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5.

Microscopía de fluorescencia y
epifluorescencia
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

Espectro de luz visible:

La longitud de onda determina el color


5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

¿Qué es?

Es un proceso de interacción entre la radiación y la


materia en el cual un material absorbe radiación de
una fuente específica y muy rápidamente emite luz
cuya energía es menor (de mayor longitud de onda)
que la de la radiación que ha absorbido.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

Espectro de luz visible:

Excitación Emisión
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

¿Cómo se produce?

Los electrones son excitados a estados


vibracionales y rotacionales más altos y cuando
vuelven a su estado fundamental emiten la energía
de excitación en forma de radiación.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

¿Cómo se produce? Diagrama de Jablonski

E S'1
S1

S0
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

¿Cómo se produce? Diagrama de Jablonski

E S'1
S1

S0
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

¿Cómo se produce? Diagrama de Jablonski

1) La absorción de la luz de excitación eleva la


molécula del fluorocromo a un estado de excitación
con un mayor contenido de energía, S’1.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

¿Cómo se produce? Diagrama de Jablonski

E S'1
S1

S0
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

¿Cómo se produce? Diagrama de Jablonski

2) En este estado de excitación se mantienen un


tiempo determinado, de 10-9 a 10-8 segundos, en el
cual la molécula sufre cambios conformacionales e
interacciones con las moléculas de su entorno.
Como consecuencia, parte de la energía del estado
S’1 se disipa, creándose un estado S1 de menor
energía.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

¿Cómo se produce? Diagrama de Jablonski

E S'1
S1

S0
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

¿Cómo se produce? Diagrama de Jablonski

3) Pasado este tiempo de excitación la molécula


emite luz de menor energía volviendo a su estado
fundamental, S0.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

¿Cómo se produce? Diagrama de Jablonski

E S'1
S1

S0
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
● Debido a la disipación interna de energía la luz
emitida tiene siempre una longitud de onda mayor
(menor energía) que la luz de excitación.

● La cantidad de luz emitida es muy pequeña en


comparación con la utilizada para la excitación.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
● Lo que diferencia a la fluorescencia de la
fosforescencia (ambos son procesos de
luminiscencia) es el tiempo de vida más largo de
éste último proceso que puede ir desde
milisegundos a minutos y ocurre después de que el
proceso de absorción haya terminado.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
● Los materiales que fluorescen lo hacen porque
contienen estructuras con configuraciones
moleculares particulares conocidas como fluoróforos
o fluorocromos.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
● Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber
fotones y emitir fotones de menor energía (mayor
longitud de onda).

● Un fluoróforo es la parte del fluorocromo


responsable de la emisión de la fluorescencia.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

Tipos de fluorescencia:
● La fluorescencia primaria es la que se da porque
existe una configuración inherente a la estructura
molecular.
Algunas de las fluorescencias más intensas que se
observan se asocian con moléculas aromáticas, la
fluorescencia de materiales inorgánicos se observa
en muchos minerales y piedras preciosas, y quelatos
específicos:
Clorofila, aceite de inmersión, GFP
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

Tipos de fluorescencia:
● La fluorescencia secundaria ocurre cuando una
molécula específica o un grupo capaz de fluorescer,
un fluorocromo, se introduce en la estructura de la
muestra.

Éste es el procedimiento para la mayoría de las


aplicaciones biológicas de la microscopía de
fluorescencia.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

Espectros de excitación y emisión:

Debido a la diferente configuración electrónica de los


fluorocromos cada uno presenta un espectro de
excitación y de emisión característico y único.

Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y


el pico de máxima emisión o bien los espectros de
excitación y emisión.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
Espectro de excitación:
Muestra la diferente intensidad de la luz de emisión
máxima a diferentes longitudes de onda de
excitación.
excitación emisión
fluorescencia

λ
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
Espectro de emisión:
Muestra la intensidad relativa de emisión a
diferentes longitudes de onda al excitar con la
longitud de onda máxima.
λ excitación máxima emisión
fluorescencia

λ
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

Espectros de excitación y emisión: Fluoresceína

pH = 9 pH = 13
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
Disminución de la fluorescencia:

Una molécula del fluorocromo puede tener varios


ciclos de excitación-emisión.

