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Testes Laboratoriais aplicados à Imunologia Clínica

Testes Laboratoriais Aplicados à Imunologia Clínica

Imunoensaios:
Detecção, quantificação e caracterização de anticorpos (Acs) ou
de antígenos (Ags) e seu uso como ferramenta para pesquisa e
diagnóstico.

 Reações de precipitação
 Técnicas envolvendo separação eletroforética
 Técnicas envolvendo a dispersão da luz
 Reações de aglutinação
Imunodiagnóstico
 Ensaios com marcadores fluorescentes
Diagnóstico laboratorial por
 Ensaios quimioluminescentes
meio de técnicas imunológicas
 Ensaios com marcadores radioativos
 Ensaios luminescentes
 Ensaio de marcadores enzimáticos
 Enzimaimunoensaio
 Ensaios líticos
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Interação Antígeno- Anticorpo


 Associação biomolecular semelhante à interação
enzima/substrato ou de hormônios/receptores.

 A anticorpo não provoca nenhuma alteração química


irreversível na molécula de antígeno, podendo o produto
formado (Ag-Ac) se dissociar em nos seus 2 componentes; isto
é Ag e Ac livres/solução/suspensão.

antígeno
imunocomplexo
anticorpo
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Especificidade Resposta de Anticorpos


Habilidade do Ac
distinguir seu
Isotipo
imunógeno de
A composição
outros Ag.
determina a
função dos Ac e
Afinidade os locais onde
Força de ligação do são encontrados
Ag com o Ac, em
um único sítio.

Avidez
Força total de
ligação, nos dois
sítios

Reações Cruzadas
É a habilidade de uma população de moléculas de Acs reagirem com mais de um Ag.
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Isotipo
A composição
determina a
função dos Ac e
os locais onde
são encontrados
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Imunoensaios

Reagentes marcados
Reagentes não marcados
• ELISA
• Reação de precipitação • Imunofluorescência
• Reação de aglutinação • Western Blotting

Os ensaios com reagentes não marcados possuem sensibilidade de detecção


menor, pois é necessário que se forme grande quantidade de imunocomplexos
para que se processe a visualização do fenômeno.

A utilização de sistemas de marcação de reagentes torna possível a amplificação do


sinal final e detecção através de instrumentos, elevando a sensibilidade à ordem de
10-19/10-21.
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Reações de Precipitação - IMUNOPRECIPITAÇÃO

 Combinação de antígeno solúvel com anticorpo solúvel para


formar complexos insolúveis que são visíveis.
 Molécula antigênica tem que ser multivalente (número de epitopo)
 Permite quantificação.

Ag multivalente
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A reação entre
antígeno e anticorpo é
reversível.

REVERSIBILIDADE DAS
REAÇÕES: excesso de
um dos reagentes pode
induzir a dissociação do
precipitado formado, Máximo de
causando erros de precipitado
interpretação dos
resultados.
Atenção: PRÓ-ZONA!
FALSO NEGATIVO PARA
PESQUISA DE Ac.

Curva parabólica que mostra a quantidade de imunocomplexo quando adicionada quantidade


crescente de antígeno a uma quantidade constante de anticorpo (Heidelberger e Kendall,
1935).
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Reações de Precipitação

Visualização do precipitado em meio líquido é difícil: soro com Ac e


soluções com Ags turva e com colorações próprias.
Automação: turbudimetria e nefelometria.
Técnicas manuais de precipitação em uso:
 Utilizam meios gelificados (ágar ou gel de agarose) que facilitam a
leitura e reduz volume necessário para interação.
 Requerem períodos de horas a dias para migração molecular e
formação do imunocomplexo.
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Reações de Precipitação

1) IMUNODIFUSÃO:
 Baseia-se na difusão de substâncias solúveis por movimentos moleculares ao
acaso em meio gelificado (ágar ou gel de agarose).
 Moléculas livres = difusão  formação de imunocomplexos de elevado peso
molecular = imobilização no gel  turvação nítida (imunocomplexo).
turvação nítida (imunocomplexo)

Sem turvação = negativo


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Reações de Precipitação

1) IMUNODIFUSÃO:
 Imunodifusão Simples: um dos componentes está fixado ao gel enquanto o
outro migra até formação do imunocomplexo (linear ou radial).
 Imunodifusão Dupla: os dois elementos migram simultaneamente, um em
direção ao outro (migração linear ou radial).
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Reações de Precipitação

Imunodifusão Simples Linear (Oudin)


 Ac incorporado ao meio gelificado e a mistura colocada em um tubo.
 Após gelificar acrescenta Ag no topo da coluna em concentração superior ao do Ac
 Sela os tubos e mantem a temperatura constante.
 Observados em uma semana quanto à formação da linha de precipitação (área de
equivalência).
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Reações de Precipitação

