26/01/2016 Communiqué ­ Matrix­Assisted Laser Desorption Ionization­Time of Flight Mass Spectrometry for the Identification of Bacterial and Yeast Isolates …

Web: MayoMedicalLaboratories.com
E­mail: mml@mayo.edu
Telephone: 800.533.1710
International: 507.266.5700
Values are valid only on day of printing.

Matrix­Assisted Laser Desorption Ionization­
Time of Flight Mass Spectrometry for the
Identification of Bacterial and Yeast Isolates

January 2013

Background

Identification of bacterial and yeast isolates from clinical specimens has traditionally been performed by
examination of both macroscopic and microscopic colony morphology, in addition to characterization by classic
tube biochemical sets. While these methods remain the gold standard for identification, they can be laborious to
perform, requiring both long incubation periods and a significant amount of technologist hands­on time, and the
resulting reactions may ultimately be subjective to interpret. These drawbacks were largely alleviated with the
advent of automated biochemical testing platforms and, later, with the development of molecular­based DNA
sequencing and polymerase chain reaction (PCR) techniques. Though reliable and with an improved turnaround
time compared to conventional identification methods, molecular testing continues to be associated with a
significantly higher cost, and requires advanced user expertise for assay development, performance, and analysis.
These factors altogether limit routine implementation of molecular diagnostic methods to large hospitals and
reference laboratories. Matrix­assisted laser desorption ionization­time of flight (MALDI­TOF) mass spectrometry
(MS) is an automated, molecular platform recently adopted by many clinical laboratories worldwide, which
effectively circumvents many of these drawbacks and offers a rapid, straightforward, and inexpensive method for
identifying bacterial and fungal organisms.

The Basic Principles of Mass Spectrometry

At its core, mass spectrometry is a semiquantitative, analytic method traditionally used to elucidate the
composition or molecular structure of an unknown sample. This characterization is performed entirely by the mass
spectrometry instrument and is based on the acquisition and analysis of mass and charge values from individual,
ionized sample molecules. Mass spectrometry instruments are composed of 3 basic modules: an ionization
chamber, a mass analyzer, and an ion detector (Figure 1). Once placed in the ionization chamber, the unknown
sample, which may be in a gas, liquid, or solid phase, is pulsed with an energy source. This energy serves dual
functions: ionization of individual molecules and desorption of solid or liquid phase samples into the gas phase. The
vaporized sample is next directed into and accelerated through the mass analyzer, which separates ions based on
their mass­to­charge ratio. Upon emerging from the mass analyzer, ionized particles collide with the ion detector,
which measures both the mass and charge of each molecule as derived from their individual force and time to
impact. These signals are converted to an electrical output and ultimately depicted to the user in a mass spectrum,
which graphs the relative abundance of each detected ion on the y­axis versus its mass­to­charge ratio on the x­
axis (Figure 1). The composition or structure of the unknown sample is subsequently derived from careful
interpretation and analysis of the ion peaks.

http://www.mayomedicallaboratories.com/articles/communique/2013/01­maldi­tof­mass­spectrometry/ 1/7
26/01/2016 Communiqué ­ Matrix­Assisted Laser Desorption Ionization­Time of Flight Mass Spectrometry for the Identification of Bacterial and Yeast Isolates …

Figure 1. Mass Spectrometry Instrument Design

Many different types of mass spectrometry instruments are available, primarily differentiated by their method of
sample ionization and the type of mass analyzer used. Selection among the various instruments is largely
dependent on the phase of the input sample, in addition to the physical and chemical properties of the unknown
molecules: their molecular weight, thermal stability, side­chain modifications, etc. Each of these properties strongly
influence the choice of ionization method and the type of mass analyzer best suited to separate the ionized
molecules. Prior to the 1980s, mass spectrometry technology was largely restricted to the analysis of small,
thermostable compounds able to withstand the harsh electric ionization techniques available at the time. Larger
polypeptides and other biomolecules were found to rapidly degrade under these conditions, which significantly
impedes their characterization. With the onset of the proteomics era, however, research into alternative mass
spectrometry methods was accelerated and resulted in the development of low energy or “soft ionization”
techniques — the principle behind MALDI­TOF MS. The major advantage of this method is its ability to ionize and
desorb high molecular weight biomolecules into the gas phase while preserving their intact state. Based on these
general considerations, MALDI­TOF MS has emerged as the premier method of choice for the analysis and
identification of large polypeptides and even whole microorganisms.

