Investigación en Microbiología 154 (2003) 353-359

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Caracterización y identi fi cación de un hierro-oxidante,

Leptospirillum- como bacteria, presente en el alto lixiviación sulfato
solución de una planta de biolixiviación comercial

Jaime Romero un, *, Carolina Yañez un, Mónica Vásquez un, Edward Moore RB segundo,
Romilio T. Espejo un
un Laboratorio de Biotecnología, Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos, Universidad de Chile, Macul 5540, 138-11 Santiago, Chile
segundo Bereich Mikrobiologie, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, 38124 Braunschweig, Alemania

Recibido el 29 de mayo de 2002; aceptaban 12 de febrero de de 2003

Publicado por primera vez en línea el 13 de febrero de de 2003

Abstracto

La mayoría de las plantas de biolixiviación de cobre operan con una alta concentración de sales de sulfato, causada por la adición continua de ácido sulfúrico y el reciclaje de la solución de
lixiviación. Dado que las bacterias implicadas en la biolixiviación han sido generalmente aislado a bajas concentraciones de sulfato, la población bacteriana presente en el alto-sulfato (150 gl
- 1) solución, empleada en una planta de producción de cobre de lixiviación, se investigó. los

hierro-oxidantes bacterias capaces de crecer en la solución de lixiviación se enriquecieron por varios cultivos por lotes y, después de la dilución en serie, se aisló una cepa bacteriana abundante. Esta
cepa, denominada LA, exhibió una tasa relativamente constante de hierro-oxidación en medios que contienen iones de sulfato en concentraciones que van de 10 a 150 gl
- 1. Colección de cultivos de cepas
ferrooxidans Leptospirillum y Acidithiobacillus ferrooxidans
- 1. A pesar de su tolerancia a altas concentraciones de sulfato,
mostraron capacidades limitadas para crecer en concentraciones de iones de sulfato superiores a 70 gl

cepa LA era tan sensible a NaCl como A. ferrooxidans. Análisis comparativo de secuencias del gen 16S rRNA de la cepa LA indicó que
está filogenéticamente relacionada con cepas descritas como ferrooxidans Leptospirillum . patrones de restricción de ADN comunidad bacteriana de 16S rRNA
genes sugieren que la cepa LA era un componente menor de la población bacteriana presente en la solución de lixiviación, pero es abundante en mineral lixiviado con esta solución.

• 2003 Editions ques científica y medicales Elsevier SAS. Todos los derechos reservados.

Palabras clave: ferrooxidans Leptospirillum ; Sulfato; La biolixiviación; extremófilos

1. Introducción [14,16,23,29] bacterias .Heterotrophic que pertenece al género

Acidiphilium, y se han observado los acidófilos heterótrofas de hierro-oxidante,
biolixiviación de cobre consiste en la lixiviación ácida del metal después de la así, aunque cualquier papel directo en procesos de biolixiviación es dudoso
oxidación del cobre sulfuros, reforzada por bacterias autótrofas acidófilas [3,17]. [23,29]. La importancia relativa de las diferentes especies acidófilas
Diversas bacterias acidófilas, hierro-oxidante de relevancia en este bioproceso se chemolithotrophic en biolixiviación ha sido revisado [28], y
han aislado de los sitios de mineral-lixiviación, o entornos similares. Los estudios Leptospirillum-
de las comunidades bacterianas en diferentes condiciones bioleching han reveladolike bacteria are being recognized as relevant, although, the predominant
la presencia de especies de hierro oxidizingbacterial iron-oxidizing bacteria, particularly in commercial plants, are still unclear. Themajor
obstacles in defining the relevant oxidizing strains are the inherent limitations in
Acidithiobacillus ferroox- obtaining a representative sample of the site where most of the oxidizing activity
idans y ferrooxidans Leptospirillum [ 9,12,16,27]. Sin embargo, estas especies
occurs, and culturing and enumerating the different species. In the past, cultivation
forman grupos taxonómicamente no cohesivos que contienen genotípicamente y has been commonly performed using media with compositions that are different
fenotípicamente diversas cepas
from those occurring in the plant site, which may select bacteria comprising only a
minor fraction of the
*
Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico: jromero@uec.inta.uchile.cl (J. Romero).