Pero bajo condiciones de iluminación de alta


intensidad hay una destrucción irreversible del
fluorocromo excitado que se denomina
fotoblanqueado (photobleaching) limitando la
detección de fluorescencia.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
Disminución de la fluorescencia:

Fading, decoloración

Puede ser por dos procesos:


1) Photobleaching: Descomposición irreversible de
las moléculas de los fluorocromos.
Está directamente relacionado con la intensidad de
la excitación y con el tiempo durante el cual estamos
excitando la muestra.
Para evitar este efecto se debe trabajar en
condiciones de mínima iluminación posible.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
Disminución de la fluorescencia:

2) Quenching: Disminución de la intensidad de la


emisión debida a condiciones de temperatura o
presión elevada, agentes oxidantes y algunas sales.
También puede ser debida a interacciones entre
moléculas de fluorocromo, por lo que aumentar la
concentración de éste no siempre supone un
aumento de fluorescencia.
Se debe trabajar con agentes secuestradores de
oxígeno.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
Uso de la microscopía de fluorescencia:

1) El objetivo principal es la identificación de una


sustancia específica observando sus propiedades
características de emisión cuando se ilumina con
radiación de longitud de onda apropiada.

2) Un objetivo difícil es la determinación de


parámetros específicos inherentes a la muestra, o
que son resultado de la preparación de la misma,
que influyen en la fluorescencia de un fluorocromo
específico en un material dado.
5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia
Uso de la microscopía de fluorescencia:

3) Un tercer objetivo incluye la medida de la


intensidad de la fluorescencia y una comparación de
esta intensidad con estándares de fluorescencia
bien establecidos.

4) El cuarto objetivo es el barrido localizado de una


muestra para determinar la distribución de los
fluorocromos que contiene, que es la microscopía de
barrido confocal.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Epi-iluminación
La gran mayoría de los microscopios trabajan
en modo de luz incidente, epi-iluminación,
aunque algunos todavía lo hacen en modo de
luz transmitida.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Epi-iluminación
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Epi-iluminación
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Epi-iluminación
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Fuentes de luz


● La elección de la fuente de luz es función del
fluorocromo específico que se investiga, sus
requisitos de excitación y su eficiencia cuántica.
● Para excitar la fluorescencia de un fluorocromo se
necesita una fuente de luz intensa que suministre las
longitudes de onda de excitación del fluorocromo en
uso.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Fuentes de luz


Lámparas de mercurio a alta presión:
● Son las más utilizadas.
● Exhiben máximos discretos sobre un fondo continuo que
proporcionan excitación en el rango del ultravioleta así
como en las regiones azul y verde.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Fuentes de luz


Lámparas de mercurio a alta presión:
● Estas lámparas son caras, requieren unidades de
encendido especiales y el coste de funcionamiento es
elevado.
● La salida de la luz se va reduciendo con el tiempo
debido al ennegrecimiento del envoltorio de cuarzo.
● Nunca deben utilizarse más tiempo del recomendado
por el fabricante ya que existe riesgo de explosión que
dañaría el microscopio y llenaría la habitación de
vapores de mercurio.
● Generalmente llevan un contador de horas incorporado.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Fuentes de luz


Lámparas de xenon a alta presión:
● Se caracterizan por un flujo luminoso estable y regular.
● Muestran un continuo de elevada intensidad con algunos
máximos irregulares entre longitudes de onda de 800 y
1.000 nm.
Esta fuerte intensidad en el infrarrojo cercano debe ser
eliminada con filtros.
● Suministran suficiente radiación azul-verde en la región
de 440 - 540 nm donde las lámparas de mercurio no son
muy útiles, sin embargo son deficientes en el
ultravioleta.
● Su vida media es más larga que las de mercurio.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Fuentes de luz


Lámparas de xenon a alta presión:
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Fuentes de luz


Lámparas halógenas de wolframio:
● También se conocen como lámparas de yoduro de
cuarzo.
● Son del tipo de fuente de filamento incandescente que
tienen un espectro de radiación continuo.
● Dan poca emisión en el rango del ultravioleta pero es
aceptable en las regiones azul y verde.
● Permiten un apagado y encendido con frecuencia lo que
acortaría la vida de las de mercurio.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Fuentes de luz


Lámparas halógenas de wolframio:
● Son más baratas y más seguras que las de mercurio
pero sólo son apropiadas en técnicas donde se espere
tener una elevada fluorescencia ya que tienen una
menor energía de excitación.
● Si el trabajo requiere fluorescencia de dos colores o se
necesitan elevados aumentos o la fluorescencia es
tenue se prefieren las lámparas de vapor de mercurio.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Fuentes de luz


Lámparas halógenas de wolframio:
5. Microscopía de fluorescencia
Instrumentación: Filtros

Filtro de Filtro
excitación barrera
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros
● Con el filtro de excitación seleccionamos la parte del espectro
que utilizaremos para excitar la muestra.
● La muestra emite fluorescencia en un espectro distinto al de
excitación y al mismo tiempo refleja parte del espectro
utilizado para la excitación.
● El filtro barrera se encarga de eliminar la parte del espectro
reflejado y nos permite visualizar el espectro de emisión
correspondiente al fluorocromo.

