PRACTICA Nº 2

PRODUCCIÓN DE BIOMASA
Melissa García Torres

PRODUCCIÓN DE BIOMASA

1. INTRODUCCION

Desde tiempos antiguos, el ser humano ha aprovechado la actividad metabólica de diversos

microorganismos para la obtención de productos tales como el pan, queso y otros artículos
fermentados. Al pasar los años, se descubrieron cada vez más aplicaciones para las distintas rutas
metabólicas que presentan las numerosas especies de microorganismos, cuyos productos pueden
llegar a poseer un elevado valor económico, si es que llegaran a obtenerse efectivamente.

Industrialmente los microorganismos son usados en la obtención de enzimas, vitaminas,

colorantes, biomasa (para uso industrial y como fuente proteica), productos alimenticios, entre
otros. Actualmente, uno de los principales objetivos de la biotecnología es mejorar los procesos
de fermentación, disminuyendo los costos de producción y aumentando la productividad y
rendimiento de estos, por este motivo se han estudiado desechos orgánicos procedentes de la
agroindustria, que no sólo resultan ser muy económicos, sino a su vez actúan como excelentes
fuentes nutricionales.

La producción de biomasa es un proceso que puede verse afectado por condiciones ambientales
(pH, temperatura, aireación, humedad) o también por factores metabólicos y fisiológicos propios
de los microorganismos, cuando carecen de alguna fuente nutricional o por el contrario presentan
exceso de alguna de estas. En el presente laboratorio se realizará la reproducción celular para la
obtención de biomasa con fines industriales, utilizando un medio de cultivo específico y un
desecho de la agroindustria.

2. OBJETIVOS
2.1. Conocer las operaciones y parámetros a controlar antes y durante la reproducción
celular, en un sistema de fermentación por lote discontinuo.
2.2. Hallar las curvas de producción celular y consumo de sustrato, en un sistema de
fermentación por lote discontinuo
2.3. Determinar la concentración de biomasa en g/L, obtenido en la fase logarítmica,
comparando los resultados obtenidos en cada medio de cultivo empleado.

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3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. MATERIALES
3.1.1. Materias primas
- Microorganismo: levadura Saccharomyces cerevisiae o bacteria ácido láctica
- Medio de cultivo específico: para levadura (3.1.2.) o para bacterias ácido lácticas (Caldo
MRS)
- Medio de cultivo obtenido a partir de un residuo de agroindustria: Melaza, néctar,
gaseosa, desechos amiláceos, suero de leche.

3.1.2. Reactivos
Composición del caldo de cultivo selectivo para crecimiento de Saccharomyces cerevisiae
(Regular el pH a 4.5)
- Agua destilada
- Glucosa 10 g/l
- Sulfato de amonio (NH4)2SO4 3.21 g/l
- Fosfato de potasio monobásico KH2PO4 0.59 g/l
- Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4.7H2O 0.46 g/l
- Extracto de levadura 5 g/l
- Ácido cítrico. H2O 7.81 g/l

Otros reactivos
- Agua destilada
- Reactivo de sal de Rochelle
- Solución DNS
- Hidróxido de sodio
- Ácido clorhídrico
- Fosfato de amonio
- Bisulfito de sodio

3.1.3. Equipos y Materiales

- Microfermentador
- Tubos de ensayo
- Balanza analítica

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- Balanza de precisión
- Termómetro
- Potenciómetro
- Refractómetro de 0 a 30° Brix
- Estufa
- Autoclave
- Pipetas
- Beakers de 100 mL y 500 mL
- Magneto
- Agitador magneto con calentador
- Olla y cocinilla
- Espectrofotómetro
- Probeta 50 mL y 100 mL
- Tubos eppendorf 2 mL
- Centrífuga
- Micropipetas 1000 µL
- Lector multipozos
- Matraz 250 mL

3.2. MÉTODOS

3.2.1. Elaboración de medio de cultivo selectivo

Levadura
Todos los reactivos deberán colocarse en un vaso de precipitado. Se hará uso de un agitador
magnético para una correcta disolución. El pH debe ajustarse a 4.5 empleando sales o ácidos.
La esterilización del medio de cultivo se hará en una autoclave, a una temperatura de 121 ºC y
por un tiempo de 15 minutos.

