejemplo, mediante el cribado de alto rendimiento y el diseño de
experimentos.
Dentro de la amplia gama de productos y subproductos de origen vegetal destaca la inulina y el

interés por producirla a nivel mundial se ha incrementado debido a la creciente demanda de
productos alimenticios ricos en fibra y suplementos dietéticos; aumentando la inversión en la
industria de alimentos y bebidas para la innovación y el desarrollo de nuevos productos
alimenticios enriquecidos con prebióticos. Se prevé que el mercado mundial de inulina
experimente un crecimiento significativo en los próximos años, con un crecimiento anual de
9.1% hasta 2020. Se estima que su valor en el mercado global sea de $ 2.35 mil millones USD
para ese año [3].
16
En México, también existe un marcado interés en la obtención de fructanos a través de plantas
endémicas. En especial los fructanos proveniente del agave, pues de las 310 especies de agave
reportadas, 272 se pueden encontrar en México, que es considerado como el centro de origen y
de biodiversidad de este género. Los fructanos de agave son muy importantes para la
agroindustria mexicana, específicamente en la producción de tequila, que hoy en día es una de
las bebidas alcohólicas más importantes del mundo [4]. La familia de enzimas que hidrolizan
los fructanos de agave, denominadas β-fructofuranosidasas (EC 3.2.1.26), son capaces de
hidrolizar moléculas complejas como la inulina en fructosa prácticamente pura, la cual es
ampliamente usada en la industria de alimentos como edulcorante dietético con un poder de
dulzor de 1.5 a 2 veces la sacarosa [5]. De ahí el interés por su estudio para producirla, purificarla
y caracterizarla a partir de cultivos microbianos en medios sintéticos, siendo Kluyveromyces
marxianus una excelente productora de β-fructofuranosidasas y una de las levaduras más
estudiadas [6].
17
2. ANTECEDENTES
2.1. Levaduras
Las levaduras han beneficiado a la humanidad por milenios. Tienen una gran importancia
industrial en áreas científicas, alimentarias, médicas, agrícolas, medio ambiente, entre otras. Han
sido usadas ampliamente en la biotecnología tradicional y moderna para la producción de
alimentos, bebidas, enzimas, productos químicos finos y reactivos farmacéuticos. Las levaduras
se encuentran a la vanguardia de la investigación en genética moderna, biología molecular y
biología celular [7].
Las levaduras son los mayores generadores de productos biotecnológicos a nivel mundial,
excediendo en producción, capacidad e ingresos económicos a cualquier otro microorganismo
industrial. Un claro ejemplo lo encontramos en la levadura Saccharomyces cerevisiae y especies
afines, que son las principales levaduras empleadas en fermentaciones alimenticias (pan,
cerveza, vino) y otros procesos industriales (producción de metabolitos); además, es el modelo
más importante para organismos eucariontes que se utiliza en investigación científica [8].
Últimamente, la levadura Kluyveromyces marxianus ha cobrado importancia debido a su
potencial impacto en la industria biotecnológica [9].
2.1.1. Generalidades de las levaduras
Una levadura se puede considerar como "hongos, basidiomicetos o ascomicetos, cuya fase
vegetativa es unicelular, que se multiplican por gemación o fisión, que pueden o no formar
esporas durante una etapa sexual y que no han sido nombrados como algún tipo específico de
hongo" [10].
Saccharomyces cerevisiae es la especie de levadura más explotada comercialmente, y pertenece

al reino de los hongos y a la subdivisión Ascomycotina. Otras levaduras se clasifican bajo el
género Basidiomycotina (i.e., Cryptococcus spp. y Rhodotorula spp.) y Deuteromycotina (por
ejemplo, Candida spp. y Brettanomyces spp.). Sin embargo, existen alrededor de 100 géneros
de levadura reconocidos [11].
Las células de levadura varían en tamaño entre 1-8 µm, resultando una de las más grandes
Saccharomyces cerevisiae, especialmente cuando se presenta una morfología hexaploide. Bajo
18
el microscopio óptico, la mayoría de estas células presentan algunas de las siguientes formas:
redondeadas, elipsoidales y alargadas con formas cilíndricas. Trigonopsis variabilis es una
excepción, puesto que sus células tienen estructura triangular, brotando en las esquinas, que se
presenta bajo ciertas condiciones nutricionales [11].
Saccharomyces cerevisiae es la levadura más estudiada y utilizada a nivel laboratorio e

industrial. Sin embargo, el avance de la tecnología y en específico uso de herramientas
moleculares modernas han permitido identificar, comprender y mejorar algunas de las llamadas
levaduras no-Saccharomyces, también llamadas no convencionales. Una levadura de especial
interés es Kluyveromyces marxianus [7].
2.2. Kluyveromyces marxianus
Kluyveromyces marxianus es una levadura homotálica (que se autofertiliza) y pertenece a la

clase hemiascomycetes. Esta filogenéticamente relacionada con la levadura Saccharomyces
cerevisiae [12], [13].
2.2.1. Generalidades de la Kluyveromyces marxianus
La figura 2.1 muestra la filogenia de K. marxianus dentro del género Kluyveromyces y el orden
Saccharomycetales. Se incluyen las seis especies de Kluyveromyces y otras especies de interés
industrial [9]. Desde 1994 K. marxianus ha sido clasificada como "generalmente considerada
como segura" (GRAS) por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en EE. UU.,
y desde 2005 ha sido catalogada como un microorganismo con "presunción de seguridad
calificada" (QPS) por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) [14]. De tal
manera que existen pocas restricciones en su uso en bioprocesos, incrementando en gran medida
su potencial para la producción de metabolitos de interés industrial [15].
19
Figura 2.1. Filogenia de la levadura Kluyveromyces marxianus.
a) b)
Figura 2.2 Levadura Kluyveromyces marxianus SLP1, a) en cultivo en medio líquido y b) en cultivo en
medio sólido YPD.
2.2.2. Metabolismo de Kluyveromyces marxianus
Las cepas pertenecientes a la especie de levadura Kluyveromyces marxianus han sido aisladas
de una gran variedad de hábitats, por lo que exhiben una alta diversidad metabólica y un grado
sustancial de polimorfismo intraespecífico [15]. Al considerar el metabolismo, es importante
20
destacar que K. marxianus tiene una de las tasas más rápidas de crecimiento de cualquier otro
microorganismo eucariota [7].
Aunque los componentes centrales de la glucólisis y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos están
conservadas entre especies de levaduras, la regulación los mismos difiere considerablemente
[16]. K. marxianus es una levadura aeróbica y su capacidad para generar energía mediante la
respiración mixta y la fermentación se describe como metabolismo respiro-fermentativo, siendo
más eficiente en S. cerevisiae [17]. Varios procesos regulatorios contribuyen a la eficiente
capacidad de fermentación de S. cerevisiae, especialmente el efecto “Crabtree", que parece ser
en gran parte debido a la represión de catabolitos de carbono (glucosa) de genes que codifican
enzimas respiratorias, y el débil efecto “Pasteur", que corresponde a la inhibición del
metabolismo fermentativo por oxígeno [18]. K. marxianus tradicionalmente se clasifica como
una levadura "Crabtree negativa", implicando una incapacidad para fermentar efectivamente los
azúcares al etanol. Sin embargo, diversos reportes publicados sobre K. marxianus en la
producción de etanol sugieren una clasificación imprecisa. Estudios recientes han procurado
avanzar en la comprensión del metabolismo respiro-fermentativo de levaduras hemiascomicetas
[19]–[22].
Una de las características más notables de esta especie es su capacidad de consumir lactosa como
fuente de carbono, que es un rasgo ausente en S. cerevisiae. La utilización de lactosa ha sido
ampliamente estudiada en K. lactis y se asume que los aspectos fundamentales se conservan en
K. marxianus [23], [24]. La capacidad para utilizar lactosa es conferida por dos genes, LAC12,
que codifica una permeasa de lactosa que es requerida para la absorción de lactosa en la célula,
y LAC4, que codifica a una ß-galactosidasa que hidroliza la lactosa a monómeros de glucosa y
galactosa. Al igual que en S. cerevisiae, la galactosa se metaboliza a glucosa-6-P a través de la
vía de Leloir [25].
2.2.3. Crecimiento y termotolerancia de Kluyveromyces marxianus
Un aspecto importante en la fisiología de K. marxianus es el hecho de que se han reportado

parámetros de crecimiento significativamente diferentes, tales como la velocidad específica de
crecimiento y el coeficiente de rendimiento biomasa/sustrato, no sólo para diferentes cepas
dentro de la especie sino también para la misma cepa cuando se investiga en diferentes
21
laboratorios [26]; es decir, dependerá de la cepa con la que se trabaje. En la tabla 2.1 se muestran
algunos de los parámetros cinéticos reportados para algunas cepas de Kluyveromyces.
K. marxianus posee características deseables para aplicaciones biotecnológicas como son:

capacidad de asimilar sustratos como lactosa y la inulina que no todas las levaduras pueden
metabolizar; además de presentar altas tasas de crecimiento, termotolerancia, y una gran
capacidad secretora de metabolitos [15]. Se ha reportado que K. marxianus produce alcohol a
temperaturas superiores a 40 °C, inclusive a 52 °C [29].
Tabla 2.1. Parámetros de crecimiento de algunas cepas de Kluyveromyces.

Levadura Modo de cultivo µ, h-1 Yx/s qO2, mmol/g-h Ref.
Lote 0.56 0.51 11.05 [26]
K. marxianus Continuo 0.1 0.45 2.67 [26]
ATCC 26548 Continuo 0.25 0.48 6.65 [26]
Continuo 0.5 0.48 11.09 [26]
Lote 0.44 0.49 --- [30]
K. marxianus
Continuo 0.1 0.43 --- [31]
CBS 6556
Continuo 0.2 0.48 --- [32]
Continuo 0.1 0.48 3.7 [33]
K. lactis
Continuo 0.2 0.49 6.2 [33]
CBS 2359
Continuo 0.4 0.49 11.3 [33]
2.2.4. Aplicaciones biotecnológicas de Kluyveromyces marxianus
El número de especies de levaduras descritas aumenta cada año, actualmente se reportan más de
700 especies diferentes pertenecientes a 100 géneros. A pesar de este inmenso espectro, las
aplicaciones industriales o biotecnológicas todavía se limitan a un número pequeño de especies,
pertenecientes principalmente a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia
y Yarrowia [34]. De estos géneros, destaca Saccharomyces cerevisiae, debido entre otras cosas,
a su alta capacidad de convertir azúcares en etanol, tanto en condiciones anaeróbicas como
aeróbicas [26]. No obstante, hay otras levaduras no-Saccharomyces en cuanto a la producción
de metabolitos de interés biotecnológico y que pudieran ser una alternativa a S. cerevisiae.
22
Dentro de las levaduras no-Saccharomyces destaca K. marxianus. Esta levadura presenta una
amplia diversidad metabólica en la que se han reportado una extensa cantidad de investigaciones
donde se han explorado aplicaciones como: producción de enzimas (β-galactosidasa [35]–[38],
poligalacturonasas [39], inulinasa [40]–[43], entre otras), proteína unicelular [44], [45],
producción de componentes aromáticos [46], [47] y etanol (al presentar termotolerancia, puede
realizar procesos de sacarificación y fermentación simultánea) [15]; reducción del contenido de
lactosa en productos alimenticios; producción de bioingredientes a partir de suero de leche;
biorremedición [48], [49]; como un agente anticolesterolémico [50]; y como hospedero para la
producción de proteínas recombinantes [51]. Se han estudiado algunos cultivos de cepas de K.
marxianus donde se han identificado beneficios adicionales al perfil organoléptico del agave
fermentado, como una mayor variedad de compuestos volátiles, probablemente debido a la
producción de ésteres de acetato afrutados [52]–[54].
2.3. β-fructofuranosidasas
Las β-fructofuranosidasas, también conocidas como fructosidasas o simplemente fructanasas,

pertenecen a la familia 32 de las glicosilhidrolasas. Las fructanasas son las enzimas responsables
de hidrolizar enlaces β-2-1 o β-2-6 de los fructanos para liberar fructosa [55], pudiendo ser
usados para la obtención de fructooligosacáridos (FOS) o néctares de fructosa [56].
Dentro del grupo de las β-fructofuranosidasas, podemos encontrar a las que hidrolizan fructanos
desde su extremo reductor β-2-1 o β-2-6; algunos ejemplos de este tipo son, las exo-β-
fructosidasas (exoinulinasas y exolevanasas) y β-2-6-fructano-6-levanobiohidrolasas. Estas
enzimas también incluyen a las endoinulinasas, las cuales hidrolizan específicamente los enlaces
internos β-2-1 de la inulina. Finalmente las endolevansas que hidrolizan específicamente los
enlaces β-2-6 en el levano [25]. Se ha reportado de manera indistinta las β-fructofuranosidasas
y las inulinasas, siendo que las segundas son un tipo específico de las primeras.
Los fructanos son oligómeros o polímeros con residuos β-fructofuranosil, comúnmente solubles
en agua y sintetizados a partir de la acumulación de sacarosa en la vacuola [57]. Los fructanos
de origen distintos pueden diferir en el grado de polimerización (DP), la presencia de ramas, el
tipo de enlace entre unidades de fructosa adyacentes, y la posición del residuo de glucosa (figura
2.3). Los fructanos tienen varias aplicaciones potenciales en la industria de productos
alimenticios y no alimenticios, tales como prebióticos [58].
23
Figura 2.3. Estructura general de los fructanos.
Las β-fructofuranosidasas pueden ser obtenidas a partir de especies vegetales y de algunos

microorganismos. Por esta razón en los últimos años se han realizado esfuerzos por encontrar u
obtener la mejor fuente microbiana. Muchas cepas de hongos, levaduras y bacterias son capaces
de producir β-fructofuranosidasas y varios de ellos han sido cultivados con éxito para la
producción de estas enzimas y su posterior extracción, concentración y purificación. Una de las
β-fructofuranosidasas más estudiadas es la inulinasa, para cuya producción los microorganismos
que comúnmente se emplean son las cepas de mohos como el Aspergillus sp. y cepas de levadura
como Kluyveromyces sp.; donde las cepas de levadura has resultado mejores productoras de
inulinasa que las cepas de hongos y bacterias [59].
2.4. Producción de β-fructofuranosidasas en Kluyveromyces marxianus
En los últimos años las cepas de Kluyveromyces marxianus han ganado un notable interés a nivel
laboratorio e industrial, por lo que están siendo más estudiadas. Un metabolito con gran
potencial son las fructanasas, que pueden ser obtenidas a partir de esta levadura.
En un estudio realizado por Arrizon y col. [60], se observó que las cepas K. marxianus aisladas
de la microbiota del mezcal en Oaxaca presentaron actividad β-fructofuranosidasa con sacarosa,
fructanos de agave e inulina como inductores. Se observó que para el caso de la inulina la
inducción fue mayor con respecto a los otros sustratos. La tabla 2.2 muestra un listado de los
principales trabajos que reportan actividad fructanasa para algunas cepas de K. marxianus, así
24
como el sistema de cultivo que se empleó en cada estudio. A continuación, se describirán los
principales sistemas de cultivo que se utilizan para la producción de metabolitos.
Tabla 2.2. Lista resumen de cepas de K. marxianus productoras de fructanasa/inulinasa.

Tipo de Actividad
Microorganismo Referencia
cultivo fructanasa, U/ml
Kluyveromyces sp. Y-85 Lote 59.5 [61]
K. marxianus Lote 43.7 [62]
K. marxianus ATCC 36907 Lote 260 [62]
K. marxianus ATCC 52466 Lote 0.418 [62]
K. marxianus CDBB-L-278 Lote 82 [63]
K. marxianus var. marxianus CBS 6556 Lote 3,000 [62]
K. marxianus UCD(FST) 55-82 Lote 212 [62]
K. marxianus var.bulgaricus Continuo 107 [64]
K. marxianus ATCC 16045 Lote 121 [65]
K. marxianus var.bulgaricus Lote 4.1 [66]
K. marxianus (A1 y A2) Lote 32 [67]
K. marxianus NRRL Y-7571 Sólido 391.9 U/g [68]
K. marxianus NRRL Y-7571 Lote 8.87 U/g-h [68]
Kluyveromyces S120 Sólido 409.8 U/g [69]
K. marxianus YS-1 Lote 24.5 [70]
K. marxianus YS-1 Lote 50.2 [71]
K. marxianus NRRL Y-7571 Sólido 463 U/g [72]
K. marxianus Lote 4.02 [73]
2.5. Sistemas de cultivo
Un biorreactor es un equipo donde se mantienen las condiciones de operación necesarias para

la reproducción, gemación o crecimiento de microorganismos; las condiciones pueden ser
agitación, suministro de oxígeno y nutrientes, control del pH y temperatura, etc. Por otra parte,
un sistema o método de cultivo hace referencia al modo de operar el biorreactor, que puede ser
de forma continua o discontinua [74].
25
Para un componente cualquiera del cultivo, incluida la biomasa, se puede plantear el siguiente
balance de materia en el biorreactor:
Velocidad Velocidad Velocidad Velocidad Velocidad

= ― + ―
de acumulación de entrada de salida de formación de consumo
𝑑(𝑉𝐶𝑖 ) (Ec. 1)
= 𝐹𝑒 𝐶𝑒𝑖 − 𝐹𝑠 𝐶𝑠𝑖 + 𝑉𝑟𝑓𝑖 − 𝑉𝑟𝑐𝑖
𝑑𝑡
Donde Ci es la concentración del componente i en el reactor y del caudal de salida, V es el

volumen del cultivo, Fe es el caudal de alimentación, Fs es el caudal de salida, Csi en la
concentración del componente i en la alimentación, rfi es la velocidad de formación del
componente i y rci es la velocidad de consumo del componente i.
Por otra parte, el volumen de cultivo variará en el tiempo de acuerdo a Fe y Fs.
𝑑𝑉
= 𝐹𝑒 − 𝐹𝑠 (Ec. 2)
𝑑𝑡
Dependiendo de la configuración de Fe y Fs, se pueden proponer tres sistemas de cultivo: en

lote, en lote alimentado y en continuo. Se describe a continuación el primero.
2.5.1. Sistemas de cultivo en lote (batch)
En un cultivo en lote, todos los nutrientes y el inóculo se agregan en el biorreactor desde un

inicio, y no existe suministro o retirada de masa durante la cinética. En otras palabras, no se
presenta alimentación (afluente), ni corriente de cosecha (efluente).
Durante el crecimiento microbiano se pueden observar hasta siete fases: (A) latencia, donde el
crecimiento es nulo; (B) aceleración, la velocidad de crecimiento se incrementa; (C)
exponencial, la velocidad de crecimiento es constante; (D) retardación, la velocidad de
crecimiento decrece; (E) estacionaria, la velocidad de crecimiento y de muerte se igualan; y (F)
muerte, la velocidad de crecimiento es nula [75] (Figura 2.4). Es posible que exista acumulación
de inhibidores durante la fermentación.
26
Figura 2.4. Fases de crecimiento microbiano.
Las ecuaciones diferenciales que gobiernan los cultivos en lote son:
𝑑𝑋
= 𝜇𝑋 (Ec. 3)
𝑑𝑡
𝑑𝑆 𝜇𝑋
= (Ec. 4)
𝑑𝑡 𝑌𝑋/𝑆
𝑑𝑃 (Ec. 5)
= 𝑟𝑃
𝑑𝑡
Donde X es concentración de biomasa, S es concentración de sustrato, P es concentración de

producto, t es tiempo, µ es la velocidad específica de crecimiento, Yx/s es coeficiente de
rendimiento biomasa/sustrato y rp es la velocidad de generación de producto.
Entre las desventajas que presentan los cultivos en lote para la producción de metabolitos de
interés incluida la biomasa, se encuentran: alta dependencia de las condiciones iniciales, posible
inhibición del crecimiento debido a la acumulación de toxinas, y tiempos muertos entre corridas,
entre otros.
27
2.5.2. Sistemas de cultivo en lote alimentado (fed-batch)
En este sistema, un cultivo en lote se alimenta continuamente con medio nutritivo fresco o con
alguno de sus componentes. No se presenta flujo de salida, por lo que el volumen de cultivo se
incrementa en el tiempo. Si el nutriente que se alimenta en un cultivo es el limitante del
crecimiento, entonces el lote alimentado es el sistema adecuado para controlar la velocidad de
crecimiento () del microorganismo. El cultivo en lote alimentado es particularmente útil en
procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de productos son sensibles a la
concentración del sustrato limitante; es decir, cuando el rendimiento celular o la productividad
de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se
quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración
de biomasa [76].
La ecuación diferencial que describe el cambio de biomasa con respecto al tiempo está dada por:
𝑑(𝑋𝑉) (Ec. 6)
= 𝜇𝑋𝑉
𝑑𝑡
Integrando la ecuación 6, tenemos:
𝑋𝑉 = 𝑋𝑜 𝑉𝑜 + 𝑌𝑋/𝑆 𝑆𝑅 (Ec. 7)
𝑋𝑜 𝑉𝑜 𝑌𝑋/𝑆 𝐹𝑆𝑅 (Ec. 8)

