Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Microscopía de fluorescencia y
epifluorescencia
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
Fluorescencia
¿Qué es?
Fluorescencia
Excitación Emisión
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
¿Cómo se produce?
Fluorescencia
E S'1
S1
S0
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
E S'1
S1
S0
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
Fluorescencia
E S'1
S1
S0
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
Fluorescencia
E S'1
S1
S0
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
Fluorescencia
E S'1
S1
S0
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
● Debido a la disipación interna de energía la luz
emitida tiene siempre una longitud de onda mayor
(menor energía) que la luz de excitación.
Fluorescencia
● Lo que diferencia a la fluorescencia de la
fosforescencia (ambos son procesos de
luminiscencia) es el tiempo de vida más largo de
éste último proceso que puede ir desde
milisegundos a minutos y ocurre después de que el
proceso de absorción haya terminado.
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
● Los materiales que fluorescen lo hacen porque
contienen estructuras con configuraciones
moleculares particulares conocidas como fluoróforos
o fluorocromos.
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
● Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber
fotones y emitir fotones de menor energía (mayor
longitud de onda).
Fluorescencia
Tipos de fluorescencia:
● La fluorescencia primaria es la que se da porque
existe una configuración inherente a la estructura
molecular.
Algunas de las fluorescencias más intensas que se
observan se asocian con moléculas aromáticas, la
fluorescencia de materiales inorgánicos se observa
en muchos minerales y piedras preciosas, y quelatos
específicos:
Clorofila, aceite de inmersión, GFP
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
Tipos de fluorescencia:
● La fluorescencia secundaria ocurre cuando una
molécula específica o un grupo capaz de fluorescer,
un fluorocromo, se introduce en la estructura de la
muestra.
Fluorescencia
Fluorescencia
Espectro de excitación:
Muestra la diferente intensidad de la luz de emisión
máxima a diferentes longitudes de onda de
excitación.
excitación emisión
fluorescencia
λ
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
Espectro de emisión:
Muestra la intensidad relativa de emisión a
diferentes longitudes de onda al excitar con la
longitud de onda máxima.
λ excitación máxima emisión
fluorescencia
λ
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
pH = 9 pH = 13
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
Disminución de la fluorescencia:
Fluorescencia
5. Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
Disminución de la fluorescencia:
Fading, decoloración
Fluorescencia
Disminución de la fluorescencia:
Fluorescencia
Uso de la microscopía de fluorescencia:
Fluorescencia
Uso de la microscopía de fluorescencia:
Instrumentación: Epi-iluminación
La gran mayoría de los microscopios trabajan
en modo de luz incidente, epi-iluminación,
aunque algunos todavía lo hacen en modo de
luz transmitida.
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Epi-iluminación
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Epi-iluminación
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Epi-iluminación
5. Microscopía de fluorescencia
Filtro de Filtro
excitación barrera
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros
● Con el filtro de excitación seleccionamos la parte del espectro
que utilizaremos para excitar la muestra.
● La muestra emite fluorescencia en un espectro distinto al de
excitación y al mismo tiempo refleja parte del espectro
utilizado para la excitación.
● El filtro barrera se encarga de eliminar la parte del espectro
reflejado y nos permite visualizar el espectro de emisión
correspondiente al fluorocromo.
Filtro de Filtro
excitación barrera
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros
● Filtro de excitación: Selecciona el espectro de excitación.
● Espejo dicroico: Refleja la parte del espectro necesaria para
la excitación y transmite el resto.
● Filtro barrera: Deja pasar la parte de la emisión de la muestra
que nos interesa.
Filtro barrera
Filtro de excitación
Espejo dicroico
Muestra
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros
● Los fabricantes suelen proporcionar bloques de filtros que
son combinaciones de filtros de excitación y de emisión con
los apropiados espejos dicroicos.
Instrumentación: Filtros
● Filtros de excitación y barrera:
BPxxx - Filtro Pasa Banda (Band Pass): Deja pasar una
banda determinada del espectro y bloquea el resto.