Bacterias
Se empleará el caldo MRS, y su preparación se hará de acuerdo a las indicaciones dadas por el
proveedor.

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3.2.2. Elaboración de medio de cultivo a partir de desechos agroindustriales

Levaduras y bacterias
El acondicionamiento del medio de cultivo se hará considerando los requerimientos del
microorganismo, para lo cual se tendrá en cuenta la concentración de azúcares, la presencia de
nutrientes, el pH del medio de cultivo, etc. Antes de la inoculación del microorganismo, el
medio de cultivo se esterilizará en una autoclave, a una temperatura de 121 ºC y por un tiempo
de 15 minutos.

3.2.3. Preparación del inóculo

La preparación del inóculo se realizará 24 horas antes de iniciar el proceso de producción.
Levadura
Se prepararán 2 matraces de 50 mL del medio de cultivo señalado en la sección 3.2.1. Una vez
esterilizados y enfriados a temperatura ambiental, dentro de una cámara de flujo laminar, se
agregará a cada matraz aproximadamente 0.3 gramos de levadura comercial. Luego será
incubado a 28°C por 24 horas, en una estufa.

Bacteria
Se prepararán 2 matraces de 50 mL del caldo MRS. Dentro de una cámara de flujo laminar, con
ayuda de un asa de Kolle, se tomará de un tubo con agar inclinado una muestra de la bacteria.
Luego, se realizará la inoculación de la bacteria en los matraces previamente esterilizados y
enfriados a temperatura ambiental. Finalmente se llevará a incubar a 28°C por 24 horas, en una
estufa.

3.2.4. Producción de Biomasa

El proceso de producción de biomasa se realizará en un microfermentador, para lo cual se
programará en el equipo el porcentaje de oxígeno disuelto, las RPM del agitador y la
temperatura, tomando en cuenta los valores más apropiados según el microorganismo.

A dicho equipo también se acoplará jeringas estériles para facilitar la toma de muestra, la que
será colocada en tubos eppendorf de 2 ml.

Para iniciar el proceso de producción, se verificará que las condiciones de oxígeno, temperatura
y agitación sean las correctas. Una vez alcanzados los valores deseados, se inoculará el 5% del
volumen del medio de cultivo. Se tomarán muestras por duplicado cada hora, durante 24
horas, a fin de evaluar el crecimiento de la población de microorganismos, así como las
variaciones en la concentración del sustrato.

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3.2.5. Métodos de Análisis

Serán indicados en clase y descritos por los alumnos en sus informes.

- pH
Se medirá el pH de los medios de cultivo antes de la inoculación, utilizando un
potenciómetro. En caso sea necesario regular el valor obtenido, se hará uso de álcalis y/o
ácidos.
- Sólidos solubles
Se medirá la concentración de sólidos solubles, al inicio y al final del proceso, empleando
un refractómetro.
- Determinación de azúcares reductores
La determinación de azúcares reductores se realizará aplicando la metodología DNS. Las
muestras tomadas cada hora serán centrifugadas a una velocidad de 4000 rpm por 10
minutos a 4°C. Luego, en un tubo de ensayo se colocará 1 mL de sobrenadante junto con
3 ml de solución DNS, y se llevará a ebullición por 5 minutos. Finalizado esto, se
adicionará 1 ml de solución de sal de Rochelle y 10 ml de agua destilada, agitar y llevar a
leer al espectrofotómetro a una longitud de onda de 550 nm. Los valores se llevaran a la
curva de calibración de glucosa (g/L), dada en clase. Se harán diluciones según se
requiera.
- Determinación de biomasa
El crecimiento de la biomasa se determinará por el método turbidimétrico. Las muestras
tomadas cada hora serán centrifugadas. Se separará el sobrenadante del precipitado y
este último será resuspendido con agua destilada al volumen inicial (2 mL). Cada muestra
será agitada y luego puesta en la placa multipozo (300 uL) realizando lecturas de
absorbancia a 650 nm, considerando un blanco con agua destilada. Se harán diluciones
según se requiera. La curva de calibración será dada en clase.