𝑋= +
𝐹𝑡 + 𝑉𝑜 𝐹𝑡 + 𝑉𝑜
𝐹𝑆𝑅 𝑌𝑋/𝑆
𝜇= (Ec. 9)
𝑋𝑜 𝑉𝑜 + 𝐹𝑆𝑅 𝑌𝑋/𝑆 𝑡
Donde Xo y Vo es la concentración de biomasa y el volumen del cultivo al iniciar el lote

alimentado, SR es la concentración de sustrato en la alimentación, F es el flujo de alimentación.
La ecuación diferencial para el sustrato es:
𝑑(𝑆𝑉) 𝜇𝑋𝑉
= 𝐹𝑆𝑅 − (Ec. 10)
𝑑𝑡 𝑌𝑋/𝑆
Resolviendo para la alimentación, queda:
𝜇𝑋𝑉
𝐹𝑆𝑅 = 𝑌 (Ec. 11)
𝑋/𝑆
28
De donde se deduce que la velocidad de crecimiento está limitada por la velocidad de
alimentación. En la figura 2.5 se observa que un lote alimentado inicia al finalizar un cultivo en
lote [76].
S0'
X.V = X0.V0 + F.SR.YX/S.t
X0.V0 µ < µmax
X.V
µ = µmax
X0'.V0' S0 = 0
BATCH t = t0 BATCH ALIMENTADO t
Figura 2.5. Comportamiento de la biomasa en un cultivo en lote alimentado.
Este tipo de cultivo requiere del conocimiento previo de parámetros cinéticos del
microorganismo, tal como la velocidad especifica de crecimiento máxima. Algunas de las
limitaciones del sistema en lote alimentado es que el cultivo se ve restringido al volumen total
de trabajo del biorreactor; además, requiere de mayor equipamiento que el cultivo en lote, tal
como el sistema de alimentación.
2.5.2.1. Coeficiente de mantenimiento celular
Los microorganismos requieren energía para mantener ciertas funciones específicas, tales como
recambio de material celular, trabajo osmótico, movilidad, entre otros. Es decir, que aun cuando
el crecimiento celular sea nulo (µ = 0) puede observarse cierto consumo de fuente de carbono y
energía. El coeficiente de mantenimiento celular (ms) indica la cantidad de sustrato por unidad
de biomasa por unidad de tiempo (gsustrato/gbiomasa-h) que se requiere para tales funciones. El valor
de ms puede variar en un amplio intervalo (0.01 – 0.1 g/g.h); depende de la temperatura, la
presión osmótica y la fuerza iónica [77].
29
ms = 0
ms > 0
X.V
X0.V0
t0 t
Figura 2.6. Coeficiente de mantenimiento a alta concentración de biomasa.
La figura 2.6 muestra la biomasa total dada, el coeficiente de mantenimiento celular posee un
valor diferente de cero. La ecuación para el cálculo del coeficiente de mantenimiento celular
cuando la biomasa se mantiene constante es [76]:
𝐹𝑆𝑅 (Ec. 12)

𝑚𝑠 =
𝑋𝑉
2.5.3. Sistemas de cultivo en estado continuo
En un cultivo en estado continuo, una o más corrientes de alimentación que contienen los
nutrientes necesarios se alimentan continuamente al biorreactor, mientras que la corriente de
efluente que contiene los productos de células y metabolitos producidos se retiran del cultivo de
manera continua. El estado estacionario se logra al mantener un caudal volumétrico igual tanto
para las corrientes de alimentación y recuperación. De este modo el volumen del cultivo, las
concentraciones de nutrientes y metabolitos permanecen en valores estables y, por lo tanto,
constantes. Con excepción de la producción de proteína unicelular, la producción de cerveza y
los procesos de tratamiento de residuos municipales, los cultivos en continuo no han sido
ampliamente adoptados por la industria biotecnológica, principalmente debido a la dificultad de
mantener la esterilidad y la protección contra los ataques de fagos o mutaciones; además, a
menudo las operaciones en estado estacionario dan resultados desfavorables comparados con
otras operaciones dinámicas como el lote y lote alimentado [76]. Sin embargo, la gran ventaja
30
del cultivo continuo es mantener la producción de un metabolito en un estado estacionario por
un prolongado periodo de tiempo.
Por definición, los sistemas de cultivo en estado estacionario no tienen variaciones con respecto
al tiempo, su representación matemática es:
𝐹 (Ec. 13)
𝜇=𝐷=
𝑉
𝐾𝑠 𝐷
𝑆= (Ec. 14)
𝜇𝑚𝑎𝑥 − 𝐷
𝐷𝑌𝑋/𝑆 (𝑆𝑜 − 𝑆)
𝑋= (Ec. 15)
𝐷 + 𝑚𝑠 𝑌𝑋/𝑆
Siendo D la tasa de dilución, S es la concentración de sustrato en el cultivo y Ks es la constante

de Monod específica para cada sustrato. El resto de los parámetros han sido definidos con
anterioridad en este documento.
Figura 2.7. Concentración de biomasa y sustrato limitante en estado estacionario a distintos valores de
D [74]. Parámetros: µmax = 1 h-1, YX/S = 0.5, Ks = 0.05 g/l, So = 5 g/l.
31
La Figura 2.7 muestra como varían la concentración de sustrato en estado estacionario en
función de la velocidad de dilución. Se puede observar que el efecto del mantenimiento celular
se hace notable a bajas velocidades de dilución. Además, puede apreciarse que existe un valor
de D por encima del cual la biomasa es cero; a esto se le conoce como lavado del cultivo y se
da cuando D > µmax, debido a que la velocidad de salida de las células del biorreactor será mayor
que la de crecimiento [74].
a) b) c)
Figura 2.8. Sistemas de cultivo: a) en lote, b) en lote alimentado y c) en estado continuo.
La figura 2.8 muestra un esquema de los sistemas de cultivo en lote, lote alimentado y en estado
continuo.
2.6. Monitoreo de bioprocesos
Los procesos biotecnológicos producen una gran variedad de bioproductos. La instrumentación

convencional existente utilizada en bioprocesos está enfocada a medir parámetros
fisicoquímicos como pH, temperatura, pdO2, etc. Sin embargo, el avance de la tecnología ha
permitido el desarrollo de nuevos sensores específicos para determinar en línea variables de
mayor interés i.e. biomasa o productos de la fermentación [78].
32
Existen una serie de criterios que un dispositivo de medición debe satisfacer para que sean
confiables como sistemas de sensado en bioprocesos, entre los que podemos mencionar
frecuencia de medición y costo, facilidad de validación e implementación, facilidad de uso y
mantenimiento, limpieza y esterilidad, fiabilidad, precisión y reproducibilidad, linealidad,
sensibilidad y especificidad, y tiempo de respuesta [2].
El monitoreo de bioprocesos puedes ser clasificado de 3 maneras de acuerdo a la localización

del sistema analítico en relación con el biorreactor: fuera de línea (off-line), en la línea (at-line
y on-line) y en línea (in-line). En las mediciones fuera de línea, el muestreo del biorreactor y el
análisis se realiza de manera manual, efectuando la lectura en un equipo externo; por lo cual la
muestra tendrá un desfase de tiempo respecto al bioproceso. En las mediciones en la línea, el
muestreo es automático pero la muestra es analizada fuera del biorreactor (at-line) por ejemplo,
en un sistema de análisis de inyección secuencial, o cuando existe una sonda de muestreo por
donde la muestra es canalizada, analizada y regresada al biorreactor (on-line). Finalmente, en el
monitoreo en línea la medición se realiza in situ mediante un sensor inmerso en el cultivo
(invasivo) o separado del biorreactor por una barrera de vidrio (no invasivo) [78]. Entre los
parámetros comúnmente medidos en línea se encuentran: pH, temperatura, presión, viscosidad,
potencial redox, conductividad, osmolaridad, oxígeno disuelto, dióxido de carbono, peso y nivel
de líquido, flujo de fluidos y densidad óptica [79].
Durante los últimos años han surgido nuevos sistemas de monitoreo que podrían ser
considerados no convencionales, entre los que se encuentran: espectroscopia dieléctrica, sistema
de análisis y conteo de células, y el sistema de análisis por inyección secuencial, entre otros.
2.6.1. Espectroscopia dieléctrica
La biomasa es un parámetro clave en cualquier cultivo microbiano de modo que su estimación

fiable en línea es de gran interés en los procesos biotecnológicos. En la literatura se han descrito
diferentes enfoques para la medición de la biomasa. Uno de ellos se basa en la medición de la
capacitancia y que posiblemente sea la mejor técnica in situ comparada con otras opciones [80].
La capacitancia, en este caso, es la capacidad que tiene la célula para acumular carga y ser capaz
de polarizarse por efecto de un campo eléctrico [81]; propiedad que puede ser detectada y
cuantificada mediante espectroscopia dieléctrica.
33
El equipo de espectroscopia dieléctrica consta de una sonda en línea que incorpora una serie de
electrodos con cuatro terminales. Dos terminales externas generan un campo eléctrico de
radiofrecuencia y otras dos terminales internas lo miden. El campo eléctrico promueve que los
iones suspendidos en el medio y el citoplasma de la levadura se muevan hacia uno de los
electrodos. Puesto que la membrana plasmática no es conductora, los iones no pueden moverse
libremente a través de ella, esto ocasiona una acumulación de carga que polariza las células [78].
Una célula no viable tiene la membrana dañada, y ya no puede considerarse un sistema cerrado;
por lo que los iones en su interior se encuentran esparcidos por el medio. Por lo tanto una célula
muerta al no poder polarizarse, no es detectada por el equipo (figura 2.9).
Células viables polarizadas
Células muertas
no polarizadas
Figura 2.9. Esquema de la medición de la viabilidad [25] y sonda de espectroscopia dieléctrica.
Se han realizado estudios comparando la biomasa detectada mediante espectroscopia dieléctrica

y otros medios tradicionales, como el conteo en cámara; donde se encontró una correlación de
hasta el 95% [82]. Por lo tanto, el monitoreo de crecimiento de microorganismos en línea por
este método resulta posible. Otra técnica que provee información interesante sobre los
microrganismos es el conteo automático de células descrito a continuación.
2.6.2. Sistema de análisis y conteo de células (CASY®)
El sistema de análisis y conteo de células CASY® (figura 2.10) utiliza las técnicas de exclusión
de corriente eléctrica y análisis de área de pulso, las células pueden ser analizadas y contadas de
34
manera eficiente y precisa. Esta tecnología puede aplicarse para el recuento de células, análisis
de cultivos celulares [83].
Cuando una célula se expone a un campo de baja tensión, la corriente eléctrica no puede
atravesar la membrana intacta, que es un aislante eléctrico, como resultado de la interrupción
eléctrica se genera un “conteo”; por lo que se puede extrapolar la concentración celular al medir
el número de conteos en un volumen determinado. Como el tamaño de la célula está relacionado
con su volumen, se puede producir un perfil del tamaño de la célula en la población en términos
de la resistencia eléctrica. Dado que las células se escanean a una alta frecuencia, se puede
producir un resultado preciso y una alta resolución. Las células vivas tienden a poseer mayor
volumen; por lo que, al pasar a través del flujo de corriente, puede generarse una caída del pulso
mayor, y luego amplificarse.
Figura 2.10. Sistema de análisis y conteo celular (CASY®)
2.6.3. Sistema de análisis por inyección secuencial (SIA)
Los analizadores bioquímicos han permitido desarrollar sistemas de muestro y análisis en línea
de metabolitos de interés en un biorreactor. Un ejemplo de esto ha sido el desarrollo (desde
principios de los años ochenta) de sistemas de análisis de inyección de flujo (FIA) y sistema de
análisis por inyección secuencial (SIA). Estas técnicas de manipulación de líquidos han
35
demostrado ser flexibles para la determinación de metabolitos de interés biotecnológico en un
biorreactor [2].
Un sistema FIA se basa en el monitoreo continuo de un proceso, teniendo como desventaja el

consumo excesivo de reactivos. Un sistema de análisis por inyección secuencial (SIA) permite
solventar algunas de las limitaciones de los sistemas FIA, como operar de manera discontinua
consumiendo menor cantidad de reactivos, generando menos residuos, presentando mayor
flexibilidad dado que puede ser reprogramada para determinar otros analitos, y requieren menos
instrumentación; además de proporcionar control sobre las variables viscosidad, flujo y
temperatura [84]. La figura 2.11 muestra la configuración general de un sistema de análisis de
inyección secuencial.
Figura 2.11. Esquema de un sistema de análisis por inyección secuencial [85].
Los analizadores SIA automáticos permiten ejecutar movimientos de pistón preprogramados,

sincronizados con las posiciones y movimientos de una válvula de selección multicanal. La
técnica secuencial de inyección de flujo está basada en la medida de volúmenes exactos de
solución acarreadora, de muestra y de reactivo, aspirados secuencialmente mediante una
microbureta a través de una válvula selectora y reservados en un tubo de acumulación. La
microbureta necesita controlarse de manera precisa para ejecutar movimientos de impulsión o
aspiración, paro u operación de forma reproducible [85].
36
Como parte de su formación, el Dr. Pliego diseñó, construyó y validó un prototipo basado en un
sistema de inyección secuencial para la determinación de actividad lipasa/esterasa (figura 2.12)
[85], [86]. El equipo resultó ser confiable, portátil y reconfigurable para la inserción de nuevas
metodologías para determinar otras enzimas de interés. Además, diseñó un algoritmo contenido
en una interfaz gráfica, con el cual se permitió controlar de forma eficaz el sistema de inyección
secuencial.
Figura 2.12. Sistema SIA desarrollado por el Dr. Pliego y usado en el presente proyecto de tesis.
2.7. Optimización estadística de bioprocesos, MSR.
La planificación estadística experimental, el diseño factorial y la metodología por superficie de

respuesta (MSR) son herramientas utilizadas para investigar las relaciones matemáticas entre
las variables de entrada y salida de un sistema. En su esquema básico, la MSR investiga los
factores de entrada definidos para un biosistema de conversión desde el cual se generan factores
o respuestas de salida definidos, tales como el rendimiento del producto y la productividad. Sin
embargo, la fortaleza de la MSR es que también da información sobre cómo las interacciones
entre los factores de entrada influyen en las respuestas de salida [87].
37
Cuando se desea realizar una optimización en un proceso biotecnológico, la MSR es una
poderosa herramienta que evita los sesgos experimentales y reduce el número de experimentos
requeridos [88]. En la optimización, la MSR es preferible a los métodos que perturban una
variable a la vez, ya que con estos pudieran desperdiciarse recursos al realizar un número
elevado de pruebas.
La MSR se define como la estrategia experimental y de análisis que permite encontrar las
condiciones de operación óptimas de un proceso, es decir, aquellas que dan como resultado
valores óptimos o cercanos al óptimo de una o varias características deseadas [89]. Esto se logra
mediante diseños de experimentos secuenciados que exploran el comportamiento de una
variable de respuesta en función de 2 o más factores (figura 2.13).
Figura 2.13. Visión gráfica de la metodología por superficie de respuesta [89].
La MSR puede ser aplicada en diferentes aspectos de los bioprocesos. Por ejemplo, en la
optimización de medio de cultivo, en las condiciones operacionales del proceso; así como de las
condiciones nutricionales del cultivo, entre otros [87].
38
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Kluyveromyces marxianus es una levadura no-Saccharomyces que en los últimos años ha
demostrado un importante potencial para su uso industrial, ya que es una excelente productora
de metabolitos de gran interés como lo son las β-fructofuranosidasas.
Para producir enzimas como las fructanasas a nivel comercial, es necesario obtener una
concentración celular y una actividad enzimática máxima de modo que sea rentable. Sin
embargo, la forma de medir la actividad enzimática y el crecimiento de la levadura consiste en
utilizar técnicas convencionales que se realizan fuera de línea como el monitoreo por DNS en
microplaca, densidad óptica, conteo celular, etc.; y debido a que el intervalo entre la toma de
muestra y la medición no es en tiempo real, es posible que los resultados obtenidos de la
medición ya no sean representativos de lo que sucedía en el biorreactor al momento del
muestreo. En este sentido es deseable desarrollar estrategias de monitoreo en línea que faciliten
la obtención de información del cultivo en tiempo real, permitiendo tomar decisiones de manera
inmediata de modo que se ajusten las condiciones operacionales y nutricionales en un cultivo
que favorezcan la máxima producción de las enzimas de interés.
Las investigaciones sobre la producción de β-fructofuranosidasas a partir de la levadura K.

marxianus en cultivos en continuo o lote alimentado a diversas condiciones son escasas. Por lo
que se desconocen los distintos estados fisiológicos de la levadura asociados a la actividad de
la enzima, limitando su implementación inmediata en la industria.
39
4. JUSTIFICACIÓN
En las últimas décadas, la biotecnología se ha posicionado como una de las industrias de
avanzada y su repercusión en todos los ámbitos socio-económicos es cada vez más significativo.
Actualmente la biotecnología requiere de procesos que sean eficientes, productivos y óptimos,
para lograr esto se requieren de sistemas de control eficaces que mantenga la calidad del
producto, incrementando el margen de ganancia y disminuyendo la contaminación ambiental.
El desarrollo de estrategias a partir de sistemas que monitoreen el estado de la levadura en

tiempo real proveerá información y conocimiento sobre los estados fisiológicos de mayor
producción de β-fructofuranosidasas. Además, al evaluar la producción de fructanasas en
cultivos poco explorados, como en continuo y lote alimentado, permitirá definir las condiciones
y tipo de cultivo que maximicen la producción de la enzima. En general, se logrará un mayor
entendimiento sobre la levadura, facilitando su adopción a nivel industrial.
El proyecto SPECTRE tiene como objetivo desarrollar estrategias para monitorear el estado
fisiológico de los microorganismos durante fermentaciones o cultivos celulares, por lo que el
presente trabajo se alinea con este proyecto y proponemos desarrollar estrategias de monitoreo
a partir de un sistema de análisis de inyección secuencial y espectroscopia dieléctrica en línea
para favorecer la producción de β-fructofuranosidasas utilizando la levadura Kluyveromyces
marxianus SLP1 y contribuir de manera íntegra al alcance del objetivo principal.
40
5. HIPÓTESIS
La evaluación de la actividad β-fructofuranosidasa en distintos sistemas de cultivo permitirá
determinar estrategias de monitoreo para favorecer la producción enzimática a partir de la
levadura Kluyveromyces marxianus SLP1 con base en un sistema de análisis de inyección
secuencial y espectroscopia dieléctrica.
41
6. OBJETIVOS
6.1. Objetivo principal
Desarrollar estrategias de monitoreo a partir de un sistema de análisis de inyección secuencial y

espectroscopia dieléctrica en línea para favorecer la producción de β-fructofuranosidasas
utilizando la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1.
6.2. Objetivos específicos
- Evaluar la cinética de crecimiento a través de espectroscopia dieléctrica y la producción

de β-fructofuranosidasas con diferentes fuentes de carbono en cultivos en lote de la
levadura Kluyveromyces marxianus SLP1.
- Determinar las condiciones de temperatura y velocidad específica de crecimiento que

maximicen la producción de β-fructofuranosidasas a partir de la levadura K. marxianus
SLP1 en cultivo en continuo.
- Evaluar la producción de β-fructofuranosidasas de la levadura Kluyveromyces

marxianus SLP1 en cultivos en lote alimentado.
- Desarrollar una metodología de monitoreo en línea para determinar la actividad β-

fructofuranosidasa mediante un sistema de análisis de inyección secuencial
42
7. METODOLOGÍA
A continuación, se presenta la metodología seguida durante el desarrollo del presente proyecto
de tesis.
7.1. Microorganismo
Para este trabajo se empleó la levadura nativa Kluyveromyces marxianus denominada SLP1,
perteneciente a la colección de microrganismos de la Unidad de Biotecnología Industrial del
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ).
La cepa fue aislada de un proceso de fermentación de mezcal en el estado de San Luis Potosí,
México.
7.2. Medios de cultivos
El medio YPD se empleó para la activación y propagación de la cepa en fase líquida, y para el
almacenamiento de las células activas en fase sólida*1. La composición del medio se describe
en la tabla 7.1. El pH fue ajustado a 5.5 previo a su esterilización a 121 °C durante 15 minutos.
Tabla 7.1. Composición del medio YPD
Compuesto Concentración [g/L]