Imunodifusão Simples Linear


 Essa reação pode ser utilizada, por
exemplo, para a detecção de
imunoglobulinas do soro humano que
se precipitam a baixas temperaturas
(crioglobulinas).
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Reações de Precipitação

 Imunodifusão Simples Radial


• Quantidade conhecida de Anticorpo
(específico) em gel colocada em placa ou
lâmina.
• Em orifícios adiciona-se diferentes
concentrações de Ag (Ag teste + Ag padrão
quantidade conhecida).
• Ac é fixo no gel e quem migra (difunde) é o Ag
(de acordo com seu tamanho  molécula
maior demora mais a difundir).
• Quando Ag/Ac encontram zona de
equivalência forma-se halo bem definido.

• Interpretação: diâmetro do anel é


proporcional à concentração do antígeno.
Requer rigorosa padronização das condições e reagentes (pureza e
concentração do gel, concentração do Ac incorporado ao gel,
espessura do gel tamanho do orifício, entre outras.
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Reações de Precipitação

 Imunodifusão Simples Radial


 halo de precipitação circular em torno do orifício da amostra.
• Pela comparação do diâmetro do halo da amostra-teste com padrões de
concentração conhecida (curva padrão), estabelece a concentração do analito na
amostra.

• Utilizada principalmente na quantificação de


proteínas como imunoglobulinas (IgG,IgA e IgM),
fatores do complemento, proteínas de fase aguda
e proteínas de transporte.
Exemplo de utilização: dosagem de Ig numa
placa disponível no mercado.
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Reações de Precipitação

Imunodifusão Dupla Radial (Outchterlony)


 Ag e Ac difundem-se radialmente em todas as direções a partir de orifícios em
meio gelificado.
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Reações de Precipitação

Imunodifusão Dupla Radial (Outchterlony)

Ag e Ac formam arcos de
precipitação (18 a 24h)
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Reações de Precipitação

Imunodifusão Dupla Radial (Outchterlony)


 Pode comparar simultaneamente vários sistemas antigênicos contra o mesmo
sistema de Ac.
 Técnica qualitativa ou semi-quantitativa de baixa sensibilidade.
 Requer uso de extrato antigênico em concentração elevada (mg/dL).
 Utilizada na caracterização inicial de extratos brutos de Ag.
 Vem sendo substituída por técnicas de eletroforese em gel e immunoblot.
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Reações de Precipitação
2) IMUNOELETROFORESE:

 Combina eletroforese e difusão dupla em meio gelificado, em tempos diferentes,


com alta resolutividade.
 ELETROFORESE: evidencia componentes ou frações antigênicas por diferença de
carga elétrica nesses componentes. Como várias moléculas podem apresentar
cargas elétricas próximas, a técnica vai juntá-las em pontos próximos.
 IMUNOELETROFORESE:
 permite a discriminação dos componentes da mistura utilizando a
especificidade das Acs para cada subfração diferenciada pela carga.
 Método qualitativo
 Utilizado para caracterização de proteínas: detecta anormalidades estruturais e
alterações na concentração.
 Aplicação mais comum: estudo de gamopatias monoclonais (mieloma
múlitplo)
 Interfere na corrida: carga, tamanho e concentração.
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NEFELOMETRIA

Uma das características das soluções coloidais é a pronunciada dispersão


de luz.
Quando um feixe de luz incidente atravessa um meio contendo partículas,
essas interferem com a passagem de luz, fazendo com que seja dispersa em
todas as direções.
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NEFELOMETRIA

Os ensaios nefelométricos se
baseiam no princípio de que um
imunocomplexo em solução dispersa
luz em vários ângulos em relação à
luz incidente.
Os raios de uma fonte de luz de alta
intensidade (lâmpadas de halogênio,
laser) são dirigidos por lentes
focalizadoras e passam através da
amostra contendo imunocomplexos.
Os raios que emergem em ângulo de
70º são dirigidos por outra lente para
o detector eletrônico.
O sinal é matematicamente
relacionado à concentração do Ag ou
Ac.
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TURBIDIMETRIA
NEFELOMETRIA

Mesmas condições do sistema


Totalmente automatizada. nefelometria.
De fácil realização, rápida e DIFERENÇA: sinal de detecção é em
precisa. absorbância e não a intensidade de
Utiliza pequenos volumes da luz dispersa.
amostra. Não precisa de equipamento especial.
Sensibilidade para medida de Leitura em espectrofotômetros.
proteínas de significado clínico. Mesmas aplicações.
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