3.2.5. Flujo de operaciones para la obtención de mosto a partir de materiales amiláceos

Los flujos de operaciones serán desarrollados en clases según las materias primas elegidas. En
la entrega del informe se deberán adjuntar estas figuras.

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4. RESULTADOS

Cuadro 1. Registro del control de la materia prima - Medio de cultivo desecho agroindustrial

Nombre de °Brix
Cantidad (mL) pH
la muestra inicial

Cuadro 2. Acondicionamiento - Medio de cultivo desecho agroindustrial

°Brix Fosfato
Nombre de Cantidad °Brix Agua pH
final Temperatura de
la muestra (mL) inicial adicionada acondicionado
amonio

Cuadro 3. Condiciones del proceso

Muestra Muestra
Parámetro
1 2
Temperatura (°C)
RPM
% O2

Cuadro 4. Producción de biomasa y concentración de glucosa en el tiempo

Factor
Tiempo Factor de Concentración de
Absorbancia Absorbancia de Glucosa (g/l)
(h) Dilución biomasa (g/L)
Dilución

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4.1. Elaborar graficas Producción celular

a) Tiempo (h) vs Concentración celular (g/L)
Concentración celular (g/L)

Tiempo (h)

Figura 1. ______________________

b) Variación de la concentración del sustrato en el tiempo

Concentración de glucosa (g/L)

Tiempo (h)

Figura 2. ______________________

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5. DISCUSIÓN
Las discusiones se harán según los objetivos planteados.

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6. CONCLUSIONES
En base a los resultados y discusiones obtenidas en la práctica se procederá a realizar las
conclusiones de la práctica de laboratorio. Las conclusiones deben reflejar el cumplimiento
de los objetivos.

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7. CUESTIONARIO
7.1. ¿Qué otros métodos de determinación de biomasa existen?
7.2. De 04 ejemplos de materias primas y sus respectivos microorganismos para producción de
biomasa.
7.3. Elabore un flujograma para la producción de biomasa a nivel industrial indicando equipos y
parámetros.

8. BIBLIOGRAFÍA
[1] ARNÁIZ, C., ISAC, L., LEBRATO, J. 2000. Determinación de la Biomasa en procesos
biológicos. Sevilla, España. Artículos Técnicos: Tecnología del Agua Pág. 45-52.
[2] CARDOZO, M., MORENO, J. 2012. Diseño y optimización de un medio de cultivo a base de
melaza de caña para la producción de biomasa a partir de Saccharomyces cerevisiae. Bogotá,
Colombia. Tesis Microbiólogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana.
[3] CORI, M., RIVAS, N., DORTA, B., PACHECO, E., BERTSCH, A. 2006. Obtención y
Caracterización de dos concentrados proteicos a partir de biomasa de Kluyveromyces marxianus
var. marxianus cultivada en suero lácteo desproteinizado. Venezuela. Revista Científica FCV-LUZ.
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[4] FAJARDO, E., SARMIENTO, S. 2007. Evaluación de melaza de caña como sustrato para la
producción de Saccharomyces cerevisiae. Bogotá, Colombia. Tesis Microbiólogo Industrial.
Pontificia Universidad Javeriana.
[5] GÁRATE, L. 1981. Ensayo sobre la obtención de Alimento proteico a partir de levadura
Saccharomyces cerevisiae. Lima, Perú. Tesis Ing. Industrias Alimentarias. Universidad Nacional
Agraria La Molina.
[6] ZUMBADO, W., ESQUIVEL, P., WONG, E. 2006. Selección de una levadura para la
producción de biomasa: Crecimiento en suero de Queso. Costa Rica. Revista Agronomía
Mesoamericana Vol. 17 N°2. Pág. 151-160.

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