Basic Principles of MALDI­TOF Mass Spectrometry

Sample characterization by MALDI­TOF MS begins by spotting the sample (either solid or liquid) into a defined
indentation on a solid target support plate (Figure 2). The composition of the input sample can vary greatly from
purified protein to whole­cell microorganisms. Following application onto the target plate, the sample may be further
treated, depending on composition, but is ultimately overlaid with a chemical matrix which must dry completely prior
to analysis. The matrix is essential for the “soft ionization” process and is chosen for both its efficient desorption
into the gas phase and for its ability to effectively absorb the majority of pulsed ionizing energy, thereby protecting
sample molecules from fragmentation. A number of matrix compounds have been developed and are each
composed of small (<1000 Dalton), acidic molecules dissolved in an organic solvent. An approximately 10 to 1 ratio
of matrix to sample is used for MALDI­TOF MS preparation to ensure efficient dilution and protection of sample
molecules from fragmentation. Once dried, the prepared target plate is placed into the ionization chamber where
each sample is irradiated with 240 brief pulses of energy from an ultraviolet nitrogen laser (337 nm). This process
desorbs individual sample and matrix molecules from the target plate into the gas phase, with the majority of energy
absorbed by the matrix, which becomes ionized with a single positive charge. This positive charge is subsequently
transferred from the matrix to native sample proteins through their random collision in the gas phase.

http://www.mayomedicallaboratories.com/articles/communique/2013/01­maldi­tof­mass­spectrometry/ 2/7
26/01/2016 Communiqué ­ Matrix­Assisted Laser Desorption Ionization­Time of Flight Mass Spectrometry for the Identification of Bacterial and Yeast Isolates …

Figure 2. Matrix­Assisted Laser Desorption Ionization ­ Time of Flight Process

The cloud of ionized proteins is next funneled through a positively charged, electrostatic field which accelerates the
molecules into the time of flight (TOF) mass analyzer. The TOF chamber is an empty, pressurized tube that allows
ions to travel down a field­free region toward the ion detector. The velocity at which individual ions fly through the
TOF chamber is dependent on their mass­to­charge ratio. Because each sample analyte has an identical, single
positive charge, ions are ultimately separated based on their difference in mass — heavier ions will travel through
the mass analyzer at a slower velocity, compared to lighter ions. As the ions emerge from the TOF mass analyzer,
they collide with the ion detector, which measures their charge and time to impact (Figure 2). Based on standards
of known mass, the time to impact for each unknown analyte is converted into a mass­to­charge ratio, which is
depicted on a mass spectrum.

Each generated mass spectrum can be thought of as a unique protein “fingerprint” or a protein profile of the
unknown sample. Specifically for analysis of microorganisms, MALDI­TOF MS will detect the most abundant
proteins over a predefined mass range (typically 2 to 20 kDa). These are mostly intracellular, hydrophilic proteins
and are primarily ribosomal components or other noncatalytic, structural complexes. Based on this protein profile,
identification of the unknown microorganism is performed by computerized comparison of the acquired spectra to a
database of reference spectra composed of previously well­characterized isolates.

MALDI­TOF Mass Spectrometry Workflow in the Clinical Microbiology Laboratory

Following extensive validation studies, our laboratory chose to implement the Bruker Biotyper MALDI­TOF MS
system for routine identification of bacterial and yeast isolates from culture.1­5 The Bruker Biotyper system includes
the Microflex LT/SH MS instrument and 2 software programs: FlexControl for acquisition of protein spectra and
Biotyper real­time classification (RTC) for automated spectral analysis.