Glucosa 20
Extracto de levadura 10
Bactopectona 20
Agar*1 20
Se utilizó glucosa marca Sigma®, extracto de levadura marca Fluka® analytical, bactopectona y
agar marca BD®. Los experimentos realizados para el cumplimiento de los objetivos de este
trabajo se realizaron con un medio químicamente definido (medio mineral). La composición del
medio se detalla en la tabla 7.2. Para el estudio del impacto de la fuerte de carbono en la
producción de fructanasas, se emplearon carbohidratos de distinta complejidad molecular
(glucosa, fructosa, sacarosa, inulina de achicoria y fructanos de agave)*2 a una concentración de
20 g/L en cada caso. Para el resto de los experimentos se empleó glucosa como fuente de
carbono, donde se varió la concentración en dependencia con el ensayo*3.
43
Tabla 7.2. Composición del medio químicamente definido
Fuente de carbono Concentración [g/L]
Glucosa*2 20*3
Sales principales Concentración [g/L]
KH2PO4 3.0
(NH4)2SO4 3.0
Na2HPO4 · 2H2O 1.5
Glutamato de Sodio 1.0
Oligoelementos Concentración [g/L]
MgCl2 · 6H20 0.4122
ZnCl2 0.0192
CaCl2 0.0174
FeCl2 · 4H2O 0.0117
MnCl2 · 4H2O 0.0044
CuCl2 · 2H2O 0.0006
CoCl2 · 6H2O 0.0005
(NH4)6Mo7O24 · 4H2O 0.0004
H3BO3 0.0030
Vitaminas Concentración [g/L]
Ácido 4-aminobenzoico 0.001
Mioinositol 0.125
Ácido nicotínico 0.005
Ácido pantoténico 0.005
Piridoxina 0.005
Tiamina HCl 0.005
Biotina 0.000012
Todos los compuestos son de la marca Sigma®. Las sales principales disueltas en el volumen de
trabajo de agua bidestilada fueron ajustadas a pH 4.5 y al igual que la fuente de carbono se
esterilizaron mediante calor húmedo a una temperatura de 121 °C durante 15 minutos. Los
oligoelementos y las vitaminas fueron esterilizadas en soluciones concentradas mediante
ultrafiltración a un tamaño de poro de 0.22 µm y de manera separada.
44
7.3. Banco de trabajo del microorganismo
Para mantener una reserva viable de la cepa Kluyveromyces marxianus SLP1, se procedió a
realizar un banco de trabajo bajo el siguiente procedimiento:
1. Un criovial mantenido a -80 °C con la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1

perteneciente a la colección de microrganismos de la Unidad de Biotecnología Industrial
de CIATEJ fue descongelado. Primeramente, mantenido a -20 °C y posteriormente a 4
°C, durante 24 horas en cada caso.
2. El criovial descongelado fue empleado para inocular dos matraces de 500 ml con 100
ml cada uno de medio YPD, obtenido de SIGMA®, el cual contenía 20 g/L de glucosa,
10 g/L de extracto de levadura y 20 g/L de bactopectona, ajustado a pH de 5.5.
3. Los matraces se colocaron en un orbital rotatorio New Brunswick® Innova 44 por 24
horas a 30 °C y una agitación de 250 rpm.
4. Se inocularon con 1 ml del cultivo anterior dos matraces de 500 ml con 100 ml cada uno
de medio YPD, y fueron incubados a las condiciones antes descritas durante 12 horas.
5. Finalmente, se colocó 1.5 ml de una mezcla 1:1 del cultivo anterior y glicerol estéril
(SIGMA-ALDRICH®) en crioviales CORNING® de 2 mL. Cada criovial contenía un
aproximado de 3 x 108 células. Los crioviales con la cepa fueron almacenados a una
temperatura de -80 °C en un ultracongelador Thermo Scientific® 88000 para su
conservación.
7.4. Activación de cepa
Para la activación de la cepa Kluyveromyces marxianus SLP1 se realizó mediante la siguiente

metodología:
1. Un criovial del banco de trabajo fue descongelado en dos pasos; primeramente,

mantenido a -20 °C y posteriormente a 4 °C, durante 24 horas en cada temperatura.
2. El criovial descongelado fue empleado para inocular dos matraces de 500 ml con 100
ml cada uno de medio YPD, obtenido de SIGMA ALDRICH ®, ajustado a pH de 5.5.
3. Los matraces se colocaron en un orbital rotatorio New Brunswick® Innova 44 por 24
horas a 30 °C y una agitación de 250 rpm.
45
4. Se realizó una dilución con agua estéril del cultivo anterior a fin de conseguir una
densidad de población de 100-300 cel/ml en el diluido.
5. Se inocularon mediante extensión en placa, dos cajas Petri con medio sólido YPD con
100 µl cada una del diluido anterior, y fueron incubadas a 30 °C durante 48 horas en una
incubadora Terlab® MA450.
Las cajas Petri se emplearon como reservorio de células activas como máximo durante dos
meses. Pasado ese tiempo se reactivaba otro criovial en caso de ser necesario.
7.5. Preparación del inóculo
Para la preparación del inóculo para los cultivos de los diferentes experimentos se realizó
mediante la siguiente metodología:
1. Se inocularon con 2 UFC dos matraces de 500 ml con 100 ml cada uno de medio YPD,
se colocaron en un orbital rotatorio New Brunswick® Innova 44 por 12 horas a 30 °C y
una agitación de 250 rpm.
2. Se inocularon con 1 ml del cultivo anterior dos matraces de 500 ml con 100 ml cada uno
de medio mineral, y fueron incubados a las condiciones antes descritas durante 10 horas.
Después de la incubación los matraces tienen una población aproximada de 4 x 108 cel/ml, con
los cuales se inocularon los biorreactores a una densidad de 2 x 107 cel/ml.
7.6. Preparación del biorreactor e instrumentación
Los experimentos se llevaron a cabo en un biorreactor marca Applikon® con una capacidad
máxima de 3 L equipado con sensores de oxígeno disuelto, pH, temperatura y permitividad
dieléctrica (FOGALE® nanotech). Antes de su uso, el biorreactor fue lavado con agua corriente,
enjuagado con agua bidestilada y después rociado con etanol al 70%, para finalmente dejarlo a
secar a temperatura ambiente. Antes de la esterilización, los sensores de pH, temperatura y 0%
de saturación de oxígeno fueron calibrados según el procedimiento para la bioconsola
Applikon® ADI 1030; la cual fue empleada para el control y/o monitoreo del pH, saturación de
oxígeno, temperatura y agitación.
Una vez seco el biorreactor, se vertió en el vaso un 90% del volumen de trabajo de una solución
de las sales principales del medio mineral ajustado a pH 4.5 (el volumen restante corresponde a
46
las soluciones de fuente de carbono, oligoelementos, vitaminas e inoculo vertidas posterior a la
esterilización). La tapa adaptada con los sensores, las propelas, los deflectores (bafles), sistema
de aireación (entrada y salida), sistema de toma de muestra, solución 1M NaOH para el control
de pH (debido a la naturaleza del cultivo que solo tiende a acidificar el medio, no se requirió del
empleo de soluciones ácidas) y conexión para la alimentación de medio fresco si el experimento
lo requiere (cultivo en lote alimentado y continuo). Toda la tubería empleada fue de silicón
MasterFlex® #16 y/o #14. Se procedió al armado del biorreactor tomando las medidas de
seguridad pertinentes, tales como el sellado de las líneas en contacto con el medio mediante
pinzas y un cierre no hermético para evitar sobrepresión en el sistema. Finalmente, se esterilizó
el biorreactor a 121 °C durante 15 minutos en una autoclave Yamato® SM510.
Después del ciclo de esterilización, el biorreactor fue sellado para asegurar un cierre hermético
y llevado al área de trabajo, donde se enfrió. Se realizaron las conexiones correspondientes de
los sensores, el sistema de agitación, el sistema de control de temperatura (constituido por un
recirculador Jalubo® F25 y una manta eléctrica Applikon®), adición de solución básica para el
control de pH y el sistema de aireación (constituida por un compresor para pecera o por el
servicio de aire comprimido del laboratorio de planta piloto, según el experimento).
Una vez conectado los sensores y servicios del biorreactor, se procedió a ajustar las condiciones
del experimento tales como temperatura, pH, agitación y aireación. Pasadas entre 12 – 24 horas
del ajuste de condiciones, se procedió a calibrar el 100% de la saturación de oxígeno. Finalmente
se vertió en el biorreactor, bajo flama, las soluciones estériles de la fuente de carbono,
oligoelementos y vitaminas empleando el acceso dedicado para la inoculación. Después de este
procedimiento el biorreactor se encontró en condiciones de ser inoculado.
7.7. Técnicas analíticas
7.7.1. Monitoreo de biomasa
7.7.1.1. Conteo celular en cámara de Neubauer
Esta técnica se utilizó para cuantificar mediante conteo directo el crecimiento de la población
celular. Una alícuota de una muestra tomada del reactor fue depositada en una cámara de
Neubauer Marienfeld®, posteriormente se observó en un microscopio Leica® CME con un
objetivo de 40x. Se realizó el conteo sobre 15 cuadros, filas 1, 3 y 5 (figura 7.1). Cuando el
47
conteo resultó alto (> 300), se realizó una dilución de la muestra. Cada conteo se realizó por
duplicado.
Para calcular la población celular en la muestra se empleó la siguiente fórmula:
∗ 106 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝑃𝑜𝑏𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 ( ) = 𝐶⁄15 ∗ 0.25 ∗ 𝐷
𝑚𝑙
Donde:
C = conteo de células en los 15 cuadros.
D = dilución empleada en la muestra.
1
2
3
4
5
Figura 7.1. Rejilla de conteo de la cámara de Neubauer y recuadros contados (gris).
7.7.1.2. Densidad óptica
El perfil de crecimiento se cuantificó mediante el cambio de la absorbancia de las muestras a

través del tiempo. La lectura se realizó a una longitud de onda de 600 nm sobre una muestra de
200 µl en un pozo de una microplaca. El equipo utilizado fue un espectrómetro de microplacas
xMark® de Bio-Rad®. Cuando la absorbancia fue mayor a 1, se diluyó la muestra. Cada lectura
se realizó por duplicado.
7.7.1.3. Peso seco
El perfil de generación de biomasa durante el cultivo se realizó mediante la técnica de peso seco.
De cada muestreo del reactor, el volumen no necesitado para los análisis (entre 5 y 10 ml) fue
medido y centrifugado a 4,000 rpm en una centrífuga Applikon® 5810R con un rotor A481
durante 15 minutos. El sobrenadante fue almacenado a -20 °C y la pastilla fue resuspendida en
48
5 ml de agua destilada. Se repitió el procedimiento de centrifugado, la pastilla fue resuspendida
en 5 ml de agua destilada y vertido dentro de un vaso de plástico desechable de 30 ml,
previamente etiquetado y puesto a peso constante. El tubo empleado para centrifugar la muestra
fue lavado con 5 ml de agua destilada y posteriormente el líquido vertido al vaso de la muestra;
esto se hizo con el objetivo de minimizar las pérdidas de biomasa.
El vaso con la muestra fue puesto en un horno Felisa® a 50 °C por 48 horas. Después el vaso se
colocó en un desecador durante 2 horas para ser enfriado sin ganar humedad. El vaso con la
muestra fue pesado en una balanza analítica AND® GR-200.
Para realizar el cálculo del peso seco en la muestra se empleó la siguiente fórmula:
𝑔 𝑃2 − 𝑃1
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑆𝑒𝑐𝑜 ( ⁄𝐿) = ( ) ∗ 1000
𝑉𝑚
Donde:
P2 = gramos del vaso y la muestra a peso constante.
P1 = gramos del vaso a peso constante.
Vm = mililitros de muestra empleada.
7.7.1.4. Sistema de análisis y conteo de células (CASY®)
El seguimiento de la cinética de crecimiento poblacional también se siguió mediante un equipo

contador de partículas de la marca Innovartis modelo CASY® TT. Después de conocer la
concentración de células en la muestra mediante el conteo en cámara de Neubauer, se realizó
una dilución de manera que hubiese un volumen de 10 ml a una concentración máxima de 106
células/ml en el buffer especial libre de partículas CASYton® y vertido en el recipiente especial
libre de partículas CASYcup®.
La muestra preparada fue colocada en el equipo para realizar las lecturas, las cuales consistieron
en tres mediciones donde se realiza el conteo de partículas en un volumen de 200 µl de manera
automática. El equipo arroja el promedio de los conteos de las tres lecturas; así como un
histograma con la distribución de tamaño de las partículas (células) contabilizadas.
49
7.7.1.5. Espectroscopia dieléctrica.
El perfil de crecimiento en tiempo real se llevó a cabo monitoreando la permitividad mediante

la sonda de espectroscopia dieléctrica FOGALE® nanotech, la cual estaba conectada a su
terminal EVO® Box y controlado por el software EVO® 400 para registrar los datos generados
por la sonda. Esta técnica también permitió determinar la viabilidad del cultivo en el biorreactor
durante la cinética.
7.7.2. Consumo de sustrato
El perfil de consumo de sustrato se siguió mediante la determinación de la concentración de los

azúcares reductores totales en las muestras extraídas del biorreactor. El método de
determinación que se usó fue mediante el ácido 3, 5 – dinitrosalicílico (DNS) desarrollado por
Miller y col [90]. El DNS se reduce en presencia del grupo reductor de sustrato (glucosa y/o
fructosa) formando ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, el cual tiene una coloración característica y
puede determinarse por espectrofotometría a 540 nm.
La tabla 7.3 muestra los compuestos y su concentración para la preparación del reactivo DNS.
Cada compuesto fue añadido en el orden señalado y después de que el anterior fue
completamente disuelto. Se evitó la exposición a la luz en todo momento.
Tabla 7.3. Compuestos del reactivo DNS.

Compuesto Concentración [g/L]
NaOH 10
Tartrato de Na y K 200
Meta-bisulfito de Na 0.5
Fenol 2
Ácido 3,5 -
10
dinitrosalicílico
Todos los compuestos fueron marca Sigma®, excepto el Meta-bisulfito de sodio marca J.T.
Baker®. El reactivo DNS preparado se almacenó a 4 °C y protegido de la exposición de la luz.
50
La metodología que se siguió para esta técnica fue la siguiente:
1. La muestra del reactor se centrifugó a 4,000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga
Applikon® 5810R con un rotor A481. El sobrenadante fue separado de la pastilla celular
por decantación. La pastilla fue procesada por la técnica de peso seco.
2. Se tomó una alícuota de 100 µl del sobrenadante y se colocó en un microtubo de 1.6 ml.
3. Se añadieron 100 µl del reactivo DNS y se homogenizó.
4. La mezcla fue colocada en un baño maría a 95 °C durante 5 minutos, para después ser
puesta en hielo durante 5 minutos para detener la reacción.
5. Se añadió 800 µl de agua destilada al microtubo y se homogenizó la mezcla.
6. En el pozo de una microplaca se colocó 200 µl de la mezcla anterior y fue leída a 540
nm en un espectrofotómetro de microplacas xMark® de Bio-Rad®.
La muestra fue analizada por triplicado y comparada contra una curva de calibración que se
construyó con concentraciones de glucosa de 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 g/L. En cada experimento
se construyó una nueva curva de calibración con un ajuste mayor a 0.98. En los casos que la
concentración de azúcares reductores de la muestra fue mayor que el de la curva, se diluyó la
muestra y se repitió el procedimiento.
7.7.3. Actividad β-fructofuranosidasa
El seguimiento de la producción de las enzimas de interés, β-fructofuranosidasas, se realizó

mediante la detección del producto de su actividad enzimática: un azúcar reductor. La
metodología para la determinación de la actividad fructanasa se describe a continuación:
1. Del sobrenadante (extracto enzimático) que se obtuvo de la centrifugación de la muestra

del reactor, 50 µl en un microtubo y se añadió 50 µl de sustrato (100 mM acetato de
sodio + 100 mM ácido acético + 1 g/L de sacarosa, pH 5.0). Se homogenizó la muestra.
El blanco solo contuvo 50 µl de sustrato. Si el extracto enzimático estaba almacenado a
-20 °C, fue puesto a 4 °C durante 24 horas previo a su análisis.
2. La mezcla se incubó a 50 °C durante 15 minutos en un incubador Thermo-Shaker® MS-
100.
51
3. Después de la incubación, se colocaron las muestras en hielo durante 2 minutos para
detener la reacción y se agregó 100 µl del reactivo DNS. Se homogenizó la mezcla.
4. Al blanco se agregó 50 µl de extracto enzimático.
5. La mezcla fue colocada en un baño maría a 95 °C durante 5 minutos, para después ser
puesta en hielo durante 5 minutos para detener la reacción.
6. Se añadió 800 µl de agua destilada al microtubo y se homogenizó.
7. En el pozo de una microplaca se colocó 200 µl de la mezcla anterior y fue leída a 540
nm en un espectrofotómetro de microplacas xMark® de Bio-Rad®.
La muestra fue analizada por triplicado y comparada contra una curva de calibración de azúcares
reductores. En cada experimento se construyó una nueva curva de calibración con un ajuste
mayor a 0.98.
Para el cálculo de las unidades de actividad enzimática en la muestra se empleó la siguiente

fórmula:
𝑈 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝐹 ∙ 𝑉𝑟𝑥
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 = = =
𝑚𝑙 𝑚𝑖𝑛 ∙ 𝑚𝑙 𝑀𝑤 ∙ 𝑡 ∙ 𝑉𝑒
Donde:
F = concentración de glucosa y/o fructosa liberada.
Vrx = volumen de reacción.
Mw = peso molecular de la glucosa.
t = tiempo de incubación.
Ve = volumen de extracto enzimático.
7.8. Cultivos en lote en biorreactor
Para evaluar el comportamiento y los parámetros cinéticos del crecimiento de la levadura

Kluyveromyces marxianus SLP1, así como estudiar la producción de las β-fructofuranosidasas
en dependencia de la fuente de carbono. Se lanzaron 5 cultivos en lote donde las fuentes de
carbono empleadas fueron: glucosa, fructosa, sacarosa, inulina y fructanos de agave (FA). En
cada caso la concentración inicial fue de 20 g/L. La selección de las fuentes se realizó con base
52
en la complejidad de la molécula; desde las más sencillas y comunes como la glucosa y fructosa,
hasta la más compleja como lo son la inulina y FA. Además, se considera que FA e inulina
pueden funcionar como un inductor para la producción de fructanasas [62], [91], [92]. Como
medio de cultivo se utilizó medio mineral. Las condiciones para el crecimiento se mantuvieron
constantes en pH 4.5, temperatura 30 °C, aireación 1 vvm (el aire fue suministrado por una
bomba para pecera y filtrado por una membrana de 0.22 µm para su esterilización) y agitación
500 rpm. Se siguió la cinética de crecimiento desde la inoculación hasta el comienzo de la fase
estacionaría, tomando una muestra de 10 ml del biorreactor cada hora. Los parámetros
monitoreados fueron pH, temperatura, oxígeno disuelto, permitividad y gases exhaustos
mediante sensores en línea; biomasa mediante conteo celular (microscopía y sistema CASY),
densidad óptica y peso seco; azúcares reductores y actividad fructanasa.
7.9. Cultivos en estado continuo en biorreactor
La determinación de los parámetros para favorecer la producción de las fructosidasas de interés,

se realizó mediante la ejecución de un diseño de experimentos tipo factorial 23 (tres factores con
2 niveles cada uno) con cuatro puntos al centro a fin de lograr los grados de libertad suficientes
para una adecuada validez estadística. Los factores que se variaron fueron: velocidad específica
de crecimiento (0.05 h-1 y 0.40 h-1, con 0.225 h-1 como punto al centro), la cual se controló
mediante la tasa de dilución del medio en el cultivo, que su vez fue controlado mediante el flujo
de alimentación (75 ml/h y 600 ml/h, con 337 ml/h como punto central; para un volumen de
trabajo de 1.5 L); la temperatura de crecimiento (26 °C y 34 °C, con 30 °C como punto al centro),
y la concentración de glucosa en el medio de alimentación (20 g/L y 60 g/L, con 40 g/L como
punto al centro). La tabla 7.4 muestra la combinación y orden de las condiciones probadas.
La cinética se inició con un cultivo en lote. Al agotarse la fuente de carbono se comenzó la

alimentación de medio de cultivo fresco. El muestreo se realizó por triplicado para cada
condición, el cual fue tomado después de haber alcanzado el estado estacionario, haberse
recambiado el volumen del reactor un mínimo de tres veces (3 tiempos de residencia) y no
haberse presentado ninguna perturbación que afectara el estado estacionario. El resto de
condiciones para el crecimiento se mantuvieron constantes en pH 4.5, aireación 1 vvm (el aire
fue suministrado por una bomba para pecera y filtrado por una membrana de 0.22 µm para su
esterilización) y agitación 500 rpm. Los parámetros monitoreados fueron pH, temperatura,
53
oxígeno disuelto, permitividad y gases exhaustos mediante sensores en línea; biomasa mediante
conteo celular (microscopía y sistema CASY), densidad óptica y peso seco; azúcares reductores
y actividad fructanasa.
Tabla 7.4. Combinación de factores para el diseño experimental 23.