0923-2508/03/$ – see front matter • 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved.
doi:10.1016/S0923-2508(03)00037-8
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se precisan en estas condiciones y sus características de crecimiento,

comunidad que prevalece. Las diferencias en la composición de sal, entre la condición
en la planta y en condiciones de laboratorio, es común [9,22]. La mayoría de las especialmente las relacionadas con su capacidad para crecer a las altas
concentraciones de sal de sulfato, y se describen su tolerancia a cloruro de sodio. El
operaciones de biolixiviación implican la recuperación de cobre a partir de una solución
de lixiviación que contiene 0,03 a 0,1 N de ácido sulfúrico, que se reutiliza gen 16S rRNA sequencewas determinó y analizó y las relaciones filogenéticas
estimados de otras bacterias describe como
posteriormente después de la reposición del ácido que se hace reaccionar con sales en
el mineral. Este reciclaje resulta en un enriquecimiento continuo de la L. ferrooxidans se llevaron a cabo.
no-cobre-sulfatesalts hasta que se alcanza un equilibrio por la reposición de solución
que falta con agua fresca [3]. En las operaciones de lixiviación a escala comercial, los
iones de sulfato pueden alcanzar concentraciones superiores a 1,25 M, con aluminio,2. Materiales y métodos
magnesio y manganeso como los principales contraiones, a concentraciones de 0,63,
0,45 y 0,04 M, respectivamente [25]. 2.1. Cepas bacterianas y culturas

Las cepas siguiendo se obtuvieron de la Deutsche Sammlung von

La mayoría de las especies bacterianas que se encuentran típicamente en los Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ): Acidithiobacillus ferrooxidans ( DSM
sistemas de biolixiviación no son capaces de formar colonias en medio sólido. Varios 583); ferrooxidans Leptospirillum
trabajos han demostrado la presencia de bacterias del género Sulfobacillus en las , DSM 2705 (tipo de cepa = L15 T),
comunidades microbianas [11]. Más recientemente, dist autótrofos mesófilo de la L. ferrooxidans, DSM 2391 (= BU-1); y Leptospirillum
nueva familia Ferroplasmaceae, que oxidan Fe sp, DSM 9468 ( = C-Lf30A). El cultivo se llevó a cabo
2+ y FeS 2, han sido de-
en medio BRS, que contiene las siguientes sales, en gramos por litro: Al 2 ( ASI
Scribed [19]. Sin embargo, las limitaciones en la capacidad para cultivar especies deQUE 4) 3 · 18H 2 O, 209,8; MgSO 4 · 7H 2 O, 108,5; MnSO 4 · H 2 O, 6,1; K 2 ASI QUE 4, 0.4
biolixiviación se pueden superar mediante identificación de la especie mediante el medio MS9b [8] contenían las siguientes sales, en gramos por litro: NH
análisis de ADN extraído directamente de la muestra. Análisis de las regiones 4 ASI QUE 4, 0,1;
espaciadoras entre los genes 16S y 23S ARNr en ADN extraído de cobre sulfuro de K 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,04; MgSO 4 · 7H 2 O, 0,25; FeSO 4 · 7H 2 O,
mineral lixiviado con un protocolo imitando condiciones de la planta comercial (es 16.5. Ambos medios se ajustaron, con ácido sulfúrico, a un pH de 1,9. El medio
decir, el empleo de solución de lixiviación de la planta), indicó que las bacterias en lacon concentraciones de sulfato más bajos se obtuvieron por dilución de BRS con
muestra original consistió en una comunidad relativamente complejo [9]. Esta MS9b. Los cultivos en solución de lixiviación o en diferentes concentraciones de
comunidad se compone de las poblaciones de sulfato se agitaron en un giratory environ-agitador a 200 rev
/ min y se incubaron a
A. thiooxidans, A. ferrooxidans y 30 ◦ C. Se añadieron tres gramos por litro de hierro ferroso en el comienzo de
ferrooxidans Leptospirillum . cada cultivo. El final del cultivo fue indicada por el consumo del hierro ferroso, en
La obtención de muestras representativas de montones o presas de lixiviación es cuyo momento se inició un subcultivo utilizando 1/25 volumen de inóculo.
particularmente difícil debido a las condiciones ambientales y la actividad de la generación hierro férrico se controló usando un matraz paralelo sin inóculo, como
biolixiviación no son homogéneas en los montones o presas, que se componen de patrón de referencia.
secciones con muy diferentes pH y contenido de oxígeno [26]. secciones superiores de
montones de mineral aglomerado son aeróbicos dentro de aproximadamente un metro
de la surfacewhile secciones más profundas son prácticamente anaeróbico. secciones2.2. Las muestras
superior también tienen pHs inferiores, ya que reaccionan directamente con la solución
de lixiviación ácida, que tiene un pH inicial de 1.3 a 1.7. Esta solución se neutraliza solución de lixiviación se obtuvo de una piscina, que estaba recibiendo
parcialmente, por reacción con el mineral, que viene de a pH 2.5- solución de lixiviación a partir de la planta entera. La planta de biolixiviación Lo
Aguirre es un montón planta comercial de lixiviación de cobre, situada a 40 km al
oeste de Santiago, Chile [3]. Ore se obtuvo de la misma planta y lixivia en
3.0 en la parte inferior de los montones. En estos montones, la oxidación del hierro ferroso ycolumnas con la misma solución de lixiviación usado por la planta, como se
el crecimiento bacteriano se produce principalmente en el sector aeróbico superior, donde ladescribe anteriormente [27].
fase líquida llega a pHs inferiores a 1,9 a los pocos días de riego [26]. Debido a las
diferentes condiciones, las secciones superior e inferior de los montones pueden seleccionar
diferentes cepas bacterianas. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, la mayor 2.3. mediciones de crecimiento
parte del crecimiento bacteriano se produce en la sección superior aeróbico y ácido.
Las bacterias se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos, que
contiene diluciones en serie de un inóculo en 100 l de medio. Las placas se
Para superar algunas de las incertidumbres descritas anteriormente, se aplicó agitaron en un agitador environ-giratory a 200 rev / min mantuvo con aire saturado
◦
análisis de ADN para identificación de las bacterias predominantes en la solución de agua a 30 DO.

