Nombre: Juan Daniel Pineda Gutierrez

ID: 0000080915

Biotecnología

Taller relación ADN-proteína y mutaciones

Proteína: Asparaginase.

Plasmido: pet21a.

Preguntas

1. A partir de la secuencia de ADN de la proteína de trabajo (si se aprecia que la secuencia tiene intrones
trabajar con el ARN mensajero en términos de ADN de aquí en adelante, es decir eliminar los intrones),
encontrar cual entre las seis posibilidades de lectura genera la proteína viable correspondiente. Indicar
dentro de la secuencia de nucleótidos en cual posición empieza la secuencia codificante de la proteína y
en cual termina (En algunos casos la proteína empieza en el nucleótido número 1 y en otros caso no, eso
depende de cada secuencia de nucleótidos encontrada, igualmente en algunos casos la proteína
traducida termina en el último nucleótido o a veces antes).
2. Cada 1/10 de secuencia realizar una mutación de transversión (realizar al tiempo las 10 mutaciones) y
comparar las secuencias de proteínas generadas a partir de la secuencia de ADN original y la que tiene
las mutaciones (La comparación es indicar que tipo de mutación en los aminoácidos ocurrió, si
conservativo, no conservativo, o si se generó un codón de stop).
3. Indicar la taxonomía del organismo, como la tabla del código genético que maneja dicho organismo a
nivel genómico y mitocondrial (se encuentra el link de taxonomía dentro de la descripción de la secuencia
original de ADN en el NCBI)

Alineamiento

4. Con la secuencia de proteína original en el NCBI, identificar algunos dominios conservados (secuencia
de aminoácidos presentes en todas las proteínas con función similar) de la proteína luego de realizar un
alineamiento múltiple (alineamiento global con clustal, o en emboss o en el programa CLC con mínimo 10
secuencias). Luego señalar de que bases a que bases dentro de su secuencia de ADN original van
dichos dominios. Las 10 secuencias las buscan realizando Blastp y la búsqueda la limitan a otras familias
de organismos (las 10 secuencias no pueden ser del mismo organismo, deben buscarse de forma manual
de la lista arrojada por Blastp, las 10 secuencias deben tener aproximadamente la misma longitud para
hacer los alineamientos).

Clonación (ver la lista al final de documento que plásmido tiene cada uno)

5. Dado un plásmido, en este caso un vector de expresión describir sus características, es decir

Si puede servir para clonar bacterias u otro sistema como levaduras, o mamíferos.

Definir el marcador de selección, el origen de replicación y los promotores para los anteriores
sistemas.

¿La expresión de la proteína de interés en el vector tendría alguna otro péptido o proteína asociado?

Desarrollo

1. Para la realización del primer punto se utilizó la base de datos NBCI con el objetivo de buscar una bacteria
procariota que tenga la capacidad de transcribir la proteína asignada, en este caso la asparaginasa, para la
realización del trabajo se encontró el siguiente título
‘’Hyphomonadaceae bacterium UKL13-1, complete genome’’, en la cual se evidencia la información
correspondiente a la secuencia de ADN con respecto a la enzima de interés (asparaginasa), una vez dicho lo
anterior se obtiene la siguientes cadenas con respecto a la principal y la complementaria:

ADN cadena principal:

5’ 1 atggcttggg cattggcact tcatggcggg gcagggcctg cacgcggtcg cacctatgac

61 cgggaagaag cccacatggc ggaagttctc aaacgcggtg ccgatatgct ggaagaaggc
121 ttgtccgcac tcgacgtggt ggtctccatg gtgcgagaac tggaggattc aggcttccac
181 gttgcaggca agggtgcctc ggctaatggc aatggtgagt atgagttgga tgctgccgtg
241 atggatggcg cgctcaggcg tgctggcgcg gttggggctt tggttggctt ccgctcgccc
301 attatggccg cgcgcgcggt gatggacgag accccgcatg tgctgctggt tggcgctggg
361 gccaaggctt tcgcccacgg catgggcctt gaagagatag aagaccctgc cgcttattac
421 accccagctg ttcgtcgccc tgtggagccc ggtgagctgg cgcatggcac ggttggtgcg
481 gtggcgcgcg atattgcggg gcgactggca gcggccacct cgactggtgg cctgttgaac
541 aaaatgccgg gccgggttgg cgatacgccc ttgatcgggg cggggacttg ggcggatgag
601 cgcgtggcag tttcctgtac gggccaaggc gaatatttca tgcgcgccgc tgttgctgcc
661 gacatctctg cccgcgtccg ctatggcggg cagactttgg cgtctgcttg cgcgggtgcc
721 ttggccgata tggaaaccca aggcggcgac ggtggcttga tcgccgtgga cgccatgggc
781 aatgtctcca cgccctatgt cagcgaaggc atgaagcgcg ggattgccac ccatacgggg
841 cgctttgagg tgaagacgtt tcggtaa 3’

ADN cadena complementaria:

3’ 1 ttaccgaaac gtcttcacct caaagcgccc cgtatgggtg gcaatcccgc gcttcatgcc

61 ttcgctgaca tagggcgtgg agacattgcc catggcgtcc acggcgatca agccaccgtc
121 gccgccttgg gtttccatat cggccaaggc acccgcgcaa gcagacgcca aagtctgccc
181 gccatagcgg acgcgggcag agatgtcggc agcaacagcg gcgcgcatga aatattcgcc
241 ttggcccgta caggaaactg ccacgcgctc atccgcccaa gtccccgccc cgatcaaggg
301 cgtatcgcca acccggcccg gcattttgtt caacaggcca ccagtcgagg tggccgctgc
361 cagtcgcccc gcaatatcgc gcgccaccgc accaaccgtg ccatgcgcca gctcaccggg
421 ctccacaggg cgacgaacag ctggggtgta ataagcggca gggtcttcta tctcttcaag
481 gcccatgccg tgggcgaaag ccttggcccc agcgccaacc agcagcacat gcggggtctc
541 gtccatcacc gcgcgcgcgg ccataatggg cgagcggaag ccaaccaaag ccccaaccgc
601 gccagcacgc ctgagcgcgc catccatcac ggcagcatcc aactcatact caccattgcc
661 attagccgag gcacccttgc ctgcaacgtg gaagcctgaa tcctccagtt ctcgcaccat
721 ggagaccacc acgtcgagtg cggacaagcc ttcttccagc atatcggcac cgcgtttgag
781 aacttccgcc atgtgggctt cttcccggtc ataggtgcga ccgcgtgcag gccctgcccc
841 gccatgaagt gccaatgccc aagccat 5’
Una vez se tiene la cadena de la proteína se procede a utilizar el programa CLC sequence el cual nos permite
tener los posibles seis marcos de referencia correspondiente a la cadena de ADN trabajada, en este caso se
utiliza la cadena complementaria para poder realizar las posibles traducciones de la proteína, a continuación
se muestra los 6 posibles marcos de referencia obtenidos en el programa a partir de la secuencia de ADN
mostrada:

Primer marco de referencia (+1)

LPKRLHLKAPRMGGNPALHAFADIGRGDIAHGVHGDQATVAALGFHIGQGTRASRRQSLPAIADAGRDVGSNS
GAHEIFALARTGNCHALIRPSPRPDQGRIANPARHFVQQATSRGGRCQSPRNIARHRTNRAMRQLTGLHRATN
SWGVISGRVFYLFKAHAVGESLGPSANQQHMRGLVHHRARGHNGRAEANQSPNRASTPERAIHHGSIQLILTI
AISRGTLACNVEA*ILQFSHHGDHHVECGQAFFQHIGTAFENFRHVGFFPVIGATACRPCPAMKCQCPSH

Segundo marco de referencia (+2)