MALDI­TOF MS has dramatically altered the traditional workflow and isolate processing in both our bacteriology
and mycology laboratories (Figure 3). Currently, we only perform MALDI­TOF MS analysis from isolated bacterial
and yeast colonies, therefore clinical specimens continue to be plated to solid media and are observed for growth.
As soon as an isolated colony is large enough for visualization, it can be picked for MALDI­TOF MS processing.
The amount of colony material required for analysis is minimal, with a single colony being sufficient for complete
identification. With a small inoculating loop, the colony is removed and smeared into a well on the target plate,
which depending on the plate design, can accommodate at least 24 samples. To release the intracellular proteins
necessary for analysis, formic acid is added directly to each sample on the target plate to perforate intact cells, and
this crude preparation is allowed to dry. The chemical matrix is subsequently overlaid and dried, at which point the
target plate is ready for analysis. This process is referred to as the formic acid­based, direct on­plate preparation
method and depending on room humidity, has a total preparation time of 10 to 20 minutes for 24 samples. Notably,
potentially hazardous organisms (eg, Brucella and Francisella species) are not processed using this method to
avoid aerosolization and minimize the risk for laboratory acquired infections; such agents are prepared using a tube
extraction process. Following placement of the target plate into the mass spectrometer, the remaining processing
and analysis steps are entirely automated.

http://www.mayomedicallaboratories.com/articles/communique/2013/01­maldi­tof­mass­spectrometry/ 3/7
26/01/2016 Communiqué ­ Matrix­Assisted Laser Desorption Ionization­Time of Flight Mass Spectrometry for the Identification of Bacterial and Yeast Isolates …

Figure 3. Matrix­Assisted Laser Desorption Ionization­Time of Flight Mass Spectrometry Workflow

Result Interpretation and Reporting

As each spectral profile is acquired, it is analyzed against a database of reference spectra, referred to as the
MALDI Biotyper Library (MBL), in a real­time manner via the Biotyper RTC software program. This database is a
compilation of spectra generated from previously identified and well­characterized bacterial and fungal isolates.
Through proprietary algorithms, the level of similarity between the acquired, unknown spectra and MBL entries is
determined and reported to the user as a score, ranging from 0.0, indicating no similarity, to 3.0, indicative of a
perfect match. The scores and identities of the top 10 closest matching reference spectra are provided for each
tested sample. Within the 0­3 score range, the manufacturer has established cutoff intervals to provide the user
with a confident identification to either the genus level (scores of ≥1.700 – 1.999) or to the species level (scores
≥2.000) (Table 1). Any isolate scoring <1.700 is considered as “no identification.” In our laboratory, these
manufacturer­determined cutoff values are currently applied towards the identification of gram­negative bacilli and
gram­positive cocci. For non­diphtheriae corynebacterium species and yeast, our laboratory has independently
validated decreased cutoff values for the genus and species level identification of these organisms: ≥1.500 – 1.699
and ≥1.700, respectively.

http://www.mayomedicallaboratories.com/articles/communique/2013/01­maldi­tof­mass­spectrometry/ 4/7
26/01/2016 Communiqué ­ Matrix­Assisted Laser Desorption Ionization­Time of Flight Mass Spectrometry for the Identification of Bacterial and Yeast Isolates …
Currently, the top­scoring MBL database entry is used for final identification of unknown yeast isolates to either the
genus or species level, depending on the acquired score value in relation to our established cutoff
criteria.5Identification of gram­negative bacilli, gram­positive cocci and non­diphtheriae Corynebacterium species is
likewise based on the top­scoring MBL entry. However, to further improve the identification specificity of these
organisms, we also require at least a 10% difference in scores between the top MBL reference spectra and the next
different genus or species entry (internal Mayo Clinic validation studies). Isolates scoring below the cutoff for
genus­level confidence are reextracted and reanalyzed by MALDI­TOF MS on the same day. If repeat analysis fails
to provide at least a genus­level score, isolates are identified by an alternative method, such as 16S ribosomal
RNA gene sequence analysis.