que salen de los montones. Posteriormente, se seleccionaron la población El crecimiento bacteriano se controló como una función de la producción de hierro
bacteriana capaz de crecer a condiciones (pH bajo, alta sulfato, atmósfera aerobia) férrico, medida por la absorción espectrofotométrica a 405 nm (A 450) ( EL × 800,
que imitan la parte aeróbica de la pila, donde la mayor parte del crecimiento BIO-TEK Instruments Inc., EE.UU.). La cantidad de hierro férrico producido fue
bacteriano se produce. Una cepa bacteriana, llamada LA, era iso directamente proporcional a la absorbancia, a niveles tan altos como 3 g
/ l, con una
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coef regresión fi ciente mayor que 0,99, en los diferentes medios de comunicación a un fluorescente marcado con colorante didesoxinucleótidos. Los cebadores de
pH inicial de 1,9. A concentraciones superiores a 3 g / l, una gran desviación de la
relación lineal se observa debido a la precipitación del hierro férrico. Suponiendo un
rendimiento constante, la tasa de crecimiento c especificidad es igual a d
PAG/ re t × 1 / PAG ,
PAG siendo la cantidad de hierro ferroso oxidado. Bajo este supuesto, la tasa de
crecimiento fi específica se calculó a partir de la pendiente de la curva, ln
( Fe + 3) en función del tiempo, considerando sólo
el lapso de tiempo que mostró un aumento exponencial de hierro férrico. Las
mediciones a 150 g de sulfato por litro se realizaron usando medio BRS. Las
mediciones en concentraciones de sulfato más bajos se obtuvieron por dilución de les asigna el número de adhesión y AJ237902, respectivamente.
BRS en MS9b. El número de bacterias vivas en el medio de inóculo se determinó
por dilución de punto final en el mismo medio, mientras que el número de bacterias
vivas restante a la transferencia a un diferentes mediumwas determinados por
dilución de punto final en el último medio. Estas dos figuras permitió el cálculo de la 3. resultados
inactivación debido a la transferencia a un medio diferente. sensibilidades
bacteriana a cloruro de sodio se realizaron mediante la estimación de crecimiento a 3.1. Selección después de un crecimiento en la sal de sulfato de alta
diferentes concentraciones de NaCl, en placas de 96 pocillos, como se describió
anteriormente. El inóculo fue de 1:20 y la concentración de hierro férrico inicial fue
de 2,2 gl
-1( pH 1,9) en todos los medios.
2.4. PCR la amplificación y análisis de los productos fi
Las células bacterianas y ADN genómico se obtuvieron a partir de cultivos como
se describe anteriormente [9], salvo que los cultivos en containingmore medios de
- 1 de sulfato se diluyeron
100 gl
en MS9b para reducir su densidad antes de la centrifugación de las bacterias.
Ampli fi cación de 16S rRNA de las posiciones 28 a 1492 se realizó como se
describe [7]. Se realizó Ampli fi cación de las regiones espaciadoras 16S-23S
ADNr tal como se describe por [9]. Los productos se analizaron por electroforesis
de poliacrilamida y tinción de plata nitrato como se describe anteriormente [27].
2.5. análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
(RFLP)
Productos de la PCR 16S rDNA ampli fi cación se digirieron directamente
◦
durante 3 horas a 37 C con 1,5 U de la seguimiento
ing endonucleasas de restricción: Alu yo y Director de Finanzas I (Gibco). los
fragmentos de restricción se analizaron posteriormente mediante electroforesis en gel
de poliacrilamida y tinción con nitrato de plata, como se describe anteriormente [27].