Temperatura, Velocidad específica de Concentración de
Muestra
-1
°C crecimiento, h glucosa, g/L
T1 26 0.05 20
T2 34 0.05 20
T3 34 0.40 20
T4 26 0.40 20
T5 26 0.05 60
T6 26 0.40 60
T7 34 0.05 60
T8 34 0.40 60
T9 30 0.225 40
T10 30 0.225 40
T11 30 0.225 40
T12 30 0.225 40
Con el objetivo de verificar las condiciones de mayor producción de β-fructofuranosidasas de

interés arrojadas por el cultivo en estado continuo descrito anteriormente, se realizó otro cultivo
en lote alimentado donde se varió la temperatura de crecimiento (30, 34 y 38 °C) y la velocidad
específica de crecimiento (0.05 y 0.09 h-1), controlado mediante el flujo de alimentación (110
ml/h y 198 ml/h, respectivamente; para un volumen de trabajo de 2.2 L). La concentración de
glucosa en la alimentación se mantuvo constante. Cabe mencionar que se pretendía aplicar un
diseño tipo factorial 22 (dos factores con dos niveles) con puntos al centro, pero en un análisis
costo/beneficio se determinó truncar el diseño a sólo 4 condiciones La tabla 7.5 muestra la
combinación y orden las condiciones probadas.
La cinética se inició con un cultivo en lote. Al agotarse la fuente de carbono se comenzó la

alimentación de medio de cultivo fresco. El muestreo se realizó por triplicado y bajo la misma
descripción mencionada anteriormente. El resto de condiciones para el crecimiento se
54
mantuvieron constantes en pH 4.5, aireación 2 vvm (el aire fue suministrado por mediante el
sistema de aire comprimido del laboratorio y filtrado por una membrana de 0.22 µm para su
esterilización) y agitación 550 rpm. Los parámetros monitoreados fueron pH, temperatura,
oxígeno disuelto y permitividad; biomasa mediante conteo celular y peso seco; azúcares
reductores y actividad fructanasa en línea (ver sección 7.11) y fuera de línea.
Tabla 7.5. Condiciones de los experimentos aplicados en el segundo cultivo en continuo.

Temperatura, Velocidad específica de
Muestra
°C crecimiento, h-1
T1 34 0.05
T2 30 0.05
T3 38 0.05
T4 34 0.09
Para mantener el volumen del cultivo constante se empleó un sistema por diferencia de peso. El
sistema consistió en una balanza Torrey®, sobre el cual se encontraba el biorreactor y que fue
tarada al comienzo del cultivo en continuo, y dos bombas peristálticas MasterFlex® (una para la
alimentación y otra para extraer el volumen de cultivo excedente). Los tres elementos estaban
conectados a una computadora y controlados mediante un programa diseñado sobre la
plataforma del software LabView® v.11.0 de National Instruments. La velocidad del flujo de
alimentación de medio fresco al biorreactor se controló mediante una de las bombas,
manteniéndose constante dependiendo de la velocidad específica de crecimiento necesaria. Al
incrementarse el peso del biorreactor por encima de un valor fijado (2 gramos en los
experimentos), la segunda bomba se activaba para extraer el volumen excedente hasta reducir
el peso del biorreactor al valor fijado. Repitiéndose el ciclo nuevamente. Cabe aclarar que para
que esta estrategia de control fuera efectiva, la velocidad de salida siempre fue mayor que la
velocidad de flujo de entrada y durante todo el tiempo de los cultivos se tuvo la precaución de
no tener perturbaciones externas sobre el peso del biorreactor.
7.10. Cultivos en lote a temperatura óptima
Para evaluar el comportamiento del crecimiento de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1

a la temperatura óptima encontrada por el diseño experimental de los cultivos en continuo, así
55
como estudiar la producción de fructanasas durante la fase estacionaria, se lanzaron 2 cultivos
en lote con glucosa como fuente de carbono a 20 g/L. Como medio de cultivo se utilizó medio
mineral. Las condiciones para el crecimiento se mantuvieron constantes en pH (4.5),
temperatura (34 °C), aireación (1 vvm, el aire fue suministrado por una bomba para pecera y
filtrado por una membrana de 0.22 µm para su esterilización) y agitación (500 rpm). Se siguió
la cinética de crecimiento desde la inoculación hasta el comienzo de la fase estacionaría,
tomando una muestra de 10 ml del biorreactor cada hora. Durante la fase estacionaria, el
muestreo se realizó de manera más espaciada cada 6 ó 10 horas. El primer cultivo se mantuvo
durante 65 horas, el segundo cultivo hasta la hora 100. Los parámetros monitoreados fueron pH,
temperatura, oxígeno disuelto y permitividad (en el segundo cultivo no se pudo medir la biomasa
por permitividad debido a que no se encontraba disponible el sensor de espectroscopia
dieléctrica); biomasa mediante conteo celular (microscopía y sistema CASY), densidad óptica
y peso seco; azúcares reductores y actividad β-fructofuranosidasa.
Las muestras del segundo cultivo fueron procesadas mediante la metodología de detección de
actividad proteasa (anexo A) y actividad fructanasa; después las muestras de sobrenadante
fueron dializadas durante 36 horas a 4 °C en una solución tampón de 50 mM citrato de sodio
pH 4.5, con recambios de solución cada 12 horas y reanalizadas para actividad fructanasa. Esto
con el objetivo de determinar el efecto del sobrenadante sobre la técnica de actividad.
7.11. Cultivos en lote alimentado
Con el objetivo de estudiar la producción de β-fructofuranosidasas mediante la levadura

Kluyveromyces marxianus SLP1 en un ambiente limitado en fuente de carbono, y probar las
condiciones óptimas arrojadas por los biorreactores en estado continuo en un tipo diferente de
alimentación, se realizaron 2 cultivos en lote alimentado. El primer cultivo se hizo a una
temperatura de 34 °C, un volumen inicial de 1 litro, flujo constante de alimentación de ~70 ml/h
(fue el mínimo flujo permitido por la configuración de la bomba MasterFlex® en ese momento),
la concentración de la fuente de carbono en la alimentación fue de 100 g/L de glucosa, la
aireación fue constante durante la cinética a 1.6 L/min (el aire fue suministrado por un
compresor para pecera y filtrado por una membrana de 0.22 µm para su esterilización) y la
agitación fue variable en dependencia con la saturación de oxígeno disuelto (inicial 500 rpm,
final 800 rpm). El segundo cultivo se realizó a una temperatura de 34 °C, un volumen inicial de
56
1 litro, flujo constante de alimentación de ~17 ml/h (se modificó el cabezal de la bomba
MasterFlex® para reducir el flujo mínimo), la concentración de la fuente de carbono en la
alimentación fue de 100 g/L de glucosa, la aireación fue constante durante la cinética a 3.1 L/min
(el aire fue suministrado mediante el sistema de aire comprimido del laboratorio y filtrado por
una membrana de 0.22 µm para su esterilización) y la agitación fue constante a 800 rpm. Se
siguieron las cinéticas de crecimiento hasta el límite máximo del volumen del biorreactor que
las condiciones permitieron (~2.2 L) tomando una muestra (10 ml) cada 1.5 horas en el primer
cultivo y cada 4 horas en el segundo. Las cinéticas se iniciaron con un cultivo en lote. Al agotarse
la fuente de carbono se comenzó la alimentación de medio de cultivo fresco. Los parámetros
monitoreados fueron pH, temperatura, oxígeno disuelto, permitividad y gases exhaustos
mediante sensores en línea; biomasa mediante conteo celular (microscopía), densidad óptica y
peso seco; azúcares reductores y actividad fructanasa.
7.12. Monitoreo de actividad β-fructofuranosidasa en línea
Para el monitoreo de la actividad β-fructofuranosidasa en línea se desarrolló una metodología

en un sistema de análisis por inyección secuencial (SIA) cuyo diseño de software y hardware
fue desarrollado por Pliego y col dentro de su proyecto de doctorado [85]. De manera general,
el sistema SIA se conforma por una bomba peristáltica de microflujo para inyección/succión,
dos válvulas multiposición, una fuente emisora de luz de halógeno, un espectrofotómetro, una
bobina de calentamiento termostatizada, una cámara de resguardo y una cámara de mezclado.
El sistema fue controlado mediante un algoritmo diseñado en el software LabView ® v.11.0 de
National Instruments. El diseño original de hardware fue adaptado para agregar una cámara de
calentamiento y una de enfriamiento. La figura 7.2 muestra la configuración y descripción de
los componentes del sistema SIA que se empleó en la implementación de la metodología para
el monitoreo de la actividad fructanasa en línea.
La metodología desarrollada para la determinación de la actividad β-fructofuranosidasa en línea

consistió en adaptar la metodología descrita en la sección 7.7.3, por lo que para la validación de
la técnica desarrollada en el sistema SIA se comparó contra la metodología mencionada. Debido
a la naturaleza corrosiva del fenol, no se empleó en la preparación del reactivo DNS utilizado
en el sistema SIA.
57
Para la determinación de la actividad fructanasa, fue necesario realizar una serie de secuencias
ordenadas que se describen a continuación de forma breve:
1. Una muestra de sobrenadante (m) libre de células proveniente del biorreactor fue
bombeada hacia la cámara de retención del sistema SIA.
2. Se realizó una dilución automática con acarreador, agua (a), en función del tiempo del
cultivo y fue homogenizada en la cámara de mezclado.
3. La muestra diluida (md) fue mezclada a partes iguales con el sustrato (s) mediante ciclos
de succión md/s/md/s.
4. La mezcla fue inyectada a la cámara de incubación, donde se mantuvo a 50 ± 2 °C
durante 15 minutos.
5. La muestra incubada (mi) fue hacia la cámara de retención y mezclada con el reactivo
DNS (r) en ciclos de succión mi/r/mi/r.
6. La mezcla fue inyectada a la cámara de calentamiento, donde se mantuvo a 93 ± 2 °C
durante 5 minutos.
7. Después la mezcla fue inyectada a la cámara de enfriamiento donde se mantuvo en hielo
durante 1 minuto.
8. La mezcla anterior fue diluida en relación 1:4 con acarreador y homogenizada en la
cámara de mezclado.
9. Finalmente, la muestra fue inyectada al detector donde fue leída a 540 nm.
De cada lectura resultó una gráfica de amplitud contra tiempo. El área bajo la curva de la gráfica
es directamente proporcional con la actividad fructanasa. Para el cálculo del área bajo la curva,
los datos fueron exportados al software MatLab® R2014b y analizados con el comando trapz,
el cual devuelve la integral aproximada de una función a través del método trapezoidal. El área
calculada fue comparada con una curva de calibración realizada en el sistema SIA. Las unidades
de actividad β-fructofuranosidasa se calcularon con la ecuación mostrada en la sección 7.7.3.
Después de cada análisis se realizó un ciclo de limpieza para eliminar cualquier traza de la
muestra anterior. La muestra se obtuvo a través de una sonda de cerámica Applikon ® acoplada
al biorreactor, la cual permitió obtener un sobrenadante filtrado libre de células. En la figura 7.2
se esquematizan los puntos anteriores. En los resultados se profundizará en los detalles de la
metodología final.
58
9
3 Fuente
Detector
de luz
1
Sustrato
Sonda de
Acarreador muestreo
4
Cámara de
incubación
Desechos
Válvula Válvula
multiposición multiposición
Cámara de retención
Bomba
Reactivo
Cámara de 2
mezclado
8 5
6 Cámara de 7 Cámara de
calentamiento enfriamiento
Figura 7.2. Descripción del sistema de análisis de inyección secuencial (SIA).
Se desarrolló la metodología para una curva de calibración generada en el sistema SIA. La curva
se construyó con 5 puntos con concentraciones de glucosa de 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 g/L. Cada
concentración fue tratada con los puntos del 5 al 9 de la metodología antes descrita. Cada punto
se realizó por cuadriplicado y las áreas obtenidas fueron analizadas mediante el software
Statgraphics® Centurion XVI para la obtención de una línea de regresión para la concentración
de glucosa/fructosa liberada en función del área bajo la curva.
A continuación, se describen los resultados y discusión de los experimentos realizados en este

proyecto con la metodología descrita.
59
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En esta sección serán presentados los resultados de los experimentos efectuados para el
cumplimiento de los objetivos de este proyecto. Se presentan primero los resultados de la
producción de β-fructofuranosidasas en función de la fuente de carbono; así como correlaciones
de diversas técnicas de medición de la biomasa contra la permitividad. A continuación, se
describen los resultados de los reactores en continuo donde se verifican las condiciones de
máxima producción de fructanasas. Después, se detallará el perfil crecimiento y de actividad β-
fructofuranosidasa en reactores en lote alimentado. Finalmente se describirá el desarrollo de la
metodología para el monitoreo de la actividad β-fructofuranosidasa en línea durante un cultivo
en biorreactor.
8.1. Cultivos en lote en biorreactor y pruebas con diferentes fuentes de carbono
Se muestran a continuación los resultados de los 5 biorreactores con diferentes fuentes de

carbono. Para cada caso, se presentan las curvas de las distintas técnicas para el seguimiento de
la cinética de crecimiento, además de una tabla con la correlación lineal existente entre ellas a
un 95% de confianza; cuanto más próximo a 1, mayor será la correspondencia entre los métodos.
El valor en cada celda en la tabla indica la proporcionalidad entre el elemento de la columna y
el del renglón en el cual se encuentra. Las unidades en las tablas para cada parámetro son los
siguientes: permitividad, pF/cm; peso seco, g/l; DO, absorbancia; conteo en cámara (Neubauer)
y sistema CASY®, millones de células/ml; y actividad enzimática, U/ml, De manera separada,
se graficó la generación de biomasa por peso seco y permitividad contra la actividad enzimática
y el consumo de sustrato. Cabe recordar, que la permitividad es de especial importancia pues es
un método que permite el seguimiento del crecimiento del microrganismo cultivado in situ y en
tiempo real; por lo que una buena correlación con técnicas de monitoreo para diferentes
parámetros es deseable.
8.1.1. Cultivo en lote con glucosa como fuente de carbono
El primer cultivo en lote que se realizó se empleó glucosa a una concentración de 25 g/L. En la
figura 8.1 se muestran los resultados obtenidos de este experimento, se observó que, durante la
fase exponencial los métodos de conteo en cámara, densidad óptica y permitividad siguen el
mismo comportamiento; la curva de peso seco se desvío debido a variaciones metodológicas
60
durante el procedimiento. Debido a problemas que se presentaron con el sistema CASY, no se
obtuvieron datos de conteo celular para este cultivo mediante ese método. No se repitieron las
condiciones para este reactor, puesto que los objetivos de estos experimentos fue tener una idea
general del comportamiento de la actividad enzimática en función de la fuente de carbono. La
máxima velocidad específica de crecimiento fue de 0.39 h-1, lo que es menor a lo que se reporta
por otros autores [26], [93]; esto se puede deber a factores que limitaron la velocidad de
crecimiento, tal como la saturación de oxígeno; en las referencias señaladas la aireación se
realizó con oxígeno puro manteniendo la saturación mínima de 40%.
Figura 8.1. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con glucosa.
En la tabla 8.1 se demuestra una correlación mayor al 97%, entre las técnicas de permitividad,
densidad óptica y conteo en cámara. La correlación con el peso seco fue menor debido a lo
expresado en el párrafo anterior. La tabla también indica que la actividad enzimática no presentó
una relación lineal con la biomasa cuando se usa glucosa como fuente de carbono, lo que indica
que la actividad enzimática se ve afectada por otros factores además de la concentración de
biomasa.
En la figura 8.2 se muestra que al agotarse la fuente de carbono se detiene el crecimiento celular,
lo que acurre aproximadamente 7 horas después de iniciado el cultivo. La curva de actividad
enzimática muestra variación en las primeras horas del cultivo, esto se debe a que la glucosa
61
aún presente en el medio interfiere con la técnica y no es posible detectar variaciones de pocas
décimas de unidad de actividad en dichas condiciones. Por otro lado, se observó que al agotarse
el sustrato la actividad tiende a incrementarse, situándose en 1.5 U/ml (0.25 U/mg de biomasa
seca) al final del cultivo. La mayoría de los trabajos relacionados con la producción de β-
fructofuranosidasas empleando glucosa como fuente de carbono y en cultivos en lote han sido
realizados con cepas de Kluyveromyces mutantes, alcanzando actividades de 0.9 U/mg [94] y
0.11 U/mg [63]; mientras que con una cepa nativa se alcanzó una actividad de 0.6 U/ml [95].
Tabla 8.1. Correlaciones lineales entre técnicas de medición de biomasa y actividad enzimática para el
cultivo en lote utilizando glucosa como fuente de carbono
Permitividad
0.8616 Peso seco
0.9867 0.8823 DO
0.9906 0.8432 0.9734 Conteo en cámara
0.5898 0.6557 0.6213 0.6022 Actividad
Figura 8.2. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con glucosa.
62
8.1.2. Cultivo en lote con fructosa como fuente de carbono
El cultivo en lote se realizó con una concentración de 25 g/L de fructosa. En la figura 8.3 se
observa que, durante toda la cinética los métodos de seguimiento del crecimiento celular fueron
similares entre sí. La curva de conteo en cámara de Neubauer se separó del resto de curvas
debido a la escala; por tanto, la curva obtenida del sistema CASY y de conteo en cámara están
asociadas al mismo eje vertical (Mcel/ml), y debido a que el sistema CASY no discrimina las
células de otras partículas genera un conteo mayor debido los fragmentos celulares acumulados
durante la cinética. La máxima velocidad específica de crecimiento fue de 0.41 h-1, que es
similar a lo reportado por la literatura para esta levadura [93].
Figura 8.3. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con fructosa.
En la tabla 8.2 se muestra las correlaciones lineales entre los sistemas de medición de biomasa,
los resultados obtenidos son próximos al 99% entre todas las técnicas de monitoreo de la cinética
de crecimiento. Así mismo, se realizó la correlación de la actividad enzimática contra el
crecimiento celular utilizando todas las técnicas de medición. Como se observa en la tabla 8.2
la actividad enzimática no está relacionada de manera proporcional con la biomasa cuando se
usa fructosa como fuente de carbono, aunque la correlación es mayor que la que se presenta con
glucosa; aunque al igual que con glucosa, la actividad enzimática debe responder también a
otros factores.
63
cultivo en lote utilizando fructosa como fuente de carbono
Permitividad
0.9978 Peso seco
0.9957 0.9963 DO
0.9982 0.9959 0.9950 Conteo en cámara
0.9895 0.9914 0.9937 0.9914 CASY
0.7415 0.8295 0.7483 0.7585 0.7653 Actividad
Figura 8.4. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con fructosa.
La figura 8.4 muestra que el sustrato se agota aproximadamente a las 7 horas de cultivo,
momento en el que se detuvo por completo el crecimiento de la levadura; comportamiento
similar a cuando se usó glucosa. La curva de actividad enzimática muestra variaciones en las
primeras horas del cultivo, esto se debe a que la fructosa aún presente en el medio también
interfiere con la técnica de DNS. Al agotarse la fructosa, se observó una tendencia a
incrementarse la actividad enzimática, alcanzando su valor máximo al finalizar la cinética de
5.4 U/ml (0.97 U/mg de biomasa seca). La bibliografía reporta valores desde 0.07 U/mg [63],
64
0.7 U/ml [95] y hasta 11.87 U/mg; ésta última a las 24 horas para una cepa hiperproductora de
Kluyveromyces Sp. aislada del proceso de elaboración del pulque y aguamiel [96] lo que explica
la significativa diferencia de actividad con nuestro experimento. Tanto la cepa de la referencia
[96] como la empleada en este trabajo fueron aisladas de procesos donde la fuente principal de
carbono fueron fructanos de agave, por lo que al ser cepas adaptadas a dicha fuente de carbono
se explica la actividad fructanasa mayor con respecto a otros estudios.
8.1.3. Cultivo en lote con sacarosa como fuente de carbono
Figura 8.5. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con sacarosa.
Este cultivo se realizó con una concentración inicial de sacarosa de 20 g/L. Debido a que el
metabolismo de la sacarosa por las levaduras debe ser hidrolizada para ser asimilada, la
pendiente de la fase exponencial de crecimiento es menor que con glucosa y fructosa (figura
8.5). Además, cabría esperar que la velocidad específica de crecimiento fuera apreciablemente
menor que en los reactores anteriores, fenómeno que no se observó pues fue de 0.41 h-1. La
velocidad específica de crecimiento con sacarosa es igual que con fructosa, lo que indica que la
hidrólisis de la sacarosa no tiene un impacto sobre el crecimiento de la levadura. Tanto la figura
8.5 como la tabla 8.3 muestran que una correlación significativa entre las técnicas de biomasa
se dio entre la permitividad, peso seco y CASY en un grupo; y entre la densidad óptica y el
65
conteo en cámara. Estas variaciones fueron principalmente a la manipulación de las muestras,
no por técnicas en sí mismas. Al igual que en los cultivos con glucosa y fructosa, la actividad
enzimática no está relacionada de manera proporcional con la biomasa cuando se usa sacarosa
como fuente de carbono.
cultivo en lote utilizando sacarosa como fuente de carbono
Permitividad
0.9924 Peso seco
0.9490 0.9466 DO
0.9400 0.9448 0.9921 Conteo en cámara
0.9814 0.9951 0.9348 0.9308 CASY
0.7893 0.8348 0.6711 0.6991 0.8398 Actividad
Figura 8.6. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con sacarosa.
Debido al empleo del método DNS y a la naturaleza no reductora de la sacarosa, no se realizó