YRNVFTSKRPVWVAIPRFMPSLT*GVETLPMASTAIKPPSPPWVSISAKAPAQADAKVCPP*RTRAEMSAATAAR
MKYSPWPVQETATRSSAQVPAPIKGVSPTRPGILFNRPPVEVAAASRPAISRATAPTVPCASSPGSTGRRTAGV
**AAGSSISSRPMPWAKALAPAPTSSTCGVSSITARAAIMGERKPTKAPTAPARLSAPSITAASNSYSPLPLAEAP
LPATWKPESSSSRTMETTTSSADKPSSSISAPRLRTSAMWASSRS*VRPRAGPAPP*SANAQA

Tercer marco de referencia (+3)

TETSSPQSAPYGWQSRASCLR*HRAWRHCPWRPRRSSHRRRLGFPYRPRHPRKQTPKSARHSGRGQRCR
QQQRRA*NIRLGPYRKLPRAHPPKSPPRSRAYRQPGPAFCSTGHQSRWPLPVAPQYRAPPHQPCHAPAHRAP
QGDEQLGCNKRQGLLSLQGPCRGRKPWPQRQPAAHAGSRPSPRARP*WASGSQPKPQPRQHA*ARHPSRQ
HPTHTHHCH*PRHPCLQRGSLNPPVLAPWRPPRRVRTSLLPAYRHRV*ELPPCGLLPGHRCDRVQALPRHEVP
MPKP

Cuarto marco de referencia (-1)

MAWALALHGGAGPARGRTYDREEAHMAEVLKRGADMLEEGLSALDVVVSMVRELEDSGFHVAGKGASANGN
GEYELDAAVMDGALRRAGAVGALVGFRSPIMAARAVMDETPHVLLVGAGAKAFAHGMGLEEIEDPAAYYTPAV
RRPVEPGELAHGTVGAVARDIAGRLAAATSTGGLLNKMPGRVGDTPLIGAGTWADERVAVSCTGQGEYFMRA
AVAADISARVRYGGQTLASACAGALADMETQGGDGGLIAVDAMGNVSTPYVSEGMKRGIATHTGRFEVKTFR*

Quinto marco de referencia (-2)

WLGHWHFMAGQGLHAVAPMTGKKPTWRKFSNAVPICWKKACPHSTWWSPWCENWRIQASTLQARVPRLMA
MVSMSWMLP*WMARSGVLARLGLWLASARPLWPRAR*WTRPRMCCWLALGPRLSPTAWALKR*KTLPLITPQ
LFVALWSPVSWRMARLVRWRAILRGDWQRPPRLVAC*TKCRAGLAIRP*SGRGLGRMSAWQFPVRAKANISCA
PLLLPTSLPASAMAGRLWRLLARVPWPIWKPKAATVA*SPWTPWAMSPRPMSAKA*SAGLPPIRGALR*RRFG

Sexto marco de referencia (-3)

GLGIGTSWRGRACTRSHL*PGRSPHGGSSQTRCRYAGRRLVRTRRGGLHGARTGGFRLPRCRQGCLG*WQ
W*V*VGCCRDGWRAQACWRGWGFGWLPLAHYGRARGDGRDPACAAGWRWGQGFRPRHGP*RDRRPCRL
LHPSCSSPCGAR*AGAWHGWCGGARYCGATGSGHLDWWPVEQNAGPGWRYALDRGGDLGG*ARGSFLYG
PRRIFHARRCCCRHLCPRPLWRADFGVCLRGCLGRYGNPRRRRWLDRRGRHGQCLHALCQRRHEARDCHP
YGAL*GEDVSV