BP460-580: BP significa filtro pasa banda y los números
indican la luz que bloquea por debajo, 460 nm, y la que
bloquea por encima, 580 nm.
460 580
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros
● Filtros de excitación y barrera:
BPxxx - Filtro Pasa Banda (Band Pass): Deja pasar una
banda determinada del espectro y bloquea el resto.
BP600/30: Deja pasar una banda cuyo máximo es 600 nm
con una anchura de 30 nm.
30nm
600
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros
● Filtros de excitación y barrera:
SP600: SP significa filtro pasa bajos (short pass).
Deja pasar el espectro por debajo de un valor determinado,
en este caso 600 nm, y bloquea lo que está por encima de
ese valor.
600 nm
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros
● Filtros de excitación y barrera:
LP490: LP significa filtro pasa altos (long pass).
Deja pasar el espectro por encima de un valor determinado,
en este caso 490 nm, y bloquea lo que está por debajo de
ese valor.
490 nm
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros
● Filtros de excitación y barrera:
La combinación de filtros SP y LP permite recortar el espectro
por debajo del valor de SP y por encima del valor de LP
consiguiendo bandas muy estrechas.
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros
● Espejos dicroicos:
También se describen con números y letras:
● RSPxxx: Espejo dicroico Reflexión Pasa Bajos, refleja por
debajo del valor indicado (xxx) y transmite el resto.
Instrumentación: Filtros
● Espejos dicroicos:
RSP490: refleja por debajo de 490 nm y transmite el resto.
490
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros
Filtro
Filtro de barrera
excitación
Espejo
dicroico
Fuente
de
emisión Muestra
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros
1.La lámpara emite luz en todo el espectro.
2.El filtro de excitación sólo deja pasar la parte del
espectro necesaria para excitar la muestra.
3.El espejo dicroico refleja hacia la muestra la
excitación correspondiente.
4.La muestra se excita con la luz que le llega y emite
en un espectro superior al de la excitación.
5.El espejo dicroico transmite la emisión de la
muestra.
6.El filtro barrera hace una selección exacta del
espectro de emisión que nos interesa.
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros
Filtro
Filtro de barrera
excitación
Espejo
dicroico
Fuente
de
emisión Muestra
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Objetivos
● Casi las mismas consideraciones se aplican a la
evaluación de los objetivos cuando se requieren
para microscopía de fluorescencia o de campo claro.
● La capacidad del objetivo para captar la luz juega un
papel esencial en la microscopía de fluorescencia.
● Para obtener una intensidad de la señal óptima se
debe emplear una apertura numérica elevada y el
menor aumento posible.
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Objetivos
● Por otro lado, el tipo de vidrio que se utilice requiere
una buena transmisión de la longitud de onda que se
use, por eso, los más utilizados son los de fluorita o
los apocromáticos.
● También se deben utilizar objetivos con
autofluorescencia extremadamente baja.
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Objetivos
● Puede ocurrir que aunque estén todos los factores
anteriores optimizados exista un ruido de fondo.
Éste se debería a la propia muestra debido a la
fijación, la autofluorescencia o a un proceso de
tinción inadecuado.
5. Microscopía de fluorescencia
Aplicaciones
● Se aplica a la determinación cuantitativa de
aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y muchos
fluorocromos celulares (para ello se utiliza un
fotómetro que mide la intensidad de la fluorescencia
de una región específica de la muestra).
5. Microscopía de fluorescencia
Aplicaciones
● También es útil en el estudio de diferentes clases de
celulosa, tejidos vegetales, alimentos y
medicamentos, fibras animales, minerales en polvo,
detección de impurezas en mezclas homogéneas y
heterogéneas, polímeros, resinas, cristales líquidos,
telas, fibras, madera, papel, carbón mineral,
petróleo, cemento, vidrio, cerámica,
semiconductores, ciencia forense, farmacia,
restauración de arte, biología y medicina.