2.6. Determinación y análisis de secuencias de genes 16S rRNA
PCR-amplificado 16S rDNA fueron ed purificó usando Centricon-100
microconcentradores (Amicon GmbH, Witten, Alemania) y se secuenció
directamente, utilizando un secuenciador de ADN 373A de Applied Biosystems
Inc. y los protocolos del fabricante (Perkin-Elmer, Applied Biosystems GmbH,
Weiterstadt, Alemania) para “Taq Cycle-Sequencing” con
355
secuenciación se han descrito anteriormente [20]. Los datos de secuencia fueron
alignedwith secuencias de referencia, utilizando conservadas regiones de la
secuencia primaria y las características de estructura secundaria como referencia
[13,35]. distancias evolutivas se calcularon [18] a partir de diferencias de secuencia
de pares y dendrogramas de relaciones filogenéticas estimados se obtuvieron
utilizando los programas de la Phlyogeny Inference Package PHYLIP [10]. Las
secuencias del 16S rDNA de
L.
ferrooxidans DSM 2391 y la tensión LA fueron sometidos a EMBL AJ237903 y se
concentración a pH 1,9
Un cultivo de partida se obtuvo por incubación de solución de lixiviación se eluyó
desde el fondo de montones de mineral y se almacena en una piscina de una planta
de cobre comercial. Esta solución contenía aproximadamente 10
5 bacterias por ml, 3 gl - 1 de
- 1 de SO - 4, a un pH de 2,5. Seis
hierro ferroso y 150 gl
subcultures were carried out in the same solution sterilized by filtration and adjusted
to pH 1.9, i.e., the prevalent pH in the aerobic part of the commercial plant heaps
where most bacterial growth occurs [26]. Afterward, nine subsequent subcultures
were made in a synthetic medium of similar salt composition and pH as in the
leaching solution (BRS). During the sequential cultures, the bacterial diversity and
the bacterial growth were monitored. The diversity of the bacterial community in the
sequential cultureswas estimated by the electrophoretic migration patterns of
PCR-amplified 16S–23S rDNA spacer regions [9]. Fig. 1 shows a graph of bacterial
growth as observed by ferrous iron-oxidation (Fig. 1a), and the spacer patterns
obtained from the bacteria in the subcultures collected at the time indicated in each
lane (Fig. 1b). The predominant spacer type in the starting culture showed an
apparent size of approximately 530 bp, similar to the 16S–23S rDNA spacer
observed previously from
A. ferrooxidans cepas [27]. Sin embargo, después de subcultivo a pH 1,9, las
bacterias con un tipo de espaciador de aproximadamente 460 pb, el tamaño
observado anteriormente para el espaciador 16S-23S rDNA de L. ferrooxidans cepas
[27], sobrepasaron las otras bacterias. La observación microscópica de la
morfología celular y la motilidad con fi rmó la presencia de una
Leptospirillum- me gusta
bacteria. Los intentos de aislar esta cepa de colonias no tuvieron éxito debido a
que no crecen en los medios sólidos empleados para
A. ferrooxidans [ 15]. Aislamiento en líquido
- 9 de
cultura se intentó, empleando dilución en serie a 10
el último subcultivo en BRS. El subcultivo generada a partir de la 10 - 6 dilución era
la dilución más alta que produjo el crecimiento bacteriano. Esta dilución-subcultivo
contenía ADN con un solo espaciador (460 pb), que era idéntico al espaciador que
se encuentra en subcultivos realizados en BRS, pH 1,9. los
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Fig. 2. Análisis de fi PCR-ampli ed 16S rDNA por Alu yo y Director de Finanzas me RFLP