el seguimiento del consumo de sustrato; dado que uno de los objetivos del experimento fue
66
evaluar de manera general el impacto de las hexosas en la actividad enzimática; sin embargo, se
midió la concentración de glucosa y fructosa liberadas por la hidrólisis de la sacarosa. Se observa
en la figura 8.6 un aumento sostenido de la concentración de azúcares reductores hasta la hora
6, lo que indica que la hidrólisis de la sacarosa se dio a una mayor velocidad de la que fueron
consumidos los productos; para la hora 7 hubo un descenso abrupto de los azúcares reductores
debido seguramente al consumo total del sustrato, lo que concuerda en el tiempo con los dos
cultivos anteriores. Coincide la aparición de glucosa y fructosa con la presencia de actividad
enzimática, la cual mantiene una tendencia al incremento hasta el final de la cinética, donde la
actividad máxima fue de 6.9 U/ml (1.27 U/mg de biomasa seca) lo que resulta mayor que con
fructosa, probablemente el que glucosa y fructosa no se encuentren directamente libres en el
medio promueve una actividad enzimática mayor al mismo tiempo que se evita la mencionada
represión catabólica. La bibliografía reporta que se ha conseguido desde 0.9 U/ml [95] hasta
127 U/ml, ésta última a las 38 horas de cultivo con un medio complejo resultado de un diseño
de experimentos para favorecer la actividad enzimática y empleando una cepa nativa de
Kluyveromyces marxianus [97]; se puede inferir con esta referencia que el medio de cultivo
influye de manera significativa en la actividad enzimática, así como el tiempo de cultivo, por lo
que se sugiere que estos factores que se tomen en cuenta en futuros experimentos.
8.1.4. Cultivo en lote con inulina como fuente de carbono
Este cultivo se realizó a una concentración inicial de inulina de dalia de 20 g/L. Se observa en
la figura 8.7 que después de 14 horas de cinética no se llegó a la fase estacionaria, aun así, se
decidió finalizar el cultivo debido a que los datos obtenidos hasta ese momento fueron
suficientes para una adecuada comparación con el resto de los biorreactores. Debido que la
inulina es una molécula significativamente más compleja que la sacarosa, su hidrólisis tuvo
efectos sobre la velocidad específica de crecimiento de la levadura, alcanzándose un valor
máximo de 0.25 h-1. Tanto la figura 8.7 como la tabla 8.4 muestran que la correlación entre las
técnicas de monitoreo de la biomasa no fue tan alta como en los reactores de glucosa y fructosa,
pero si lo suficiente para considerar que son estadísticamente similares (a un 95% de confianza).
Podría suponerse por las correlaciones de la actividad con las técnicas de biomasa, que existe
una proporcionalidad directa entre la expresión de fructanasas con la biomasa cuando se utilizó
inulina como fuente de carbono, sin embargo, el cultivo no llegó hasta su fase estacionaria; por
67
lo que la biomasa no se estabilizó. Además, como se puede apreciar mejor en la figura 8.8, la
actividad presentó un incremento al finalizar el cultivo; mientras que la biomasa mantuvo su
pendiente de forma constante.
Figura 8.7. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con inulina.
cultivo en lote utilizando inulina como fuente de carbono
Permitividad
0.9855 Peso seco
0.9875 0.9977 DO
0.9877 0.9834 0.9842 Conteo en cámara
0.9815 0.9725 0.9750 0.9906 CASY
0.8826 0.9434 0.9330 0.8786 0.8532 Actividad
De la misma manera que con el cultivo con sacarosa, para el consumo de sustrato se midió la
liberación de azúcares reductores debido a la hidrólisis de la inulina. Se observa en la figura 8.8,
que la concentración de azúcares reductores se mantuvo siempre en valores mínimos; por lo que
68
la glucosa y fructosa fueron asimilados tan rápido como fueron liberados. Este resultado sugiere
que las β-fructofuranosidasas expresadas por Kluyveromyces marxianus SLP1 en este
experimento mostraron mayor velocidad de hidrólisis sobre sacarosa que sobre inulina. La
máxima actividad enzimática alcanzada en este cultivo fue de 38.33 U/ml (5.5 U/mg de biomasa
seca) lo que resulta significativamente mayor que con las anteriores fuentes de carbono. Cabe
señalar que se dejó de tomar muestras a las 14 horas de cultivo, pero una muestra tomada en el
momento de cosechar el biorreactor (a las 17 horas) arrojó una actividad de 90 U/ml, lo que
indica que la actividad enzimática continuaba en aumento debido probablemente a la presencia
de sustrato aún en el medio. Hay reportes a condiciones similares con valores de actividad
enzimática desde 25 U/ml [98], 43.8 U/ml [95] y 50.0 U/ml [99] con un medio complejo
producto de un diseño de experimentos para favorecer la producción de inulinasa, y hasta 27.74
U/mg a las 24 horas con una cepa hiperproductora de Kluyveromyces sp. aislada del proceso de
elaboración del pulque y aguamiel [96]. Debido que este experimento se detuvo antes de
agotarse la fuente de carbono, la actividad fructanasa alcanzada resultó menor a las referencias
señaladas por lo que los datos no son del todo comparables; pero si ofrecen una idea general del
impacto de la inulina sobre la actividad enzimática con respecto a las fuentes de carbono de los
experimentos anteriores.
Figura 8.8. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con inulina.
69
8.1.5. Cultivo en lote con fructanos de agave como fuente de carbono
Este cultivo se realizó con una concentración inicial de fructanos de agave (FA) de 20 g/L. Se
observa en la figura 8.9 que el crecimiento fue similar al que se presentó con inulina. Al igual
que con el cultivo con inulina, después de 14 horas de cinética no se llegó a la fase estacionaria,
aun así, se decidió finalizar el cultivo debido que los datos obtenidos hasta ese momento fueron
suficientes para una adecuada comparación con el resto de los biorreactores. Debido a la
naturaleza ramificada de los FA, la liberación de unidades de glucosa y fructosa es más lenta
que con inulina debido principalmente a impedimentos estéricos con la enzima; por lo que la
velocidad específica de crecimiento fue la menor con respecto a los 5 experimentos anteriores,
alcanzándose un valor máximo de 0.21 h-1. Tanto la figura 8.9 como la tabla 8.5 muestran que
la correlación entre las técnicas de monitoreo de la biomasa son suficientemente altas para
considerar que son estadísticamente similares (a un 95% de confianza). Al igual que con inulina,
la alta correlación entre actividad y biomasa no indica que haya necesariamente una
proporcionalidad directa entre la actividad β-fructofuranosidasa con la biomasa, pues no se
estudió la actividad durante la fase estacionaria. Al comparar las pendientes de biomasa total y
actividad enzimática, se puede determinar que conforme avanza el cultivo hay mayor actividad
por gramo de biomasa; por lo que se puede formular la hipótesis de que esto se debe a que las
células hijas están “condicionadas” para producir β-fructofuranosidasas desde un inicio.
Figura 8.9. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote con FA.
70
cultivo en lote utilizando FA como fuente de carbono
Permitividad
0.9943 Peso seco
0.9925 0.9948 DO
0.9619 0.9631 0.9708 Conteo en cámara
0.9761 0.9820 0.9888 0.9819 CASY
0.9252 0.9513 0.9315 0.8833 0.9035 Actividad
Figura 8.10. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote con FA.
Al igual que con la inulina, no se pudo realizar el seguimiento del consumo de FA; midiéndose
entonces la concentración de glucosa y fructosa liberados por la hidrólisis del mismo. Se observa
en la figura 8.10 la presencia de azúcares reductores al inicio del cultivo, esto se debe a la
hidrólisis parcial que sufren los FA en el momento de la esterilización por calor [25], además
de la que ya contiene de manera libre la fuente empleada. La concentración de dichos azúcares
disminuye hasta dejar de detectarse, lo que indica que desde el inicio del cultivo la velocidad de
71
asimilación de las moléculas de glucosa y fructosa fue mayor que la velocidad de hidrólisis de
los FA. Este resultado indica que las β-fructofuranosidasas expresadas por Kluyveromyces
marxianus SLP1 presentan la menor velocidad de hidrólisis sobre FA que sobre glucosa y
fructosa. La máxima actividad enzimática alcanzada en este cultivo fue de 40 U/ml (5.8 U/mg
de biomasa seca), similar a lo obtenido con inulina. Hay solo 2 estudios que evalúan la actividad
enzimática en un cultivo con FA como fuente de carbono, donde obtiene valores de 12 U/ml
[91] y 4.02 U/mg [73]; cabe señalar que los cultivos de ambos reportes fueron realizados a nivel
matraz, por lo que las condiciones aireación y pH no fueron controladas, lo que pudo afectar la
actividad enzimática.
8.1.6. Comparativa entre actividad enzimática y fuente de carbono
En la figura 8.11 se aprecia claramente la magnitud de la diferencia en la actividad enzimática

según la fuente de carbono que se empleó. Siendo la actividad más baja para la glucosa, seguida
de la fructosa y ligeramente mayor con sacarosa; con inulina y FA la diferencia es significativa,
siendo hasta 26 veces mayor que lo producido con glucosa durante el mismo tiempo de cultivo.
Figura 8.11. Comparativa de actividad enzimática según la fuente de carbono.
Diversas fuentes bibliográficas reportan una represión catabólica de la actividad de

inulinasas/fructanasas en la levadura Kluyveromyces marxianus por parte de la glucosa [63],
72
[92], [94], lo que coincide con los resultados obtenidos en este trabajo. Por lo que formulamos
la hipótesis de que al hidrolizarse la inulina o FA la liberación de las unidades de glucosa y
fructosa es lo suficientemente lenta para que los azúcares sean asimilados, manteniendo la
concentración de glucosa/fructosa en niveles mínimos; evitándose la represión catabólica y
manteniendo estresada la célula por limitación de sustrato. Los experimentos que a continuación
se detallan servirán de apoyo para la verificación de tal hipótesis.
La evaluación de los cultivos en lote con las diferentes fuentes de carbono permitió proponer
cultivos en continuo con glucosa como fuente de carbono, pues este tipo de cultivo permite
mantener la concentración de sustrato en el medio a niveles mínimos y favoreciendo la
producción de fructanasas.
8.2. Cultivos en estado continuo en biorreactor
A continuación, se presentan los resultados de dos cultivos en estado continuo que se realizaron
con el objetivo de determinar las condiciones de temperatura (Temp), velocidad específica de
crecimiento (µ) y concentración de glucosa en la alimentación (C_S0) que maximicen la
producción de la enzima de interés. Como se mencionó en párrafos anteriores, los niveles
residuales de glucosa/fructosa inducen la actividad β-fructofuranosidasa y al mismo tiempo
impiden la represión catabólica, razones por las cuales se empleó glucosa en los siguientes
experimentos. Asimismo, es deseable diseñar un proceso en el que se consiga una alta actividad
enzimática con una fuente de carbono económica y abundante. Lo que no ocurre con fuentes de
carbono como la inulina y los FA, que pueden ser productos caros y cuyas cantidades
disponibles en el mercado son menores que la glucosa; además se requeriría la caracterización
previa de los fructanos como control de calidad, incrementando los costos de proceso.
8.2.1. Primer cultivo en continuo
El diseño de experimentos que se corrió para el primer sistema en continuo generó una gran
cantidad de datos provenientes tanto de los sensores de monitoreo en línea, como los fuera de
línea. La tabla 8.11 muestra los parámetros asociados a cada condición, así como los resultados
obtenidos de biomasa y actividad para cada caso (en el anexo B se encuentra el resto de la
información generada en este experimento). Las condiciones se propusieron con base en
73
experimentos anteriores realizados por el Dr. Alejandro Arana y el equipo francés del proyecto
SPECTRE (el Dr. Charles Ghommidh y la Dra. Laurence Preziosi-Belloy) que no han sido
publicados.
Tabla 8.11. Resultados de biomasa y actividad enzimática del primer cultivo en estado continuo.
Temp µ C_S0 Biomasa Actividad Actividad
Muestra
-1
(°C) (h ) (g/L) (g/L) (U/ml) (U/g)
T1R1 26 0.05 20 8.64 177.87 20,589
T2R1 34 0.05 20 7.11 812.22 114,303
T3R1 34 0.4 20 3.31 15.34 4,631
T4R1 26 0.4 20 2.92 2.92 1,113
T5R1 26 0.05 60 9.35 128.92 13,785
T7R1 34 0.05 60 6.14 74.86 12,185
T6R1 26 0.4 60 2.35 13.21 5,621
T8R1 34 0.4 60 5.73 0.55 95
T9R1 30 0.225 40 5.13 23.24 4,532
T10R1 30 0.225 40 6.55 16.54 1,814
T11R1 30 0.225 40 6.79 27.04 3,997
T12R1 30 0.225 40 5.42 23.31 4,735
T1R2 26 0.05 20 8.83 182.53 20,676
T2R2 34 0.05 20 6.94 892.24 128,628
T3R2 34 0.4 20 3.25 37.00 11,374
T4R2 26 0.4 20 3.12 3.25 936
T5R2 26 0.05 60 9.44 129.09 13,672
T7R2 34 0.05 60 5.93 71.95 12,135
T6R2 26 0.4 60 2.16 4.42 2,044
T8R2 34 0.4 60 5.87 0.47 80
T9R2 30 0.225 40 5.21 27.12 5,121
T10R2 30 0.225 40 6.78 17.52 1,943
T11R2 30 0.225 40 6.66 32.12 4,823
T12R2 30 0.225 40 5.25 23.29 4,605
T1R3 26 0.05 20 8.94 129.60 14,500
T2R3 34 0.05 20 7.05 562.07 79,748
T3R3 34 0.4 20 3.36 35.75 10,653
74
T4R3 26 0.4 20 3.05 1.87 614
T5R3 26 0.05 60 9.17 108.44 11,823
T7R3 34 0.05 60 6.37 100.91 15,837
T6R3 26 0.4 60 2.61 6.41 2,455
T8R3 34 0.4 60 6.40 1.66 259
T9R3 30 0.225 40 5.43 30.93 5,697
T10R3 30 0.225 40 6.87 19.93 2,149
T11R3 30 0.225 40 6.87 34.53 5,025
T12R3 30 0.225 40 5.36 25.96 4,842
Como se puede apreciar en las columnas de actividad de la tabla 8.11, que en la gran mayoría
de las condiciones se logra una actividad enzimática más elevada que la conseguida con la
misma fuente de carbono en cultivo en lote (en negritas las actividades más altas); incluso, en
varias de las condiciones se detectó una mayor actividad β-fructofuranosidasa que la conseguida
en los cultivos en lote con inulina y FA; probando que los cultivos en estado continuo son una
mejor opción que los cultivos en lote para una alta producción de β-fructofuranosidasas a partir
de Kluyveromyces marxianus SLP1.
Se han publicado diversos reportes en la literatura científica que exploran el impacto de la tasa
de crecimiento de K. marxianus sobre la actividad fructanasa en quimiostato, encontrando que
a velocidades específicas de crecimiento menores mejora la actividad, lo que se encuentra en
concordancia con lo expuesto anteriormente. Uno de estos trabajos alcanza actividades de hasta
52 U/mg de biomasa seca a µ = 0.1 h-1 empleando inulina como fuente de carbono, mientras
que con glucosa alcanzan 3.9 U/ml [92]; por lo que la tasa de dilución tiene un efecto
significativo en la actividad enzimática. En otro reporte encontraron que a µ = 0.05 h-1
alcanzaban la máxima actividad, sin embargo, disminuía al incrementarse µ; los autores no
probaron una tasa de crecimiento menor. La fuente de carbono utilizada fue sacarosa [64]. En
el presente trabajo se detectaron actividades enzimáticas mayores a cualquier reporte y
empleando glucosa como fuente de carbono; por otra parte, la cepa de K. marxianus SLP1
mostró ser una muy buena productora de la enzima de interés.
A continuación, se detalla cómo se relacionan los factores probados con la actividad de β-

fructofuranosidasas.
75
8.2.1.1. Análisis por superficie de respuesta
Con los datos generados se realizó un análisis por superficie de respuesta, o para ser precisos
volumen de respuesta, que muestra el impacto de cada uno de los factores probados sobre la
variable de respuesta, que fue la actividad enzimática en U/ml. Para el análisis estadístico se
recurrió al programa Statgraphics Centurion versión 16.2.04. La tabla 8.12 muestra el análisis
de varianza para la actividad enzimática donde se verifica que tanto los factores como sus
interacciones tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la variable de respuesta, con
un nivel de confianza del 95% (P < 0.05).
Tabla 8.12. Análisis de varianza para la actividad enzimática

Factor Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Razón F Valor P
A: Temp 122764. 1 122764. 19.99 0.0001
B: µ 439522. 1 439522. 71.56 0.0000
C: C_So 203830. 1 203830. 33.19 0.0000
AB 106548. 1 106548. 17.35 0.0003
AC 166112. 1 166112. 27.05 0.0000
BC 179047. 1 179047. 29.15 0.0000
BC 179047. 1 179047. 16.18 0.0004
Total error 153549. 25 6141.97
Total (corr.) 1.50545E6 32
Según la figura 8.12, la actividad enzimática es más alta cuando la temperatura se sitúa en 34
°C en lugar que a 26; así como una velocidad específica de crecimiento de 0.05 h-1 y una
concentración de 20 g/l de glucosa en la alimentación, en lugar de valores mayores. Así mismo,
la longitud de las barras en cada factor es un indicativo de la magnitud en que éste afecta la
variable de respuesta. De esta manera, el factor que más impacta sobre la actividad enzimática
es la velocidad específica de crecimiento.
76
Figura 8.12. Gráfico de efectos principales.
Figura 8.13. Gráfica de interacciones entre factores.
Tal como lo demuestra el análisis de varianza, la interacción entre los factores tiene un efecto
significativo sobre la variable de respuesta. En la figura 8.13 se puede apreciar que la actividad
enzimática es favorecida cuando los factores se encuentran en la siguiente combinación: Temp
(+) – µ (-), Temp (+) – C_So (-) y µ (-) – C_So (-); es decir, mantener una temperatura que
tienda hacia los 34 °C al mismo tiempo que se mantiene una velocidad de crecimiento y una
concentración de sustrato bajas en ambos casos, concordando con la figura 8.12. Además, las
77
longitudes de las barras indican que la interacción µ – C_So es la que afecta en mayor magnitud
la variable de respuesta.
La superficie de respuesta generada (figura 8.14) con los datos de este experimento indica el
comportamiento que presenta la actividad de fructanasas en función de los factores propuestos.
Como ya se ha indicado, los valores de la actividad β-fructofuranosidasa tendieron a
incrementarse conforme se elevaba la temperatura, se reducía la velocidad específica de
crecimiento, así como la concentración de sustrato en la alimentación; concretamente, la
máxima actividad enzimática alcanzada (755 ± 170 U/ml) se dio a una temperatura de 34 °C,
velocidad específica de crecimiento de 0.05 h-1 y 20 g/l de glucosa en la alimentación. Lo que
representa una frontera de las condiciones analizadas, por lo que el punto óptimo podría
Contours of Estimated Response Surface
encontrarse fuera de la zona del análisis. C_So=60.0
Act. Enz., U/ml