Para la secuencia de ADN con respecto al documento se obtuvo que la secuencia correspondiente a la
traducción de asparaginasa es la cuarta secuencia, puesto que al comparar con la teórica presente en el
documento se tiene que su secuenciación es la misma con respecto a la base, otra razón importante es la
presencia de codones de stop en las otras cadenas, las cuales indican aparición de cadenas de nucleótidos
formadas por UGA, UAG y UAA, los cuales generan un paro con respecto a la unión o la formación de
cadenas peptídicas (proteínas), en el caso de los marcos esto se puede ver reflejado en la aparición de un *
por lo que en los marcos restantes existe un stop dentro de la cadena formada antes de llegar a los
nucleótidos requeridos para la formación de asparaginasa y además de que los nucleótidos de inicio con
respecto a esta enzima son diferentes a los reportados en la literatura por lo que se tiene que las cadenas
uno, dos, tres, cinco y seis no corresponde a la traducción de asparaginasa. Una vez obtenido esto, se
procede a ilustrar la cadena que ayuda a la la traducción de la asparaginasa partiendo de la complementaria:

3’ 1 ttaccgaaac gtcttcacct caaagcgccc cgtatgggtg gcaatcccgc gcttcatgcc

61 ttcgctgaca tagggcgtgg agacattgcc catggcgtcc acggcgatca agccaccgtc
121 gccgccttgg gtttccatat cggccaaggc acccgcgcaa gcagacgcca aagtctgccc
181 gccatagcgg acgcgggcag agatgtcggc agcaacagcg gcgcgcatga aatattcgcc
241 ttggcccgta caggaaactg ccacgcgctc atccgcccaa gtccccgccc cgatcaaggg
301 cgtatcgcca acccggcccg gcattttgtt caacaggcca ccagtcgagg tggccgctgc
361 cagtcgcccc gcaatatcgc gcgccaccgc accaaccgtg ccatgcgcca gctcaccggg
 421 ctccacaggg cgacgaacag ctggggtgta ataagcggca gggtcttcta tctcttcaag
481 gcccatgccg tgggcgaaag ccttggcccc agcgccaacc agcagcacat gcggggtctc
541 gtccatcacc gcgcgcgcgg ccataatggg cgagcggaag ccaaccaaag ccccaaccgc
601 gccagcacgc ctgagcgcgc catccatcac ggcagcatcc aactcatact caccattgcc
661 attagccgag gcacccttgc ctgcaacgtg gaagcctgaa tcctccagtt ctcgcaccat
721 ggagaccacc acgtcgagtg cggacaagcc ttcttccagc atatcggcac cgcgtttgag
781 aacttccgcc atgtgggctt cttcccggtc ataggtgcga ccgcgtgcag gccctgcccc
841 gccatgaagt gccaatgccc aagccat 5’

2. En este punto, se debe realizar una mutación de tranversión por cada 86 nucleótidos expuestos en la
cadena de ADN complementaría, además es importante realizar la traducción de la misma y realizar una
breve comparación con respecto a la proteína obtenida sin ningún tipo de mutación, para esto se tiene la
siguiente cadena con modificaciones transversales (cambiar una letra por otra):

3’ 1 ttaccgaaac gtcttcacct caaagcgccc cgtatgggtg gcaatcccgc gcttcatgcc

61 ttcgctgaca tagggcgtgg agacactgcc catggcgtcc acggcgatca agccaccgtc
121 gccgccttgg gtttccatat cggccaaggc acccgcgcaa gcagacgcca atgtctgccc
181 gccatagcgg acgcgggcag agatgtcggc agcaacagcg gcgcgcatga aatattcgcc
241 ttggcccgta caggaaaatg ccacgcgctc atccgcccaa gtccccgccc cgatcaaggg
301 cgtatcgcca acccggcccg gcattttgtt caacaggcca ccagttgagg tggccgctgc
361 cagtcgcccc gcaatatcgc gcgccaccgc accaaccgtg ccatgcgcca gctcaccggg
421 ctccacaggg ctacgaacag ctggggtgta ataagcggca gggtcttcta tctcttcaag
481 gcccatgccg tgggcgaaag ccttggcccc agcgccagcc agcagcacat gcggggtctc
541 gtccatcacc gcgcgcgcgg ccataatggg cgagcggaag ccaaccaaag ccccaaccgc
601 gcctgcacgc ctgagcgcgc catccatcac ggcagcatcc aactcatact caccattgcc
661 attagccgag gcacccttgc ctgcaacgtc gaagcctgaa tcctccagtt ctcgcaccat
721 ggagaccacc acgtcgagtg cggacaagcc ttcttccagc atatcggcac cgcgtctgag
781 aacttccgcc atgtgggctt cttcccggtc ataggtgcga ccgcgtgcag gccctgcccc
841 gccatgaagt gccaatgccc aaaccat 5’