Performance of the Bruker Biotyper MALDI­TOF Mass Spectrometry System

Our evaluation of the Biotyper system was performed with single colony isolates from both clinical specimens and
archived organisms representing less commonly recovered species. Each isolate was tested in parallel using the
Bruker MALDI­TOF MS system and traditional identification techniques, which included identification of gram­
negative bacilli by the BD Phoenix automated microbiology system (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) and
biochemical characterization of other bacteria and yeast using conventional tube­biochemical sets or API strips
(BioMérieux, Marcy l’Etoile, France). For our initial MALDI­TOF MS analyses, gram­negative bacilli were prepared
by the direct, on­plate method without the use of formic acid, while all other evaluated groups of organisms (ie,
cocci, non­diphtheriae Corynebacterium species, and yeast) were prepared using the manufacturer­recommended
tube extraction protocol.2­4 This extraction process involves submerging the isolate in ethanol for inactivation,
followed by decanting the ethanol and incubating the sample in a solution of formic acid and acetonitrile. This
method is thought to more efficiently release intracellular proteins from both gram­positive bacteria and yeast, which
typically have a more tenacious external cell wall. The mixture is next pelleted and an aliquot of the supernatant
containing the released intracellular proteins is spotted onto the target plate, allowed to dry and overlaid with matrix.
Notably, the processing time for this method can range from 45 minutes to 1 hour for 24 samples, which is
significantly longer than the direct, on­plate preparation method for the same number of isolates. Regardless of the
extraction method used, discrepant results between MALDI­TOF MS and our standard identification methods, were
resolved by sequencing the 16S rRNA gene, gyrB or the rpoB for bacteria and the D2 region of the 28S rRNA gene
for yeast.

Using the aforementioned genus and species level cutoff criteria, we evaluated 900 bacterial and yeast isolates,
with an overall correct identification rate of 94.2% to the genus and 79.2% to the species levels (Table 2). While
genus level identification was above 90% for most of the evaluated organism groups, the lower species level
identification percentage was primarily driven by the gram­positive cocci (69.5%). This decreased rate of species
level identification may be explained by the absence of representative reference spectra in the MBL for certain
uncommon isolates. Alternatively, despite the presence of 1 or 2 MBL reference spectra for a particular species,
these may not be sufficient to capture the protein variability that may exist within different isolates of the same
species.  These limitations can, however, be overcome by continued manufacturer improvement of the database,
alongside user­based supplementation of the MBL with reference spectra from laboratory characterized isolates.

In an effort to further streamline isolate identification and decrease turnaround time for MALDI­TOF preanalytical
processing, we have validated and implemented the formic acid­based, direct on­plate preparation method for all of
the aforementioned groups of organisms. Through our published data and internal validation studies, we have
shown that this process leads to equivalent identification percentages for gram­negative bacilli, gram­positive
cocci, Corynebacterium species, and yeast, compared to processing of these isolates using either the tube or the
on plate without formic acid extraction methods (Table 3).2 Additionally, the on­plate preparation minimizes the risk
for sample misidentification during processing and is a significantly more environmentally friendly extraction
method, reducing the use of additional tubes and chemical agents (eg, ethanol, acetonitrile, formic acid).

http://www.mayomedicallaboratories.com/articles/communique/2013/01­maldi­tof­mass­spectrometry/ 5/7
26/01/2016 Communiqué ­ Matrix­Assisted Laser Desorption Ionization­Time of Flight Mass Spectrometry for the Identification of Bacterial and Yeast Isolates …

MALDI­TOF Mass Spectrometry Misidentifications

Our validation studies indicate that certain closely related bacterial species cannot be differentiated by MALDI­TOF
MS, regardless of the system manufacturer. Most notable is the inability of this technology to reliably
distinguish Escherichia coli from Shigella species or Streptococcus pneumoniae from Streptococcus mitis group
species.2,4 These pairs of organisms are closely related in genetic and protein composition, leading to an inability to
collect unique reference spectra for either species (at least as currently configured). To avoid potential
misidentification of these organisms, we routinely perform quick, confirmatory biochemical assays (eg, quick indole
for Echerichia coli and bile solubility for Streptococcus pneumoniae) prior to finalizing isolate identifications.