patrones. patrones de RFLP de 16S rDNA amplificado a partir de ADN extraído de la solución de
lixiviación (carriles S), mineral lixiviado con esta solución (carriles O) y cepa La (carriles LA). MW
corresponde al marcador escalera de peso molecular de 100 pb.

de cultivo se extrae y el 16S rDNA fue ampli ed fi y se trató con enzimas de

restricción (Fig. 2). El patrón de RFLP 16S ADNr de la cepa LA fue marcadamente
Fig. 1. Crecimiento de bacterias del hierro-oxidantes en medios altos de sulfato. (A) la producción de hierro
férrico en subcultivos seriados. La disminución de hierro férrico a cero indica el inicio de una nueva
diferente de los patrones obtenidos a partir de la solución de lixiviación, lo que
subcultura de serie. X indica el cambio composición del medio, desde pH 2,5 a 1,9, después del cultivo sugiere que la cepa LA era un componente menor de la población presente en la
primera y de la solución de planta de lixiviación a medio sintético de composición similar, medio BRS, solución de lixiviación. Sin embargo, la restricción de 16S rDNA fragmenta
después de cinco subcultivos adicionales. (B) electroforesis de poliacrilamida de las regiones espaciadorascaracterístico de aquellos de la cepa LA se observaron a una mayor intensidad en
16S-23S rDNA obtenidos después de la PCR ampli fi cación de ADN extraído de los cultivos que se
el RFLP per fi l del 16S rDNA amplificado a partir del ADN extraído de la mineral
muestran en (a) en el tiempo (días) que se muestran encima de cada calle. MW corresponde al marcador
escalera de peso molecular de 100 pb. Los espaciadores migran entre los 400- y marcadores de 600 pb,
lixiviado, lo que sugiere que esta cepa es abundante en mineral lixiviado con la
marcador de 500 pb se indica. solución de alta sulfato .

Leptospirillum parecido la tensión presente en esta cultura fue nombrado Ángeles. 3.2. Los análisis genotípicos
Para comprobar la ausencia de la bacteria con el espaciador más grande, observó
originalmente, el cultivo obtenido a partir de la más alta de inóculo dilución se PCR ampli fi cación y secuenciación directa permitió la identificación de 1670
subcultivó sucesivamente en el mismo medio, pero a pH 2,5. Si las bacterias con el posiciones de nucleótidos del gen de ARNr 16S de la cepa LA. Se observó que la
espaciador más grande persistieron en el cultivo de la dilución más alta, que secuencia del gen 16S rRNA de LA poseer 93,0% de similitud de secuencia con la
rápidamente habría superado cepa LA. Análisis de las regiones espaciadoras de las de la primera describe cepa de
bacterias después de cinco subcultivos a pH 2,5 no mostraron trazas de espaciador L. ferrooxidans ( DSM
más grande, lo que indica que el cultivo derivado de la dilución más alta contenía LA 2705) (EMBL número de acceso X86776) y 99,0% con
exclusivamente (resultados no mostrados). L. ferrooxidans la cepa DSM 2391 y con Leptospirillum
sp. la cepa DSM 9468 (EMBL número de acceso X72852).