Una vez ilustrados los cambios de sustitución realizado en el ADN original, se tiene que realizar la
comparación con respecto a los aminoácidos que cambian dentro de la cadena, para esto se utilizó el
programa ClustalW, el cual es un software que permite comparar dos tipos de cadenas de ADN, aminoácidos,
entre otros, en este caso se utilizó los aminoácidos, puesto que esto puede proporcionar si la mutación
obtenida con respecto a esta biomoléculas son conservativas o no conservativas, a continuación se muestra
lo obtenido en el programa:

Donde se tiene que cada punto encontrado debajo de la gráfica representa un cambio con respecto a un

aminoácido, en total se obtuvieron 8 cambios con respecto a los aminoácidos originales, cabe resaltar que la
mutación presentada no genera un cambio en el marco de lectura de la secuencia, no obstante genera
 cambios con respecto a los aminoácidos obtenido. Antes de determinar si la mutación tiene efectos o cambios
con respecto a la proteína, se debe de analizar si el cambio con respecto al aminoácido es conservativo o no
conservativo a continuación se muestra una tabla con los datos correspondientes a los aminoácidos
modificados:

Tabla.1 Tipo de aminoácido generado al realizar cambios de nucleótidos.

Aminoácido original Aminoácido mutado Conservativo No conservativo

En este caso este cambio es
conservativo puesto que pertenecen
A (alanina) V(valina) al mismo grupo funcional de -
aminoácidos no polares alifáticos.
En este caso este cambio es
conservativo puesto que pertenecen
K (lisina) R (arginina) al mismo grupo funcional de -
aminoácidos cargados positivamente.
En este caso se tiene un
aminoácido del grupo
cargado positivamente
- (histidina) y cargado
H(histidina) D(aspartato) negativamente (aspartato),
por lo que es un cambio no
conservativo.

En este caso este cambio es

V (valina) A (arginina) conservativo puesto que pertenecen
al mismo grupo funcional de -
aminoácidos no polares alifáticos.
En este caso se tiene un
aminoácido del grupo con
carga (serina) y un grupo
R (arginina) S (serina) - cargado negativamente
(arginina), por lo que es un
cambio no conservativo.
En este caso este cambio es
V (valina) F (felinanina) conservativo puesto que pertenecen
al mismo grupo funcional de -
aminoácidos no polares alifáticos.
En este caso este cambio es
conservativo puesto que pertenecen
N (Asparaginasa) S (serina) al mismo grupo funcional de -
aminoácidos con carga.
Finalmente se tiene que la mutación altera los aminoácidos por lo que se puede obtener una mutación con
cambio de sentido que consiste en sustituir un nucleótido diferente al codificado inicialmente, generando
funciones diferentes en la proteínas a las que normalmente se desempeñaban; en adición se tiene que está
mutación no altera los codones de stop, por lo que solo altera los aminoácidos y proteínas.

3. Taxonomía

Nombre científico: Hyphomonadaceae bacterium UKL13-1.

Sinónimo: Alphaproteobacteria bacterium UKL13-1.

Nombre de explosión heredado: a-proteobacteria.

Linaje: Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Hyphomonadaceae; unclassified

Hyphomonadaceae

Código genético: Al entrar en la base de NCBI, se tiene que para la ’Hyphomonadaceae bacterium UKL13-1
la tabla del código genético que maneja dicho organismo a nivel genómico es la siguiente:

En el caso del código

genético mitocondrial
estos organismos son
procariotas por lo que
dentro de sus organelos
no poseen mitocondria,
debido a esto no
tendrán manera de
codificar código genético mitocondrial.

4.