Despite the ability of MALDI­TOF MS to identify other closely related organisms to the species level, many names
of the identified species would be unfamiliar to providers, since the individual organisms have conventionally been
considered to belong to and are reported as a specific complex or group (eg, Burkholderia
cepacia complex, Klebsiella pneumoniae complex, Pseudomonas fluorescens group, etc). To minimize confusion,
we have decided to maintain our established nomenclature rules and report isolate identification to the complex
level, as appropriate (eg, Enterobacter cloacae or Enterobacter ludwigii are reported as Enterobacter
cloacae complex). Finally, we have not encountered similar clinically significant misidentifications among yeast
isolates, which are all reported without additional confirmatory testing.

Advantages and Limitations of Microbial Identification by MALDI­TOF Mass Spectrometry Analysis

Perhaps the greatest advantage of MALDI­TOF MS technology over traditional diagnostic methods is the ability of
this system to identify a large number of unknown isolates in a significantly reduced time span, using fewer
laboratory resources (eg, media, biochemicals) and at a lower cost to the patient (Table 4).3,5 Additionally, the
manufacturer­supplied spectral library is currently an open database and can be supplemented with reference
spectra from laboratory­characterized clinical isolates, allowing the user to expand the database alongside routine
library updates provided by the manufacturer. Among the main limitations of this system are the need for isolated
colonies prior to analysis and the current inability of our laboratory to perform direct­from­specimen testing. Finally,
this technology does not provide antimicrobial susceptibility information alongside organism identification. While
research is ongoing in this area, to our knowledge the developed methods have not yet been applied to a clinical
laboratory setting. Other advantages and limitations of MALDI­TOF MS technology are outlined in Table 4.

http://www.mayomedicallaboratories.com/articles/communique/2013/01­maldi­tof­mass­spectrometry/ 6/7
26/01/2016 Communiqué ­ Matrix­Assisted Laser Desorption Ionization­Time of Flight Mass Spectrometry for the Identification of Bacterial and Yeast Isolates …

Conclusion

The field of diagnostic microbiology is rapidly evolving into a more streamlined and automated process for organism
identification. The most recent driving force of this transition has been the introduction of MALDI­TOF MS into the
clinical microbiology laboratory. Identification of unknown isolates by this technology is based on the acquisition of
unique protein profiles from isolated colonies and comparison of this data to a library of reference spectra derived
from well­characterized isolates. Our laboratory has shown that this is a rapid and inexpensive method able to
accurately identify isolates within minutes, compared to the more time­consuming methods associated with other
automated microbial identification systems and the potentially subjective nature of classic biochemical analyses.
The substantially decreased turnaround time for isolate identification may ultimately benefit patient care by enabling
health care providers to make clinical decisions in a much more timely fashion.

References
1.  Alatoom A A, Cazanave CJ, Cunningham SA, et al:. Identification of non­diphtheriae Corynebacterium by use of matrix­assisted laser desorption
ionization­time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 2012 Jan;50(1):160­163
2.  Alatoom AA, Cunningham SA, Ihde SM, et al: Comparison of direct colony method versus extraction method for identification of gram­positive cocci by
use of Bruker Biotyper matrix­assisted laser desorption ionization­time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 2011 Aug;49(8):2868­2873
3.  Dhiman N, Hall L, Wohlfiel SL, et al: Performance and cost analysis of matrix­assisted laser desorption ionization­time of flight mass spectrometry for
routine identification of yeast. J Clin Microbiol 2011 Apr;49(4):1614­1616
4.  Saffert RT, Cunningham SA, Ihde SM, et al: Comparison of Bruker Biotyper matrix­assisted laser desorption ionization­time of flight mass spectrometer
to BD Phoenix automated microbiology system for identification of gram­negative bacilli. J Clin Microbiol 2011 Mar;49(3):887­892
5.  Theel ES, Schmitt BH, Hall L, et al: Formic acid­based direct, on­plate testing of yeast and Corynebacterium species by Bruker Biotyper matrix­assisted
laser desorption ionization­time of flight mass apectrometry. J Clin Microbiol 2012 Sep;50(9):3093­3095
6.  Manual of Clinical Microbiology. Vol 1. Tenth edition. Edited by J Versalovic, KC Carroll, G Funke, et al: Washington, DC, ASM Press, 2011

Authored by Elitza S. Theel, PhD

http://www.mayomedicallaboratories.com/articles/communique/2013/01­maldi­tof­mass­spectrometry/ 7/7