Dado que el 460-bp 16S-23S rDNA región espaciadora, observada después de3.3. concentración de sal de sulfato y el crecimiento
cultivo selectivo no se había detectado en el cultivo de partida, la concentración
relativa a la que podría haber estado presente, pero no detectada por PCR de La capacidad de la cepa LA crecer a altas concentraciones de sal de
amplificación fi de los espaciadores, se exploró. Para esto, ampli fi cación de las sulfato se comparó con la de A. ferrooxidans
regiones espaciadoras del ADN extraído de cepa DSM 583 y L. ferrooxidans cepa DSM 2391. El primero fue aislado de una
A. ferrooxidans zona de extracción de carbón y se ha agrupado junto con los tipos más
y L. ferrooxidans, mezclado en diferentes proporciones, se realizó. Los resultados abundantes de esta especie por homología de ADN [14]. El segundo fue aislado
(no mostrados) indicaron que, en estas condiciones, el espaciador de de agua de drenaje ácido de minas de una mina de cobre [23]. Ambas cepas se
L. ferrooxidans era indetectable aislaron a partir y se mantuvieron en baja concentración media de sal de sulfato.
cuando su proporción relativa de célula estaba por debajo de 1 / 50. las tasas de crecimiento especıficos se calcularon a partir de la tasa de producción
Para evaluar la presencia de la cepa LA en la comunidad bacteriana de la de hierro férrico específica, suponiendo un rendimiento constante [21,31], como se
solución de lixiviación y en el mineral lixiviado con esta solución, el ADN a partir describe en Materiales
del mineral, la solución y LA
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(un)

(un) (segundo)

Fig. 4. férrico producción de hierro, medido por absorbancia a 405 nm, en cultivos de la cepa LA y A.
ferrooxidans DSM 583 (Tf) con medios que contienen NaCl. Las bacterias cultivadas en medios que
- 1 de sulfato de
contenían 110 gl
- 1 (a) o
ion se incubaron en medio (BRS-MS9b) que contiene 110 gl
5 gl - 1 (b) de sulfato y concentraciones crecientes de NaCl. El crecimiento bacteriano se controló midiendo
el aumento de absorbancia debido a la generación de férrico.

a bajas concentraciones de sal, aunque esta tasa de crecimiento específico de A. ferrooxidans rápidame
disminuido con concentraciones crecientes de sulfato, a un nivel indetectable en 130 g de
sulfato / l. El efecto del estrés osmótico en las células después de las transferencias se analizó
mediante la estimación de la supervivencia celular, en la transferencia, mediante la
determinación de la relación entre las más altas diluciones de las células que muestran el
crecimiento en el ensayo y medio original. No se observó la inactivación cuando cepa LA fue
transferido de un alto contenido de sal a un medio de bajo contenido de sal, pero se observó
una inactivación marcada en cada una de las tres bacterias después de la transferencia de bajo
contenido de sal a los medios de comunicación de alta sal (Tabla 1, los datos para la cepa DSM
2391 fueron similares a los de
(segundo)