0.0
100.0
60 200.0
300.0
400.0
50 500.0
C_So, g/l
600.0
40 700.0
800.0
30 900.0
0.4
20 0.3
0.2
26 28 0.1
30 32 0 µ, 1/h
34
Temp, °C
Figura 8.14. Superficie de respuesta para la actividad enzimática en función de los factores probados.
La reducción de la velocidad específica de crecimiento se consiguió disminuyendo la velocidad

de alimentación, que combinado con una menor concentración de glucosa en el alimento da
como resultado un descenso significativo en la disponibilidad de fuente de carbono durante el
cultivo. De esta manera, se consigue recrear las condiciones de disponibilidad de glucosa que
se presentan durante los cultivos con inulina y FA, con el consiguiente importante incremento
de la actividad fructanasa.
78
Los resultados de este experimento apoyan la hipótesis que se presentó en la sección 8.1, que la
actividad de β-fructofuranosidasas está directamente relacionada con la limitación continua de
glucosa durante el cultivo de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1.
No se encontró ningún tipo de correlación entre el resto de parámetros monitoreados, mostrados

en el anexo A, con la actividad enzimática.
Finalmente, se realizó una regresión lineal multivariada para generar un modelo que relaciona
los factores probados y sus interacciones con la variable de respuesta:
𝑔
𝐴𝑐𝑡. 𝐸𝑛𝑧 (𝑈⁄𝑚𝑙 ) = −3175 + 129 𝑇𝑒𝑚𝑝 (°𝐶) + 7502 𝜇 (ℎ−1 ) + 57 𝐶𝑆0 ( ⁄𝑙 ) − 309 𝑇𝑒𝑚𝑝 ∗ 𝜇 − 2 𝑇𝑒𝑚𝑝
∗ 𝐶𝑆0 − 135 𝜇 ∗ 𝐶𝑆0 + 5 𝑇𝑒𝑚𝑝 ∗ 𝜇 ∗ 𝐶𝑆0
El valor R2ajustado del modelo es de 87, por lo que es capaz de explicar el 87% de la variabilidad
de los datos, a un nivel de significancia del 5%.
8.2.2 Segundo cultivo en estado continuo
Con el objetivo de verificar y ampliar la zona de exploración en torno a las condiciones de mayor
producción enzimática del cultivo en continuo anterior, se propuso inicialmente un diseño de
experimentos 22 con puntos al centro, con temperatura de cultivo y velocidad especifica de
crecimiento como factores. Los niveles propuestos fueron 30 y 38 °C para la temperatura, y 0.01
y 0.09 h-1 para la velocidad específica de crecimiento, con 34 °C y 0.05 h-1 como punto central.
El experimento se concentró en la verificación de las condiciones de mayor producción de β-
fructofuranosidasas arrojadas por el primer cultivo en continuo, y el impacto de la temperatura
sobre la variable de respuesta a µ = 0.05 h-1. Las condiciones que si fueron probadas son las que
se muestran en la tabla 8.13, junto con los resultados de biomasa y actividad para cada caso.
Debido al bajo número de condiciones, no fue posible realizar un análisis estadístico similar al
primer cultivo en continuo.
Como se puede observar en la tabla, la condición que favoreció la mayor producción de β-

fructofuranosidasas fue 34 °C y µ = 0.05 h-1; justamente la misma condición que en el primer
diseño experimental. Resulta llamativo que la máxima actividad alcanzada en el segundo
79
experimento es la mitad de la que se obtuvo en el primero. La única deferencia observada
durante los 2 cultivos fue el porcentaje de saturación de oxígeno en el medio durante la
condición de máxima actividad: en el primer cultivo se mantuvo entre 2.5 y 3.5%, mientras que
en el segundo cultivo se mantuvo por debajo del 1%; es importante señalar que debido al margen
de error del propio sensor de oxígeno, la saturación durante el segundo cultivo pudo haber caído
a 0%. Aunque en el segundo experimento la aireación fue del doble que en el primero, los
volúmenes de trabajo fueron diferentes (1.5 L para el primero y 2.2 L para el segundo); lo que
resulta en una diferencia en el flujo neto de aire aún mayor (1.5 L/min para el primer caso y 4.4
L/min para el segundo). La velocidad de aireación puede incrementar el tamaño de burbuja, que
a su vez impacta de manera negativa el coeficiente de transferencia de oxígeno al medio de
cultivo [100]–[102]; para contrarrestar esa consecuencia, se incrementó la agitación de 500 a
550 rpm en el segundo diseño. La estrategia empleada no fue suficiente para mejorar el
porcentaje de saturación de oxígeno disuelto. Por otro lado, no era recomendable incrementar la
agitación por encima de los 550 rpm; pues como lo reporta Silva-Santisteban y Maugeri [65], la
producción de inulinasa comienza a decrecer a partir de una agitación superior a 500 rpm. Estos
resultados sugieren que la producción de β-fructofuranosidasas se encuentra afectada de manera
importante por la disponibilidad de oxígeno disuelto en el medio.
Tabla 8.13. Condiciones y resultados para el segundo cultivo en continuo.

Temperatura, Velocidad específica Biomasa Actividad Actividad
Muestra
°C de crecimiento, h-1 g/l U/ml kU/g *
T1 34 0.05 6.4 398 ± 30 63 ± 5
T2 30 0.05 7.5 126 ± 9 16.9 ± 1.3
T3 38 0.05 7.7 295 ± 30 38.1 ± 4
T4 34 0.09 6.4 65 ± 6 10.2 ± 1.1
* kU/g = 1000 U/g o U/mg
La figura 8.15 muestra cómo se afectó la actividad enzimática por la temperatura a una velocidad
específica de crecimiento de 0.05 h-1. Se aprecia una caída de la actividad más pronunciada a
temperaturas menores de 34 °C que a temperaturas mayores; produciendo hasta 69% menos a
30 °C y 26% menos a 38 °C que a 34 °C. Dentro del equipo de trabajo de biotecnología industrial
de CIATEJ, Núñez-López reportó que la mejor temperatura para la producción de fructanasas
80
fue de 20 °C en cultivo realizados a nivel matraz, con actividades de hasta 7.93 ± 0.6 U/ml [25];
lo que es evidencia del impacto que puede tener el sistema de cultivo en la producción de
metabolitos de interés.
Figura 8.15. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática a µ = 0.05 h-1.
Finalmente, la actividad enzimática medida sobre la muestra 4 obtenida bajo las condiciones de
34 °C y µ = 0.09 h-1 prueba el fuerte efecto que tiene la disponibilidad de glucosa sobre la
actividad de la enzima de interés. Con solo subir la tasa de dilución de 0.05 a 0.09 h-1 a 34 °C,
la actividad enzimática cayó un 84%.
El segundo cultivo en continuo se realizó también con el objetivo de validar la metodología para
el monitoreo en línea de la actividad enzimática mediante un sistema de análisis de inyección
secuencial, cuyos resultados se presentan y discuten en la sección 8.5.3.
Una vez que se verificó que a 34 °C se favorecía la producción de β-fructofuranosidasas en

cultivos en continuo, se decidió evaluar el comportamiento de la levadura y la producción de la
enzima a dicha temperatura en un cultivo en lote. Además, se mantuvieron los cultivos durante
un tiempo prolongado aun cuando se había agotado la fuente de carbono.
81
8.3. Cultivos en lote a 34 °C en biorreactor
A una temperatura de 34 °C, la velocidad específica de crecimiento de la levadura

Kluyveromyces marxianus SLP1 fue de 0.53 h-1; consumiéndose el sustrato en apenas 5 horas.
Debido a la naturaleza de cada técnica de monitoreo de biomasa, estas difieren unas de otras en
la fase estacionaria (figura 8.16); ya que en esta fase se produce mayormente degradación y
muerte celular.
Figura 8.16. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote 1 a 34 °C.
Resulta de especial interés el comportamiento de la actividad enzimática conforme avanza la

edad del cultivo (figura 8.17). Justo al agotarse la glucosa se presentó un incremento de la
actividad enzimática (característica que se ha observado en los cultivos anteriores) de la hora 5
a la hora 8 para caer de manera apreciable en la hora 13. No hubo ninguna perturbación en las
condiciones del cultivo que justifique dicho comportamiento, por lo que se hipotetizó sobre la
producción de proteasas dado que coincide relativamente con el agotamiento de la fuente de
carbono. La mayor concentración de proteasas presentes en el medio degradaría las fructanasas
producidas, lo que explicaría el repentino descenso de la actividad de la enzima de interés. Pero
a partir de la hora 18 se midió un incremento sostenido de la actividad fructanasa; por lo que la
producción de β-fructofuranosidasas se vería favorecida sobre la posible producción de
proteasas. Nótese que aún sin haber glucosa disponible en el medio, la actividad enzimática
continúa; por lo que las células que se encuentran activas deben obtener energía de otras fuentes.
82
Figura 8.17. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote 1 a 34 °C.
Con el objetivo de explorar la generación de proteasas durante la cinética y verificar el

incremento continuo de la producción de β-fructofuranosidasas aún en condiciones de pleno
agotamiento de la fuente de carbono inicial, realizó a cabo un segundo cultivo en lote a 34 °C.
Gracias al uso del sistema de aire comprimido este cultivo se llevó a cabo con una aireación
mayor, concretamente a 2 vvm. En las figuras 8.18 y 8.19 se puede apreciar que las curvas de
biomasa tienen un comportamiento similar entre sí. Además, se obtuvo mayor cantidad de
biomasa en este cultivo con respecto al cultivo anterior; presumiblemente por la mayor
disponibilidad de oxígeno.
De nuevo resulta de especial interés la curva de actividad enzimática. En este reactor no se

presentó el súbito descenso de la actividad en ningún momento del cultivo; de hecho, a partir de
la hora 10 la actividad fructanasa comenzó a incrementarse de manera sostenida hasta
aproximadamente la hora 83, para después descender ligeramente. Exceptuando la variación de
la actividad en el anterior cultivo, ambos experimentos tuvieron un comportamiento similar en
cuanto a la actividad de la enzima. Estos resultados también apoyan la hipótesis de que la
restricción completa de glucosa en el medio favorece la actividad de β-fructofuranosidasas. La
figura 8.18 muestra mayor actividad en U/ml para el cultivo 2 (6.1 U/ml) que para el cultivo 1
(2.8 U/ml), pero esto fue debido al mayor rendimiento biomasa/sustrato consecuencia de la
mejor aireación; pero en términos de U/g de biomasa seca, ambos cultivos tuvieron una
actividad similar en torno a la hora 65 (~ 800 U/g).
83
Figura 8.18. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote 2 a 34 °C.
No se detectó actividad proteasa en las muestras del cultivo en lote 2; es necesario aclarar, que
las muestras fueron analizadas varios días después de terminada la cinética. Aunque las muestras
se mantuvieron a -20 °C, la proteasa pudo haberse degradado haciendo imposible su detección
mediante la metodología implementada. También existe la posibilidad que no se haya producido
la proteasa debido a que la mejor aireación redujo los niveles de estrés en la levadura.
Figura 8.19. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote 2 a 34 °C.
Muestras representativas de la cinética fueron dializadas y analizadas para actividad fructanasa

con el objetivo de determinar el impacto del sobrenadante sobre la técnica para la determinación
84
de azúcares reductores. Como se observa en la figura 8.20, las muestras dializadas mostraron
una mayor actividad que la no dializada; aproximadamente un 10% mayor, lo que concuerda
con lo reportado por Miller y col [90]. Donde los autores mostraron que las sales tienen un
impacto en la coloración de la prueba lo que afectaría la absorción a 540 nm.
Cada vez que se realizó la prueba de actividad con sobrenadante sin diluir, se observó que la
disolución final tendía a quedarse impregnada a las paredes del microtubo, afectando
directamente a la respuesta final de actividad. Estos resultados indican algún tipo de interacción
entre el sobrenadante y los reactivos de la metodología de determinación de actividad
enzimática; el efecto no se observó en muestras diluidas. Todos los valores de actividad
reportados en el presente trabajo se realizaron con muestras diluidas al menos 10 veces.
Cabe señalar que se tomó en cuenta la pérdida de volumen de cultivo por evaporación. A las
condiciones a las que se realizaron los cultivos, se puede perder entre 4 y 5 ml de agua por hora
debido a la aireación. En un cultivo en lote de pocas horas, el volumen perdido no es
significativo; pero después de 100 horas, como fue el caso, la pérdida por evaporación puede
representar hasta el 30% del volumen inicial. Por tanto, es importante tomar en cuenta la
evaporación en cultivos en biorreactores; principalmente en cultivos en lote.
Figura 8.20. Actividad enzimática de muestras dializadas vs no dializadas.
8.4. Cultivos en lote alimentado en biorreactor
A continuación, se muestran los resultados de los 2 cultivos en lote alimentado que se realizaron
con el objetivo de evaluar la producción de β-fructofuranosidasas en condiciones controladas de
85
restricción de sustrato. El tiempo de cultivo cero y los datos reportados corresponden a partir
del inicio de la alimentación.
8.4.1. Primer cultivo en lote alimentado
Debido que los experimentos anteriores han indicado que al limitar la disponibilidad de glucosa
en el medio promueve la producción de β-fructofuranosidasas, se corrió un primer cultivo en
lote alimentado con velocidad de alimentación constante. Al mantener fija la cantidad de glucosa
suministrado al cultivo por unidad de tiempo, conforme se incrementó la biomasa menor
disposición de sustrato hubo por unidad de biomasa, disminuyendo en consecuencia la velocidad
de crecimiento de la levadura de manera progresiva. Por tanto, se pudo estudiar el impacto de
la velocidad específica de crecimiento sobre la producción de la enzima de interés manteniendo
en todo momento la restricción de glucosa. El flujo de alimentación se mantuvo alrededor de 70
ml/h, mientras que la concentración de glucosa en el medio de alimentación fue de 100 g/L.
La figura 8.21 muestra la evolución de la concentración de biomasa durante la fase de

alimentación. Como ya se ha presentado en los cultivos anteriores, la correlación entre las
diferentes técnicas es relativamente buena, mayor al 97%; exceptuando en esta ocasión el conteo
en cámara, que presentó una variabilidad elevada.
Figura 8.21. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote alimentado 1.
86
Una de las cualidades de un cultivo en lote alimentado es que se puede calcular de manera
sencilla el rendimiento biomasa/sustrato, 𝑌𝑥/𝑠 (ver sección 2.5.2). Al graficar la biomasa total
(peso seco * volumen de cultivo) contra el tiempo (figura 8.22), la biomasa total tiende a
incrementarse de manera lineal con el tiempo. El rendimiento 𝑌𝑥/𝑠 se obtiene de dividir la
pendiente de la línea contra la cantidad de sustrato total suministrado (flujo de alimentación *
concentración de sustrato en la alimentación). De esta manera, el valor calculado para el
rendimiento biomasa/sustrato a las condiciones del cultivo en el lote alimentado 1 fue de 0.15 g
de biomasa/g de glucosa, que es un valor bajo comparado con lo reportado en otras fuentes [26],
[32]. Esta diferencia puede deberse a la baja disponibilidad de oxígeno disuelto en el medio,
pues el sistema de aireación empleado no logra elevar el porcentaje de saturación de oxígeno
por encima del 3%.
Figura 8.22. Biomasa total vs tiempo para el cultivo en lote alimentado 1.
Durante toda la etapa de alimentación el suministro de glucosa total fue mantenido en niveles
bajos, de modo que la levadura se encontró en todo momento limitada en fuente de carbono,
presentándose un incremento sostenido de la actividad fructanasa durante todo el cultivo (figuras
8.23 y 8.24). Este comportamiento refuerza la hipótesis antes mencionada que propone que la
limitación de glucosa es el impulsor para la producción de β-fructofuranosidasas.
87
Figura 8.23. Biomasa vs actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote alimentado 1.
Se presentó un fenómeno interesante durante este cultivo, como se puede ver en la curva de
sustrato de la figura 8.23 la concentración de glucosa tuvo una tendencia a incrementarse.
Aunque es cierto que la pendiente de acumulación es pequeña. El que haya una concentración
de glucosa presente durante el cultivo más allá de la que puede considerarse residual, indica que
por alguna razón la levadura no pudo consumir toda la glucosa disponible. La única razón que
se encontró para justificar este suceso fue que debía existir otro elemento limitante del
crecimiento. Este limitante fue probablemente la disponibilidad de oxígeno. En la figura 8.24,
la curva de saturación de oxígeno muestra el porcentaje de oxígeno de los gases exhaustos, que
se mantiene en descenso desde el inicio de la alimentación. Es natural que la demanda de
oxígeno se aumente al incrementarse la biomasa total, y por tanto descienda el porcentaje en los
gases de salida; pero ya se ha visto en los cultivos anteriores que 1 vvm de aireación no resulta
suficiente para la cantidad de biomasa alcanzada en el experimento (para este cultivo aún no se
contaba con aire comprimido en el laboratorio). Así que la limitante de oxígeno es un candidato
plausible que explique la acumulación de sustrato.
88
alimentado 1.
La máxima actividad enzimática en U/ml se presentó a las 18 horas de cultivo, justo antes de
detener el cultivo por haber alcanzado el máximo volumen del biorreactor; donde se obtuvo 150
U/ml. Mientras que en kU/g, la máxima actividad se alcanzó a las 13 horas; donde fue de 15.5
kU/g, sin descender de manera significativa durante el resto del cultivo. Esta discrepancia se
debe a que la medición de la actividad enzimática en U/ml, tiende a depender de la concentración
de biomasa; mientras que, la medición de la actividad enzimática en U/g responde a la biomasa
total en el sistema.
Nótese que el incremento de la actividad enzimática es poco o nulo después de la hora 13, lo
que coincide con una caída en la saturación de oxígeno. Este comportamiento refuerza la idea
que limitación de oxígeno en el medio afecta directamente a la producción de β-
fructofuranosidasas. Quizá sea la razón por la que la actividad estuvo por debajo de la detectada
en los reactores en continuo. Hensing y col reportan que en cultivo en lote alimentado de la
levadura K. marxianus CBS 6556 en un rango de temperatura entre 30 – 40 °C y una saturación
de oxígeno en medio por encima del 50% obtuvieron una concentración de biomasa seca de 100
g/l, y hasta 3000 U/ml (30,000 U/g) [32]. El valor reportado resulta hasta 20 veces lo medido en
el primer cultivo en lote alimentado, lo que demuestra que es posible obtener altos valores de
actividad fructanasa al no limitar la oxigenación en el cultivo y consiguiendo una elevada
89
saturación de biomasa. En la misma referencia se reportó que la mayor actividad se incrementó
al disminuir la velocidad específica de crecimiento, siendo la de máxima producción a 0.05 h-1;
no exploraron velocidades de crecimiento menores. Este resultado concuerda con lo que se ha
reportado en este trabajo de tesis; y como lo muestra la curva de velocidad específica de
crecimiento de la figura 8.24, la mayor producción de fructanasas se dio a µ ~ 0.05 h-1.
8.4.2. Segundo cultivo en lote alimentado
Con el objetivo de explorar la producción de la enzima de interés a velocidades específicas de

crecimiento menores a 0.05 h-1, se realizó un segundo cultivo en lote alimentado donde el flujo
de alimentación fue el mínimo posible dado por el sistema de bombeo. El flujo de alimentación
se redujo a 17 ml/h, empleando un cabezal de la bomba peristáltica que admitiera un diámetro
de tubería menor. La concentración de glucosa en la alimentación se mantuvo en 100 g/L. Para
mejorar la oxigenación se empleó el sistema de aire comprimido del laboratorio para mantener
en 2 vvm la aireación, manteniendo la saturación de oxígeno disuelto en el cultivo entre 40 –
50%.
Figura 8.25. Comparación entre técnicas de biomasa para el cultivo en lote alimentado 2.
La figura 8.25 muestra la evolución de la concentración de biomasa durante la fase de

alimentación. Como ya se ha presentado en los cultivos anteriores, la correlación entre las
diferentes técnicas es relativamente buena, mayor al 96%; exceptuando de nuevo el conteo en
90
cámara, que presentó un comportamiento fuera de lo esperado y que se aleja de la tendencia
presentada por el resto de las técnicas de monitoreo de biomasa. Aparentemente el grado de
error en el conteo en cámara de Neubauer se incrementa de manera importante a altas
poblaciones.
Se observó que a partir de la hora 30 la concentración de biomasa se mantuvo prácticamente

