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CROMATOGRAFIA EN GEL

La cromatografía o filtración en gel es una clase de cromatografía sólido-líquido que


permite la separación de moléculas en función de su tamaño. En este tipo de
cromatografía la fase estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como
soporte cromatográfico. El gel está constituido por partículas esféricas que tienen poros
de un determinado tamaño.

PARÁMETROS
Intervalo de fraccionamiento: Es un determinado tipo de gel como los valores extremos
(máximo y mínimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de
separar.

Volumen de elución: es el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna.


Volumen de exclusión: es la columna al volumen al que eluyen las moléculas de tamaño
superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de
los huecos entre las partículas de gel.

APLICACIONES
Además de utilizarse para la separación de sustancias de distintos pesos moleculares o
para la purificación de proteínas, se emplea para la determinación de pesos moleculares
de proteínas. Para una gran variedad de tipos de geles se ha comprobado que existe una
relación lineal entre el volumen de elución y el logaritmo del peso molecular de las
proteínas.
Usos
• Purificación de proteínas.

- Se puede utilizar como una etapa de purificación de proteínas.

- Este tipo de cromatografía es complementario a la de intercambio iónico.

- Se basan en principios diferentes (carga y tamaño).

• Separación de monómeros, dímeros u otros oligómeros.

• Cambio de buffer de una proteína:

Es un método suave y rápido para transferir una proteína de un buffer a otro. También se
usa para desalar una muestra, es decir pasarla de un buffer de alta fuerza iónica a uno de
baja fuerza iónica.

• Determinación del peso molecular:

- Se puede tener una estimación del peso molecular de una proteína.

- La estimación del PM supone que las proteínas son globulares. (Estándar de PM


son proteínas globulares).

MATERIAL Y REACTIVOS
Material

.- Columna de cromatografía .

- Pipetas Pasteur .

- Tubo graduado .

- Vaso o Erlenmeyer

Reactivos.

- Sephadex .

- Tampón fosfato 20 mM, pH = 7.0 .

- Ferricianuro potásico.

- Azul dextrano (2 mg/ml) .

- Ditionito sódico.
PROCEDIMIENTO
Preparación del hemolizado:

Se recoge la sangre de rata en tubos de vidrio graduados con heparina 1% como


anticoagulante. Se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 5 minutos, aspirando el plasma con
pipeta Pasteur. Se resuspenden los hematíes en 4-5 ml de NaCl 0.9%, se agita y se vuelve a
centrifugar en las mismas condiciones. Esta operación de lavado se repite dos veces más.
Los hematíes se hemolizan añadiendo 4 volúmenes de agua destilada y 0,4 volúmenes de
cloroformo, se agita y se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 20 minutos. Recoger el
sobrenadante.

Hinchado del gel:

Se añaden 25 ml de tampón fosfato por gramo de gel. Se deja hasta el día siguiente. De
este modo, se consigue la estructura de retícula tridimensional que permite la
separación de las moléculas de la muestra ya que cada bolita de gel seco absorbe el
tampón, aumentando su volumen . Se partirá del gel hinchado.

Empaquetado de la columna:

Con la llave de la columna cerrada se comienza a añadir, usando una pipeta Pasteur,
aproximadamente 15 ml de suspensión del gel, dejándola resbalar por la pared de la
columna para evitar que se formen burbujas de aire en el interior del gel. Con el
tiempo, el gel va sedimentando.

Importante:

En todo momento debe evitarse, mediante el control de la llave y la adición de


tampón, que el gel llegue a secarse. La adición a la columna se hará siempre con pipeta
Pasteur, con cuidado y por la pared para evitar distorsionar el lecho del gel.

Medida del volumen de exclusión:

Dejar fluir el tampón hasta que el menisco alcance el lecho del gel, evitando que éste
se seque. Cerrar la llave. Añadir cuidadosamente con la pipeta Pasteur 2 gotas de la
solución de azul de dextrano. Abrir la llave hasta que la banda de azul dextrano entre
completamente en el gel y cerrar de nuevo.

Añadir a la parte superior del gel un poco de tampón (2 mm de altura).Poner un tubo


graduado para recoger el líquido que sale de la columna (eluato). Abrir la llave, dejar
entrar la capa de tampón en el gel.