Fig. 3. Las tasas de crecimiento especıficos medidos en cultivos de la cepa LA (bares LLED Fi), A. ferrooxidans,
A. ferrooxidans DSM 583 (barras abiertas) y L. ferrooxidans DSM 2391 (gris no mostrada).
bares), realizados en diferentes concentraciones de sal de sulfato. (A) valores obtenidos con inóculos de La resistencia de la cepa LA al cloruro de sodio se analizó mediante la evaluación
- 1,
LA y A. ferrooxidans crecido a 150 y 110 gl
de su crecimiento en cultivos que contienen cantidades crecientes de esta sal,
respectivamente. (B) valores obtenidos con inóculos de LA, A. ferrooxidans y
- 1 de sales de sulfato. bymeasuring la absorbencia debido a la resultante de hierro férrico.
L. ferrooxidans crecido a 10 gl
A. ferrooxidans DSM 583, fue
incluido para comparación. La inhibición del crecimiento por NaCl era casi
y métodos. Las tasas de crecimiento fi específicas de las tres cepas a diferentes - 1 De NaCl, cuando ambas cepas
completa en 3 gl
concentraciones de sal de sulfato se muestran en la Fig. 3. Dado que estos - 1 medio sulfato se ensayaron en medio
crecido en 110 gl
experimentos también estrés osmótico involucrado en las células debido a transferirque contiene la misma concentración de sal de sulfato alta (Fig. 4a). Sin embargo, cuando las
en diferentes concentraciones de sal, lo que podría resultar en la inactivación, que cepas se hicieron crecer a 110 gl - 1 sulfato eran
se llevaron a cabo por la transferencia de alta a bajas concentraciones de sal (Fig. probado a una baja concentración de sulfato (5 gl - 1), inhibición fue
3a) y, a la inversa, de baja a altas concentraciones (Fig. 3b). Strain LA creció a - 1 NaCl (Fig. 4b) y
observado para ambos organismos a 16 gl
aproximadamente las mismas tasas de mercantiles en concentraciones que van -1( resultados no mostrados).
era casi completa en 20 gl
from10 a 150 gramos de sulfato por litro. L. ferrooxidans la cepa DSM 2391 demostró
tasas similares de crecimiento, pero no creció en concentraciones de sulfato mayor
que 70 gl 4. Discusión

- 1. A. ferrooxidans, Sin embargo, mostró

Las bacterias del género Leptospirillum había sido previamente
una tasa de crecimiento c especificidad aproximadamente cinco veces mayores sugerido que desempeñar un papel predominante en la lixiviación biocenosis en los hábitats
que las de la cepa LA y L. ferrooxidans DSM 2391 de lixiviación [28,29]. Se seleccionaron y aislaron una
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Leptospirillum- como cepa LA a través de una estrategia de cultivo que imitaba lum spp. y uncultured bacterias cuya 16S rRNA genes se han clonado y
condiciones que prevalecen en las secciones de pila de mineral, donde se había secuenciado [12] y que es, evidentemente, los miembros más predominantes
observado más actividad bacteriana [26]. Estas son: una atmósfera aeróbica, una activos en los procesos de biolixiviación, a diferencia de bacterias relacionadas
-1
concentración de 150 gl con la cepa de tipo L. fer-
de iones sulfato y un pH 1,9 en la solución de lixiviación usado como medio. rooxidans DSM 2705 T.
Hemos observado en el cultivo inicial que tanto A. ferrooxidans cepas se cree que son los principales agentes responsables de
A. ferrooxidans- y L. ferrooxidans- como cepas son capaces de crecer a la oxidación de mejora de ácido en la biolixiviación de cobre y drenaje de mina
- 1.
concentraciones de sulfato de hasta 150 gl ácido. Esto puede ser debido a la presunción de que estas cepas eran tan
A pesar de la abundancia inicial de A. ferrooxidans- me gusta abundantes en ambientes de minas, ya que han sido fácilmente aislado de estos
cepas, la condición selectiva de pH inferior permite sólo ambientes utilizando baja en sal medios sólidos. La relevancia de
L. ferrooxidans- como cepas para ser seleccionados. análisis del patrón de
restricción de las fi ed 16S rRNA genes PCR-cadores sugirió que la cepa LA era L. ferrooxidans cepas ha sido menos apreciado
sólo un componente menor de la población presente en la solución de lixiviación, porque crece menos e fi cientemente en los medios de aislamiento común. Sin
aunque era abundante en mineral lixiviado con esta solución. Por lo tanto, la cepa embargo, cada vez más pruebas ha sugerido que
LA puede ser un organismo relevante para el bacteriana oxidación de mejora en la L. ferrooxidans cepas podría ser un componente dominante en entornos mineros
planta comercial de cobre de Lo Aguirre. [1,2,6,28-30].
Estos hallazgos muestran que L. ferrooxidans- como las bacterias
Strain LA puede ser considerado como sulfato tolerantes, como observedby supuede llegar a ser las poblaciones bacterianas predominantes en minerales leachedwith
crecimiento en presencia de altas concentraciones de electrolito [4,5,20] y sus bajo pH y soluciones de alta sulfato. Por lo tanto L. fer-
exhiben tasas de crecimiento similares a concentraciones crecientes de sulfato, a rooxidans- como cepas pueden ser importantes “potenciadores” de la oxidación en el en
condiciones in situ de un cobre biolixiviación planta comercial. Estos organismos, sin
1,5 M. Es probablemente posee algún mecanismo de osmoprotection. Sin embargo,
a pesar de esto observado resistencia al sulfato, la cepa LA es al menos tan embargo, probablemente se supere por A. ferrooxidans a concentraciones de sal inferiores
sensible a NaCl como es y pH más alto, las condiciones empleadas habitualmente para el análisis cultural. Estos
A. ferrooxidans. los resultados, y otros [32], indican que el crecimiento de las bacterias a altas
sensibilidad a NaCl de ambos A. ferrooxidans and strain LA was observed to concentraciones de sal y ácido es posible, es decir, las condiciones que prevalecen en
muchas cobre lixiviación plantas comerciales. Sin embargo, estas observaciones no
increase at high sulfate salt concentrations. This increased sensitivity at high sulfate
salt concentration is important because of the potential inhibition by low deben desalentar esfuerzos para idear favorable al medio ambiente Amore para las
concentrations of NaCl in plants working with leaching solutions containing high bacterias en las plantas de biolixiviación porque la mejora general de oxidación en
sulfate concentration. High sulfate concentrations are uncommon in nature and themontones de mineral probablemente será bajo, particularmente cuando el pH bajo, baja
study of halophilic or halotolerant bacteria has been restricted to the effects of hightemperatura, alta sulfato concentrationand bajo, pero fi bisela, concentraciones
NaCl concentrations, which is more abundant in nature [4,5,33,34]. Kieft and significantes de cloruro de están combinados.
Spence (1998) classified A. ferrooxidans as a non-halophilic bacterium, based on
growth inhibition observed at 0.25 M (15 g l