constante, lo que indica que la biomasa total no creció de manera lineal con el tiempo. En la
figura 8.26 se demuestra que en efecto no es lineal la acumulación de biomasa, sino que presenta
una curvatura donde la generación de biomasa tiende a detenerse. Este comportamiento se debe
a que la velocidad de alimentación resultó ser demasiado baja para mantener una tasa de
generación de biomasa constante, como ocurrió en el primer cultivo en lote alimentado. Si el
volumen del biorreactor hubiera sido lo suficientemente grande, eventualmente la biomasa
acumulada hubiera sido tal que la cantidad de sustrato alimentado sería insuficiente para generar
biomasa y hubiese sido usado únicamente para mantener vivas las células en el biorreactor, que
es lo que se conoce como coeficiente de mantenimiento celular. De la ecuación 12 (Sección
2.5.2), tenemos que:
𝐹𝑆𝑅
𝑚𝑠 =
𝑋𝑉
Figura 8.26. Biomasa total vs tiempo para el cultivo en lote alimentado 2.
91
El modelo calculado por regresión exponencial para la biomasa total en función del tiempo fue:
𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝑔) = 5.22 + 48.9 (1 − 𝑒 −0.02𝑡 )
El modelo presentó un nivel de ajuste del 98.4%. Al evaluar el modelo en un tiempo infinito, la
máxima biomasa total teórica sería de 54.1 g. Por lo que mediante la ecuación 12, el coeficiente
de mantenimiento para la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1 a 34 °C fue de 0.031 gramos
de glucosa por gramo de biomasa. Hensing y col. calcularon un valor de 0.024 gramos de
glucosa por gramo de biomasa para un cultivo en lote alimentado; no precisan a qué temperatura
corresponde dicho valor, lo manejan como constante en un rango de 30 a 40 °C [32], lo que
concuerda con el valor obtenido en este experimento. Otros trabajos reportan valores de 0.25
g/g-h a 30 °C con lactosa [103] o hasta 0.46 g/g-h a 35 °C con jugo de achicoria [104]; los
valores difieren de manera significativa con nuestro estudio probablemente al medio de cultivo
complejo empleado en las referencias. Todas con cepas de la levadura K. marxianus.
Figura 8.27. Biomasa, actividad enzimática y sustrato para el cultivo en lote alimentado 2.
La condición de restricción de biomasa de este cultivo también tuvo efectos sobre la producción
de fructanasas. Se esperaba que la actividad enzimática se mantuviera en ascenso durante el
cultivo, pero como lo demuestra la figura 8.27, el máximo de actividad se alcanzó a las 16 horas
de iniciada la alimentación para después descender y mantenerse constante durante las últimas
30 horas. Justamente en torno a esa hora la tasa de producción de biomasa parece haberse
92
reducido a juzgar por el cambio de pendiente en la curva de peso seco en la hora 25. Los
resultados indican que hay un límite en el grado de limitación de la fuente de sustrato; por debajo
de dicho límite, la levadura aparentemente cambia su estado fisiológico provocando que haya
menor actividad enzimática. Lo cual puede deberse a la menor actividad de fructanasas y/o el
incremento de la producción de proteasas.
Por otro lado, la máxima actividad enzimática en este cultivo, 45.9 U/ml, coincide con el
momento en que la velocidad específica de crecimiento es de 0.05 h -1 (figura 8.28), lo que
concuerda con los experimentos anteriores y la literatura revisada. Estos resultados indican que
al manejar una µ < 0.05 h-1, la producción de la enzima de interés también disminuye; por lo
que restringir la glucosa a valores próximos al coeficiente de mantenimiento durante el cultivo
puede resultar contraproducente para la actividad de la enzima de interés. No se presentó
restricción por oxígeno, manteniéndose entre 40 y 50% de saturación durante todo cultivo; por
lo que la disminución de la actividad enzimática solo se debió la limitación de la fuente de
carbono.
Finalmente, una prueba preliminar de actividad fructanasa empleando inulina y FA como

sustrato, indicó que la enzima monitoreada en este proyecto de tesis si tiene actividad β-
fructofuranosidasa. Teniendo un ratio de actividad (sacarosa/inulina) de 40 y un ratio de
(sacarosa/FA) de 16. Esto significa que la enzima tiene más afinidad por los FA que por la
inulina, por lo que se trataría efectivamente de una β-fructofuranosidasa más que de una
inulinasa. Arrizon y col [73] realizó pruebas de actividad con esta cepa en cultivos en lote y
sobre inulina obteniendo un ratio (S/I) de 125, lo que da a entender que el cultivo en continuo
podría favorecer la actividad β-fructofuranosidasa. Otros reportes con cultivos en continuo,
obtienen un ratio (S/I) de 15 [92]; lo que concuerda con lo obtenido en este estudio.
93
alimentado 2.
8.5. Monitoreo en línea de la actividad β-fructofuranosidasa
Con el objetivo de conocer la evolución de la producción de β-fructofuranosidasas en un cultivo

en tiempo real, se desarrolló primeramente una metodología para la determinación de la
actividad β-fructofuranosidasa en un sistema de análisis por inyección secuencial (SIA)
diseñado en el laboratorio de Biotecnología industrial; el cual permitió la automatización del
procedimiento. Posteriormente, el SIA fue acoplado a un cultivo en biorreactor para la medición
en línea de la actividad enzimática. A continuación se exponen los resultados.
8.5.1. Metodología para la curva de calibración en el sistema SIA
El primer objetivo fue desarrollar una metodología para generar una curva de calibración, en la
cual se relacionará la respuesta del equipo con la concentración de azúcares reductores en una
muestra. Para la generación de la curva se emplearon 5 concentraciones conocidas de glucosa:
0.0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 g/L. La tabla 8.14 detalla los parámetros programados en el sistema SIA
para la determinación de la concentración de glucosa en una muestra. La metodología se
describe a continuación de manera general:
1. La muestra (m) fue mezclada a volúmenes iguales con reactivo DNS (r) mediante el
ciclo de succión r/m/r/m/r/m.
94
2. La mezcla se envió a la cámara de calentamiento a 95 °C durante 5 minutos (Al mismo
tiempo se realizó el lavado del sistema de agitación).
3. Después la mezcla fue enviada a la cámara de enfriamiento a 0 °C durante 1 minuto.
4. La mezcla anterior fue diluida en relación 1:4 con acarreador agua y homogenizada en
la cámara de mezclado.
5. La muestra fue inyectada al detector donde fue leída a 540 nm.
6. Se repitió el procedimiento anterior para cada punto de la curva.
Debido a que el sistema SIA posee partes metálicas que están en contacto con la muestra durante
los análisis y debido a que el fenol es corrosivo, se decidió no emplearlo en la preparación del
reactivo DNS. Pruebas preliminares indicaron que la coloración final del ensayo, aunque menos
intensa, continúa siendo proporcional a la concentración de azúcares reductores.
El tiempo de succión/inyección se expresan en segundos. La velocidad de flujo del sistema fue

de 20 µl/s. Cada metodología con el sistema SIA se inició con la inyección de una burbuja de
aire, lo que permitió que la muestra no se diluyera con el acarreador, lo que no es deseable. La
implementación de burbujas de aire presentó un inconveniente. Debido a la configuración y
construcción del sistema SIA, fue común que quedaran atrapadas microburbujas de aire en los
resquicios del sistema, que al acumularse se liberaban en el transcurso de la metodología
evitando una adecuada homogenización de la mezcla, dando una lectura final errónea. Por el
contrario, no usar tapones de aire provoca diluciones indeseadas en la muestra, incrementando
el volumen de trabajo fuera de las capacidades del equipo, haciendo inviable la metodología.
Algunos sistemas SIA hacen uso de dispositivos que eliminan las burbujas presentes en el
sistema [105], pero el sistema empleado en este trabajo no contó con dicho tipo de dispositivos.
Tabla 8.14. Protocolo para un punto de la curva de calibración en el SIA

Posición Tiempo,
Descripción Secuencia Succión Inyección
válvula s
Aire 0 8 1 0 2
Reactivo DNS 1 9 1 0 1
Muestra 2 2 1 0 1
Muestra 4 2 1 0 2
Muestra 6 2 1 0 1
A cámara de calentamiento 7 8 0 1 60
95
Lavado mezclador* 8 7 0 1 125
Agitación* 9 22 0 0 15
A cámara de retención* 10 7 1 0 65
A desecho* 11 5 0 1 75
A cámara de enfriamiento 12 8 1 0 30
Enfriamiento 13 8 0 0 60
A cámara de retención 14 8 1 0 30
A cámara de mezclado 15 7 0 1 40
Agitación 16 22 0 0 30
A espectrofotómetro 18 10 0 1 35
Lectura a 540 nm 19 21 0 1 70
Desecho 20 10 0 1 35
Lavado de cámaras** 21 8 0 1 120
A cámara de retención** 22 8 1 0 65
Desecho** 23 5 0 1 70
* Lavado del sistema de mezclado.
** Lavado completo del sistema SIA
El sistema SIA arrojó como respuesta de la lectura una curva de absorbancia contra tiempo. Por
lo tanto, el área bajo la curva es proporcional a la concentración de azúcares reductores en la
muestra. Los datos de cada curva fueron procesados para ser leídos por un programa diseñado
en el software MatLab® R2014b, con el cual se calculó el área bajo la curva para cada condición
(el código del programa se encuentra en el anexo C). Las áreas finalmente fueron analizadas en
el software Statgraphics® Centurion XVI para la obtención de una línea de regresión para la
concentración de glucosa/fructosa liberada en función del área bajo la curva.
La figura 8.29 muestra las curvas generadas por el sistema SIA para cada una de las 5
concentraciones de la curva de calibración. Se realizaron 3 repeticiones de la misma y se puede
apreciar cómo cada grupo de curvas de una concentración dada quedaron próximas entre sí. La
figura 8.30 muestra el ajuste de los datos con una línea de regresión. El coeficiente de regresión
ajustado, R2, fue de 0.997; lo que demuestra que existe un alto grado de correlación entre la
concentración de glucosa en la muestra y la respuesta que arroja el sistema SIA al implementar
la metodología desarrollada para la curva de calibración. Estos resultados demuestran que se
puede desarrollar e implementar una metodología para el monitoreo de la actividad enzimática
basada en la liberación de azúcares reductores, tal como lo es el ensayo que se empleó para la
actividad en este trabajo de tesis.
96
2.0 g/L
1.5 g/L
1.0 g/L
0.5 g/L
0.0 g/L
Figura 8.29. Respuestas generadas por el SIA para la curva de calibración.
R2 = 0.997
Figura 8.30. Curva de calibración SIA.
Debido a los límites impuestos por la curva de calibración, la metodología desarrollada para la
determinación de la actividad fructanasa teóricamente tiene la capacidad de medir la actividad
enzimática en un rango lineal de 0.01-1.4 U/ml. Para actividades fuera de ese rango debe diluirse
o concentrarse la muestra según se requiera.
97
8.5.2. Metodología para la determinación de actividad β-fructofuranosidasa en el
sistema SIA
Para el desarrollo de la metodología para la determinación de la actividad β-fructofuranosidasa

en el sistema SIA se emplearon muestras del primer reactor en lote alimentado. Principalmente,
se utilizaron 2 muestras de 1 hora (A1) y 2 horas (A2) de haber empezado la alimentación y que
poseían una actividad baja; y 2 muestras de 7 horas (B1) y 8 horas (B2) con mayor actividad.
Se procuró diseñar la metodología con las mismas muestras para evitar un factor de variación
adicional. Se realizaron numerosas pruebas en el sistema SIA buscando la secuencia más
apropiada para lograr una metodología automática para la detección de la actividad enzimática
y que fuera lo más repetible posible.
Tabla 8.15. Protocolo para el blanco de la muestra en el SIA

Posición Tiempo,
válvula s
Muestra 0 2 1 0 4
Dilución 1:10 1 7 0 1 40
Aire 2 8 1 0 2
Módulo de dilución 1:10 (si es requerido)
Aire 9 8 1 0 2
Resguardo 10 10 0 1 10
Lavado de cámaras 11 8 0 1 120
Desecho 13 5 0 1 70
Desecho 15 5 0 1 30
Sobrenadante 17 1 1 0 1
A partir de esta línea se ejecutan las secuencias 7 a 23 de la tabla 8.14
98
En la sección 7.12 se describe de manera general la metodología finalmente implementada. La
tabla 8.15 detalla los parámetros programados en el sistema SIA para el blanco de la muestra a
la que se determina la actividad fructanasa. La tabla 8.16 detalla los parámetros programados en
el sistema SIA para la determinación de la actividad β-fructofuranosidasa en una muestra.
Tabla 8.16. Protocolo para la determinación de la actividad β-fructofuranosidasa en el SIA

Posición Tiempo,
válvula s
Muestra 0 2 1 0 4
Dilución 1:10 1 7 0 1 40
Aire 2 8 1 0 2
Módulo de dilución 1:10 (si es requerido)
Aire 9 8 1 0 2
A cámara de incubación 10 10 0 1 35
Desecho 12 5 0 1 55
Lavado sist de mezclado* 13-16 Varios -- -- 280
Lavado cámaras** 17 8 0 1 120
Desecho** 19 5 0 1 70
Desecho** 21 5 0 1 30
Incubación a 50 °C 22 10 0 0 200
A partir de esta línea se ejecutan las secuencias 7 a 23 de la tabla 8.14
* Ver lavado del sistema de mezclado tabla 8.14.
** Lavado de cámaras de calentamiento y enfriamiento
Para realizar diluciones mayores a 10, se agregó un módulo con instrucciones que incluyen el
resguardo de la muestra a diluir, la dilución en sí misma y el lavado del sistema para evitar la
contaminación con muestra no diluida. La tabla 8.17 muestra las instrucciones para incrementar
99
la dilución de la muestra 10 veces; es decir, 1:100. Para diluciones mayores se repitió el módulo,
incrementando la dilución hasta 1:1000.
Tabla 8.17. Protocolo para el módulo de dilución 1:10.

Posición Tiempo,
válvula s
Aire 6 8 1 0 2
A resguardo 7 10 0 1 8
Desecho 9 5 0 1 55
Lavado sistema de mezclado 10 7 0 1 180
Desecho 12 5 0 1 75
Dilución 1:10 14 7 0 1 44
Aire 15 8 1 0 2
Desecho 18 10 0 1 60
En la figura 8.31 se aprecian las curvas de respuesta que se generaron al aplicar la metodología
para la determinación de la actividad fructanasa desarrollada en el sistema SIA. El programa
aplicado en el ejemplo de la figura fue para una dilución 1:100, con lo que se demuestra que es
posible alcanzar la repetibilidad aún en diluciones sucesivas realizadas de manera automática
por el mismo SIA.
Es necesario puntualizar que la repetibilidad observada solo se pudo conseguir cuando no hay
presencia de burbujas de aire no deseadas en el sistema. Como ya se comentó en el apartado de
la metodología de la curva de calibración, las burbujas de aire se emplean para mantener una
muestra aislada del acarreador y evitar diluciones cuando no se desean. Contrariamente a lo
deseado, la aparición espontánea de burbujas evita que haya una adecuada homogenización
donde si la debe de haber; provocando que la respuesta de actividad sea significativamente
menor a la real. Las burbujas se generaron debido a la acumulación en resquicios del sistema y
que el flujo del acarreador no logra desplazar; así como en la cámara de calentamiento, donde
la temperatura provoca evaporación del acarreador y la liberación de gases disueltos.
100
Muestra
Blanco
Figura 8.31. Respuesta SIA para la actividad β-fructofuranosidasa de una muestra.
En la figura 8.32 se observa el impacto que puede tener la presencia de burbujas de aire en etapas
no deseadas durante la metodología para actividad. La muestra del ejemplo es la misma, con la
misma dilución y bajo los mismos parámetros. La presencia espontánea de burbujas puede
afectar en varias etapas del proceso, tales como: la homogenización del sustrato con el
sobrenadante, una inadecuada hidrólisis del sustrato durante la incubación, problemas de
mezclado con el reactivo DNS, reacción de coloración incompleta durante el calentamiento e
interferencias con el espectrómetro durante la lectura; provocando una reducción de la señal de
actividad y afectando la repetibilidad de la técnica.
101
Sin generación de burbujas
Con generación de burbujas
Blanco
Figura 8.32. Respuesta SIA con y sin generación de burbujas espontaneas para la misma muestra.
Un buen ejemplo de lo expresado anteriormente se da en la figura 8.33, donde se ve la

variabilidad que puede presentarse con la misma muestra; en este caso la muestra B2, que
corresponde a la hora 7 del segundo cultivo en lote alimentado. Obsérvese que las burbujas
pueden afectar incluso a la señal del blanco, que en principio no debe tener coloración por la
ausencia de azúcares reductores en el sobrenadante.
Figura 8.33. Repetibilidad en actividad enzimática para la muestra B2.
102
Se realizó una comparación entre los resultados de actividad enzimática arrojados por la
metodología en microplaca y los resultados que se obtuvieron con el procedimiento diseñado en
el sistema SIA. En la tabla 8.18 se muestra el condensado de los resultados.
Tabla 8.18. Comparativa técnica en microplaca vs sistema SIA

MICROPLACA SIA
Actividad Desv Actividad Desv % Error
MUESTRA
U/ml std U/ml std SIA vs Mp
A1 8.45 1.20 7.20 3.56 14.79
A2 10.47 0.80 8.34 2.18 20.39
B1 74.45 1.21 74.50 5.33 0.07
B2 83.70 1.95 83.70 6.50 0.00
La desviación que hay entre las repeticiones de una muestra en el SIA pueden llegar a ser hasta
4 veces mayor a las desviaciones que presenta la técnica en microplaca. Como ya se ha
comentado, esto se debe a la variabilidad a la que se ve sometida la respuesta generada en el
SIA debido a la aparición de burbujas en etapas clave de la técnica. Comparando la actividad
promedio entre las dos técnicas, se aprecia que cuanto menor es la actividad mayor es el grado
de separación, pudiendo ser de hasta el 20% de diferencia como en la muestra A2. Resulta que,
al incrementarse la actividad en la muestra, la diferencia entre los promedios de las 2 técnicas
desaparece; con lo que se demuestra que tanto el sistema SIA, como la metodología
implementada en él, tienen el potencial de ser empleados como un método para la determinación
de la actividad fructanasa en una muestra. Claro está que se requiere mayor desarrollo a nivel
del software y hardware para reducir el nivel de variabilidad, ya que por con el diseño probado
la confiabilidad de los resultados solo se puede conseguir con un número elevado de
repeticiones.
Finalmente, las figuras 8.34 y 8.35 muestran que los resultados de las 2 técnicas no son
estadísticamente diferentes a un nivel de confianza del 95%; es decir, estadísticamente las 2
técnicas ofrecen resultados similares. Aunque es necesario señalar, que esta similitud se debe
principalmente a la alta variabilidad presente en la técnica del sistema SIA.
103
Figura 8.34. Gráfica de medias entre las técnicas de microplaca y SIA. Muestras A.
Pliego y col reportaron una metodología para el monitoreo de la actividad lipasa/esterasa

desarrollado en el mismo sistema SIA empleado en este trabajo de tesis. Reportan una
desviación estándar relativa (RSD) de hasta 8.75% entre los resultados de actividad con la
técnica, y valores de RSD entre 4.29 – 27.79% con la técnica en microplaca [86]. Los valores
son similares para la metodología de actividad fructanasa reportados en este trabajo. Cañizares-
Macías y col reportaron el uso de un sistema FIA (flow injection analysis) genérico con un
termostato acoplado para la determinación azúcares reductores mediante DNS [106]. El sistema
demuestra una alta linealidad entre las curvas de calibración presentadas, pero no validan su
metodología contra otras técnicas de fiabilidad probada; además, el sistema FIA es un equipo
que por diseño es más sencillo que un sistema SIA. Siendo el SIA un equipo más robusto y
versátil.
Figura 8.35. Gráfica de medias entre las técnicas de microplaca y SIA. Muestras B.
104
8.5.3. Monitoreo en línea de la actividad β-fructofuranosidasa de un cultivo en
continuo
Durante la realización del segundo cultivo en estado continuo, el biorreactor fue acoplado al
sistema SIA mediante una tubería conectada a una sonda de cerámica en contacto con el cultivo
(figura 8.36 y 8.37), la cual permitió la extracción de sobrenadante libre de células y su inyección
al SIA para la determinación in situ de la actividad fructanasa.
Figura 8.36. 1. Sistema de cultivo en continuo: bioconsola, biorreactor, balanza, bombas de entrada y
salida, tanque de alimentación y recipiente para desecho. 2. Sistema SIA. 3. Línea de acoplamiento.
105
3
Figura 8.37. 1. Biorreactor. 2. Sistema SIA. 3. Línea de acoplamiento.
Para la toma de muestra directamente del biorreactor para la determinación de la actividad

enzimática fue necesario añadir algunas líneas (tabla 8.19) al inicio del protocolo descrito en la
tabla 8.15 para contemplar el volumen de la línea de acoplamiento y lavados necesarios del
misma. El protocolo para la actividad enzimática (tabla 8.16) no sufrió modificaciones.
Tabla 8.19. Protocolo para succión de sobrenadante desde biorreactor
Descripción Secuencia Válvula Succión Inyección Tiempo

Aire 0 3 1 0 1
Del biorreactor 1 2 1 0 60
Desecho 2 5 0 1 80
Aire 3 3 1 0 1
Desecho 5 5 0 1 80
Aire 6 3 1 0 1
Desecho 8 5 0 1 90
106
La lectura se realizó en concordancia con el muestreo de cada una de las condiciones discutidas
en la sección 8.2.2. Uno de los grandes inconvenientes de los métodos diseñados en el sistema
SIA es que, debido a los ciclos de dilución y limpieza, añadidos al tiempo propio de la
metodología, el análisis de una sola muestra podía llevar más de una hora; sumado a que no
todas las repeticiones fueron útiles debido a la interferencia importante de burbujas, no se
pudieron realizar el número de corridas necesarias por punto para lograr absorber la variabilidad
del método. La tabla 8.20 muestra los resultados generados por el sistema SIA comparados con
los que se obtuvieron en microplaca.
Tabla 8.20. Comparativa técnica en microplaca vs sistema SIA en línea.