− 1) Expresiones de gratitud

of NaCl or KCl. This inhibition, however, seems to be due to a specific effect of the
chloride ion rather than to an osmoregulation problem, as has been described for Este trabajo fue apoyado por una subvención de 1.961.216 FONDECYT.
other acidophilic bacteria [24].

The genus Leptospirillum comprende varias cepas y ha sido recientemente

publicados válidamente. La forma de las células y la motilidad sugirieron que la referencias

cepa LA era una cepa de L. fer-

[1] PL Bond, GK Druschel, JF Ban campo, la comparación de ácido de mina
rooxidans. Sin embargo, se observó la secuencia del gen 16S rRNA de la cepa LA
comunidades microbianas de drenaje en los ecosistemas física y geoquímica distintas, Appl.
poseer solamente 93,0% de similitud de secuencia con la de la primera descrita y Reinar. Microbiol. 66 (2000) 4962 hasta 4.971. [2] PL Bond, SP Smriga, JF Ban campo, Filogenia
tipo de cepa de de microorganismos
ferrooxidans Leptospirillum , DSM 2705 T. Este nivel de SE- poblar una gruesa, subaéreo, predominantemente litotrofo biopelícula en un sitio de drenaje
ácido de minas extremo, Appl. Reinar. Microbiol. 66 (2000) 3.842 a 3.849.
similitud cuencia es notablemente más baja que lo que se observa generalmente entre
cepas de una sola especie, lo que indica que la cepa LA comprende una nueva
[3] S. Bustos, S. Castro, R. Montealegre, La Sociedad Minera Pudahuel
especie, relacionados con, pero distinta de, L. ferrooxidans. LA cepa se observó a estar bacteriana proceso de lixiviación en capa fina en Lo Aguirre, FEMS Microbiol. Rev. 11 (1993)
más estrechamente relacionados con los organismos descritos como 231-236.

L. ferrooxidans [4] LN Csonka, fisiológicos y respuestas genéticas de las bacterias a

cepa C-Lf30A [12] y Leptospirillum sp. cepa BU-1 [23], con 16S rRNA secuencias de
genes similitudes de aproximadamente 99%. Strain LA parece ser conforme
filogenéticamente a un grupo que comprende las cepas estrechamente
relacionadas de Leptospiril-
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