MICROPLACA SIA
Actividad Desv Actividad Desv % Error
MUESTRA
U/ml std U/ml std SIA vs Mp
T1 398 30 313 190 -27
T2 126 9 154 39 18
T3 295 30 286 120 -3
T4 65 6 152 23 57
El haber contado con pocas mediciones por punto (entre 2 y 3) imposibilitó el descarte de curvas
pues no había manera de identificar valores atípicos. Por tal motivo, la desviación estándar que
se observa para las mediciones con el SIA son considerablemente altas. Además, el grado de
diferencia con la técnica en microplaca es fluctuante.
Estos experimentos demostraron que es posible desarrollar una metodología que permita el
monitoreo de la actividad β-fructofuranosidasa tanto en línea como fuera de línea. Sin embargo,
aún hay trabajo por realizar tanto en software, hardware y método para lograr la repetibilidad y
precisión que demanda cualquier técnica de medición y monitoreo de actividad enzimática.
Hay reportes donde se logra satisfactoriamente la medición en línea de metabolitos mediante

sistemas SIA, tales como actividad β-galactosidasa [107], azúcares, ácido láctico, proteína y
hasta biomasa [108].
107
9. CONCLUSIONES
 Las técnicas de monitoreo de la cinética de crecimiento tienen un alto grado de
correlación entre sí (> 95%); siendo la correlación entre peso seco y permitividad la de
mayor importancia, pues se puede conocer la cantidad de biomasa de manera confiable
y en tiempo real durante el cultivo.
 La producción de β-fructofuranosidasas es inducida por inulina y fructanos de agave en

cultivos por lote de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1.
 La producción de β-fructofuranosidasas en cultivos de la levadura Kluyveromyces

marxianus SLP1 se incrementó al mantener la concentración de glucosa en valores
residuales.
 Una temperatura de 34 °C y µ = 0.05 h-1 fueron las condiciones de máxima producción

de β-fructofuranosidasas en el rango estudiado. Alcanzando una actividad de hasta 110
U/mg (750 U/ml), que es mayor a lo reportado en la literatura.
 Las β-fructofuranosidasas producidas bajo las condiciones probadas demostró un ratio

de actividad de 40 sobre inulina y de 15 sobre fructanos de agave, lo que demuestra una
mayor afinidad de la enzima por fructanos de agave que por inulina; por lo que si se
trataría de una fructanasa.
 El sistema de análisis por inyección secuencial (SIA) puede ser usado para el monitoreo
de la actividad β-fructofuranosidasa fuera de línea con un alto número de corridas por
muestra, y tiene el potencial de ser usado en línea durante un cultivo con realizando
modificaciones de software y hardware.
108
10. PERSPECTIVAS
 Evaluar la producción de β-fructofuranosidasas en función de la saturación de oxígeno

e inductores (inulina y fructanos de agave) en diferentes sistemas de cultivo.
 Escalar el cultivo en continuo para la producción de β-fructofuranosidasas a partir de la

levadura K. marxianus SLP1 para su implementación a nivel industrial.
 Modelar la producción de β-fructofuranosidasas en función de distintos estados

fisiológicos de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1.
 Diseñar e implementar una estrategia de control con base en las técnicas de monitoreo
en línea: espectroscopia dieléctrica y actividad β-fructofuranosidasa (SIA).
 Modificar el software y hardware del sistema SIA para hacerlo más robusto, preciso y
confiable para la implementación de metodologías analíticas en y fuera de línea.
109
11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] A. Carloni, A. P. F. Turner, and M. C. Flickinger, “Bioprocess Monitoring” in

Encyclopedia of Industrial Biotechnology, John Wiley & Sons, Inc., 2009.
[2] M. Pohlscheidt et al., “Bioprocess and Fermentation Monitoring” in Encyclopedia of

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[102] R. Pinheiro, I. Belo, and M. Mota, “Air pressure effects on biomass yield of two different
Kluyveromyces strains.” Enzyme Microb. Technol., vol. 26, no. 9–10, pp. 756–762, 2000.
[103] G. Buitrago, L. Soto, G. Páez, K. Araujo, Z. Mármol, and M. Rincón, “Continue

production of single cell protein of Kluyveromyces marxianus var. marxianus from
diluited cheese whey” Rev. Tec. Ing. Univ. Zulia, vol. 31, no. D, pp. 107–113, 2008.
[104] A. Margaritis and P. Bajpai, “Continuous ethanol production from Jerusalem artichoke
tubers. I. Use of free cells of Kluyveromyces marxianus” Biotechnol. Bioeng., vol. 24, no.
7, pp. 1473–1482, Jul. 1982.
[105] M. Trojanowicz, Advances in flow analysis. John Wiley & Sons, 2008.
[106] P. Cañizares-Macías, L. Hernández-Garciadiego, and H. Gómez-Ruíz, “An Automated

Flow Injection Analysis Procedure for the Determination of Reducing Sugars by DNSA
Method” vol. 66, no. 3, 2001.
[107] H.-A. Kracke-Helm, L. Brandes, B. Hitzmann, U. Rinas, and K. Schügerl, “On-line

determination of intracellular β-galactosidase activity in recombinant Escherichia coli
using flow injection analysis (FIA)” J. Biotechnol., vol. 20, no. 1, pp. 95–104, 1991.
[108] J. Nielsen, K. Nikolajsen, S. Benthin, and J. Villadsen, “Application of flow-injection

analysis in the on-line monitoring of sugars, lactic acid, protein and biomass during lactic
acid fermentations” Anal. Chim. Acta, vol. 237, pp. 165–175, 1990.
118
12. ANEXOS
A. Metodología para la prueba de actividad proteasa
Soluciones:
- Buffer A: 50 mM citrato de sodio pH 4.5
- Sustrato: 0.5% azocaseína + 50 mM citrato de sodio pH 4.5
- Extracto: muestra a analizar
- Stop: 20% TCA en agua destilada.
Metodología
Blanco Muestra
Mezclar 225 µl de buffer A con 25 µl de Mezclar 225 µl de buffer A con 25 µl de
extracto extracto
Agregar 250 µl de solución stop y agitar Agregar 250 µl de sustrato y agitar
Incubar a 34 °C durante 60 min a 900 rpm. Incubar a 34 °C durante 60 min a 900 rpm.
Agregar 250 µl de sustrato. Agregar 250 µl de solución stop.
Incubar a -20 °C durante 5 minutos. Incubar a -20 °C durante 5 minutos.
Centrifugación a 10,000 g durante 5 minutos Centrifugación a 10,000 g durante 5 minutos
a 4 °C a 4 °C
Recuperar sobrenadante y leer a 366 nm. Recuperar sobrenadante y leer a 366 nm.
Las unidades de actividad proteasa se calculan con la siguiente fórmula:
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎366𝑛𝑚 − 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜366𝑛𝑚
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑎 (𝑈⁄𝑚𝑙 ) =
𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜𝑠𝑖𝑛𝑐𝑢𝑏𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ∗ 𝑚𝑙𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
119
B. Datos del primer cultivo en estado continuo
DO, absorbancia
fructanasa, U/ml
alimentación, g/l
Conteo cámara,
fructanasa, U/g
Temperatura,
Permitividad,
Mconteos/ml
Biomasa, g/l
MUESTRA
Etanol, %
Actividad
Actividad
Mcel/ml
Glucosa
CO2, %
dO2, %
CASY,
pF/cm
O2, %
µ, h-1
°C
T1R1 26 0.05 20 1270 2078 17.7 8.64 3.1 25.727 0.727 11.7 -- 20589 177.87
T1R2 26 0.05 20 1280 2655 19 8.83 2.97 25.391 0.728 16.3 -- 20676 182.53
T1R3 26 0.05 20 1285 2060 20.9 8.94 3.1 25.74 0.878 11.9 -- 14500 129.60
T2R1 34 0.05 20 1050 2297 13 7.11 3.48 21.49 0.149 2.7 -- 114303 812.22
T2R2 34 0.05 20 1015 2081 14.2 6.94 3.53 22.112 0.16 2.6 -- 128628 892.24
T4R2 26 0.4 20 227 231 7.5 3.12 1.78 20.26 1.456 2.6 -- 936 3.25
T2R3 34 0.05 20 1100 2139 14.8 7.05 3.62 22.199 0.149 2.6 -- 79748 562.07
T4R1 26 0.4 20 240 239 6.9 2.92 1.81 20.279 1.448 2.6 -- 1113 2.92
T3R1 34 0.4 20 358 552 8.4 3.31 1.67 20.85 1.857 2.6 -- 4631 15.34
T3R2 34 0.4 20 333 540 8.6 3.25 1.7 20.805 1.801 2.6 -- 11374 37.00
T4R3 26 0.4 20 255 243 7.8 3.05 1.81 20.139 1.496 2.6 -- 614 1.87
T3R3 34 0.4 20 460 502 8.8 3.36 1.69 20.628 1.855 2.6 -- 10653 35.75
T5R1 26 0.05 60 1483 2372 17.5 9.35 3.16 20.082 1.685 100 0.667 13785 128.92
T5R2 26 0.05 60 1465 2350 17.3 9.44 3.19 20.087 1.713 100 0.651 13672 129.09
T5R3 26 0.05 60 1090 2612 15.8 9.17 3.04 19.945 1.782 100 0.717 11823 108.44
T7R1 34 0.05 60 503 302 11.1 6.14 2.45 21.553 1.456 2.7 1.445 12185 74.86
T7R2 34 0.05 60 490 277 11.7 5.93 2.46 21.491 1.45 2.7 1.454 12135 71.95
T7R3 34 0.05 60 518 273 11.6 6.37 -- -- -- -- -- 15837 100.91
T6R1 26 0.4 60 204 227 6.9 2.35 1.11 20.051 2.434 2.6 0.205 5621 13.21
T6R2 26 0.4 60 233 245 6.6 2.16 1.08 20.005 2.339 2.6 0.234 2044 4.42
T6R3 26 0.4 60 255 252 7.3 2.61 1.07 19.884 2.29 2.6 0.127 2455 6.41
120
T8R1 34 0.4 60 458 354 10.1 5.73 2.62 17.92 7.936 2.7 3.222 95 0.55
T8R2 34 0.4 60 435 395 10.8 5.87 2.66 17.849 7.883 2.7 3.103 80 0.47
T8R3 34 0.4 60 470 467 11.4 6.40 2.69 17.639 8.443 2.7 3.289 259 1.66
T9R1 30 0.225 40 620 794 11.2 5.13 2.16 19.48 4.13 2.7 1.837 4532 23.24
T9R2 30 0.225 40 714 917 11 5.21 2.38 19.431 4.194 2.7 1.871 5121 27.12
T9R3 30 0.225 40 738 986 11.9 5.43 2.42 20.186 0.24 2.7 1.832 5697 30.93
T10R1 30 0.225 40 622 1056 11.1 6.55 2.31 18.793 4.296 2.7 1.784 1814 16.54
T10R2 30 0.225 40 673 1142 12.9 6.68 2.73 18.764 4.244 2.7 1.784 1943 17.52
T10R3 30 0.225 40 650 1250 12.7 6.87 -- -- -- -- -- 2149 19.93
T11R1 30 0.225 40 887 1323 13.1 6.79 2.68 17.873 4.209 2.6 1.732 3997 27.04
T11R2 30 0.225 40 768 1243 12.7 6.66 2.85 17.803 4.244 2.7 1.69 4823 32.12
T11R3 30 0.225 40 668 1422 12.9 6.87 2.85 17.761 4.038 2.7 1.76 5025 34.53
T12R1 30 0.225 40 590 965 11.9 5.42 2.33 17.612 4.347 2.7 1.949 4735 23.31
T12R2 30 0.225 40 680 910 10.8 5.25 2.33 17.509 4.246 2.7 1.931 4605 23.29
T12R3 30 0.225 40 575 685 10.4 5.36 2.31 17.573 4.325 2.7 1.941 4842 25.96
121
C. Código del programa para calcular el área bajo la curva de la curva de
calibración SIA
[FileName,PathName]=uigetfile('*.xlsx','Selecciona el archivo de Excel');
addpath(PathName)
dat1=uiimport(FileName);
datos=dat1.data;
a=input('Cuántas corridas se realizaron? '); %Número de puntos de la
curva(suele ser 5)
y=input('Cuántas repeticiones por corrida? '); %Número de veces que se
ejecutó el programa para repetibilidad
z=input('Cuántos conteos tiene cada curva? '); %Número de datos generados
en las curvas
ct=1;
cI=2;
for c=1:y
for f=1:a
for b=1:z
t(f,c,b)=datos(b,ct);
I(f,c,b)=datos(b,cI);
i(b)=t(f,c,b);
j(b)=I(f,c,b);
end
ct=ct+2;
cI=cI+2;
A(f,c)=trapz(i,j);
m(f)=mean(A(f,:));
s(f)=std(A(f,:));
hold on
plot(i,j)
end
end
hold off
A
m
s
legend('0.0 g/l','0.5 g/l','1.0 g/l','1.5 g/l','2.0 g/l')
122
D. Código del programa para calcular el área bajo la curva de muestras para
determinación de actividad β-fructofuranosidasa
addpath(PathName)
datos=dat1.data;
% Este programa presupone que son repeticiones de un mismo punto
a=input('Cuántas corridas se realizaron? ');
z=input('Cuántos conteos tiene cada curva? ');
ct=1;
cI=2;
for c=1:a
for f=1:2
for b=1:z
t(f,c,b)=datos(b,ct);
I(f,c,b)=datos(b,cI);
i(b)=t(f,c,b);
j(b)=I(f,c,b);
end
ct=ct+2;
cI=cI+2;
A(f,c)=trapz(i,j);
m(f)=mean(A(f,:));
s(f)=std(A(f,:));
hold on
plot(i,j)
end
end
hold off
A
m
s
Ar=m(2)-m(1)
legend('Blanco','Muestra')
123
E. Código del programa para calcular la actividad β-fructofuranosidasa de muestras
provenientes de un biorreactor acoplado al sistema SIA
addpath(PathName)
datos=dat1.data;
a=input('Cuántas muestras se tomaron? '); %Número de muestras tomadas del
reactor
z=input('Cuántos conteos tiene cada curva? '); %Cantidad de renglones
generados por lectura
d=input('Qué dilución se empleó?'); %Depende del programa del SIA empleado:
10, 100, 1000 ó más
cTb=1;
cAb=2;
cTm=3;
cAm=4;
for c=1:a
for b=1:z
Tb(c,b)=datos(b,cTb);
Ab(c,b)=datos(b,cAb);
Tm(c,b)=datos(b,cTm);
Am(c,b)=datos(b,cAm);
xb(b)=Tb(c,b);
yb(b)=Ab(c,b);
xm(b)=Tm(c,b);
ym(b)=Am(c,b);
end
cTb=cTb+4;
cAb=cAb+4;
cTm=cTm+4;
cAm=cAm+4;
Ab(c)=trapz(xb,yb);
Am(c)=trapz(xm,ym);
if Am(c)>Ab(c)
Aaj(c)=Am(c)-Ab(c);
else
Aaj(c)=0;
end
ActEnz(c)=Aaj(c)*0.06546*d*0.7401;
m=c-1;
figure (c);
hold on
plot(xb,yb)
plot(xm,ym)
title(['Muestra T',num2str(m)])
legend('Blanco','Muestra')
hold off
end
Aaj
mAaj=mean(Aaj)
ActEnz
mActEnz=mean(ActEnz)
124
F. Memorias: “Sustainable and Integrated use of Agave”. III International
Symposium on Agave. Guadalajara, Jalisco, Mexico. November 3-5, 2016
125
126
127
128
129
130

Edwin Barbosa

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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN

TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.

I.Q. EDWIN JARET BARBOSA HERNÁNDEZ

GUADALAJARA, JALISCO JUNIO 2017.

MONITOREO DE LA PRODUCCIÓN DE β-FRUCTOFURANOSIDASAS A

Presenta: I.Q. Edwin Jaret Barbosa Hernández

Tutor Académico: Dr. Enrique Jaime Herrera López

Tutor en planta: Dra. Anne Christine Gschaedler Mathis

Asesor: M. en C. y T. Alejandro Arana Sánchez

A mi novia Martha, quien me ha dado su apoyo incondicional y me ha motivado a crecer siempre

Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ)

Finalmente, se desarrolló una metodología para la determinación de actividad β-

Finally, a methodology for the determination of the β-fructofuranosidases activity was

En el estudio de la levadura Kluyveromyces marxianus SLP1 para la producción de β-

2.1. Levaduras .................................................................................................................. 18

2.1.1. Generalidades de las levaduras ............................................................................ 18

2.2. Kluyveromyces marxianus ............................................. ¡Error! Marcador no definido.

2.2.1. Generalidades de la Kluyveromyces marxianus ................................................... 19

2.2.2. Metabolismo de Kluyveromyces marxianus ......................................................... 20

2.2.3. Crecimiento y termotolerancia de Kluyveromyces marxianus ............................. 21

2.2.4. Aplicaciones biotecnológicas de Kluyveromyces marxianus ............................... 22

2.3. β-fructofuranosidasas ............................................................................................... 23

2.4. Producción de β-fructofuranosidasas en Kluyveromyces marxianus .................... 24

2.5. Sistemas de cultivo .................................................................................................... 25

2.5.1. Sistemas de cultivo en lote (batch) ...................................................................... 26

2.5.2. Sistemas de cultivo en lote alimentado (fed-batch) ............................................. 28

2.5.3. Sistemas de cultivo en estado continuo ................................................................ 30

2.6. Monitoreo de bioprocesos ........................................................................................ 32

2.6.1. Espectroscopia dieléctrica .................................................................................... 33

2.6.2. Sistema de análisis y conteo de células (CASY®)................................................ 34

2.6.3. Sistema de análisis por inyección secuencial (SIA) ............................................. 35

2.7. Optimización estadística de bioprocesos, MSR. ..................................................... 37

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................... 39

6.1. Objetivo principal ..................................................................................................... 42

6.2. Objetivos específicos ................................................................................................. 42

7.1. Microorganismo ........................................................................................................ 43

7.2. Medios de cultivos ..................................................................................................... 43

7.3. Banco de trabajo del microorganismo .................................................................... 45

7.4. Activación de cepa .................................................................................................... 45

7.5. Preparación del inóculo ............................................................................................ 46

7.6. Preparación del biorreactor e instrumentación ..................................................... 46

7.7. Técnicas analíticas .................................................................................................... 47

7.7.1. Monitoreo de biomasa .......................................................................................... 47

7.7.2. Consumo de sustrato ............................................................................................ 50

7.7.3. Actividad β-fructofuranosidasa ............................................................................ 51

7.8. Cultivos en lote en biorreactor ................................................................................ 52

7.9. Cultivos en estado continuo en biorreactor ............................................................ 53

7.10. Cultivos en lote a temperatura óptima ................................................................... 55

7.11. Cultivos en lote alimentado ...................................................................................... 56

7.12. Monitoreo de actividad β-fructofuranosidasa en línea.......................................... 57

8.1. Cultivos en lote en biorreactor y pruebas con diferentes fuentes de carbono..... 60

8.1.1. Cultivo en lote con glucosa como fuente de carbono........................................... 60

8.1.2. Cultivo en lote con fructosa como fuente de carbono .......................................... 63

8.1.3. Cultivo en lote con sacarosa como fuente de carbono ......................................... 65

8.1.4. Cultivo en lote con inulina como fuente de carbono ............................................ 67

8.1.6. Comparativa entre actividad enzimática y fuente de carbono .............................. 72

8.2. Cultivos en estado continuo en biorreactor ............................................................ 73

8.2.1. Primer cultivo en continuo ................................................................................... 73

8.3. Cultivos en lote a 34 °C en biorreactor ................................................................... 82

8.4. Cultivos en lote alimentado en biorreactor ............................................................ 85

8.4.1. Primer cultivo en lote alimentado ........................................................................ 86

8.4.2. Segundo cultivo en lote alimentado ..................................................................... 90

8.5. Monitoreo en línea de la actividad β-fructofuranosidasa ..................................... 94

8.5.1. Metodología para la curva de calibración en el sistema SIA ............................... 94