Filtro de Filtro
excitación barrera
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros
● Filtro de excitación: Selecciona el espectro de excitación.
● Espejo dicroico: Refleja la parte del espectro necesaria para
la excitación y transmite el resto.
● Filtro barrera: Deja pasar la parte de la emisión de la muestra
que nos interesa.
Filtro barrera
Filtro de excitación

Espejo dicroico

Muestra
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros
● Los fabricantes suelen proporcionar bloques de filtros que
son combinaciones de filtros de excitación y de emisión con
los apropiados espejos dicroicos.

● Los filtros se describen utilizando letras y números:


BP600/30, LP490, DD488/543, ...
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros
● Filtros de excitación y barrera:
BPxxx - Filtro Pasa Banda (Band Pass): Deja pasar una
banda determinada del espectro y bloquea el resto.
BP460-580: BP significa filtro pasa banda y los números
indican la luz que bloquea por debajo, 460 nm, y la que
bloquea por encima, 580 nm.

460 580
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros
● Filtros de excitación y barrera:
BPxxx - Filtro Pasa Banda (Band Pass): Deja pasar una
banda determinada del espectro y bloquea el resto.
BP600/30: Deja pasar una banda cuyo máximo es 600 nm
con una anchura de 30 nm.

30nm

600
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros
● Filtros de excitación y barrera:
SP600: SP significa filtro pasa bajos (short pass).
Deja pasar el espectro por debajo de un valor determinado,
en este caso 600 nm, y bloquea lo que está por encima de
ese valor.

600 nm
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros
● Filtros de excitación y barrera:
LP490: LP significa filtro pasa altos (long pass).
Deja pasar el espectro por encima de un valor determinado,
en este caso 490 nm, y bloquea lo que está por debajo de
ese valor.

490 nm
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros
● Filtros de excitación y barrera:
La combinación de filtros SP y LP permite recortar el espectro
por debajo del valor de SP y por encima del valor de LP
consiguiendo bandas muy estrechas.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros
● Espejos dicroicos:
También se describen con números y letras:
● RSPxxx: Espejo dicroico Reflexión Pasa Bajos, refleja por
debajo del valor indicado (xxx) y transmite el resto.

● DDxxx/yyy: Espejo doble dicroico, tiene dos picos en los que


refleja (xxx, yyy) y en el resto transmite.

● TDxxx/yyy/zzz: Espejo triple dicroico, refleja la luz en tres


picos (xxx, yyy, zzz) y transmite en el resto
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros
● Espejos dicroicos:
RSP490: refleja por debajo de 490 nm y transmite el resto.

490
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros

Filtro
Filtro de barrera
excitación

Espejo
dicroico

Fuente
de
emisión Muestra
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros
1.La lámpara emite luz en todo el espectro.
2.El filtro de excitación sólo deja pasar la parte del
espectro necesaria para excitar la muestra.
3.El espejo dicroico refleja hacia la muestra la
excitación correspondiente.
4.La muestra se excita con la luz que le llega y emite
en un espectro superior al de la excitación.
5.El espejo dicroico transmite la emisión de la
muestra.
6.El filtro barrera hace una selección exacta del
espectro de emisión que nos interesa.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Filtros

Filtro
Filtro de barrera
excitación

Espejo
dicroico

Fuente
de
emisión Muestra
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Objetivos
● Casi las mismas consideraciones se aplican a la
evaluación de los objetivos cuando se requieren
para microscopía de fluorescencia o de campo claro.
● La capacidad del objetivo para captar la luz juega un
papel esencial en la microscopía de fluorescencia.
● Para obtener una intensidad de la señal óptima se
debe emplear una apertura numérica elevada y el
menor aumento posible.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Objetivos
● Por otro lado, el tipo de vidrio que se utilice requiere
una buena transmisión de la longitud de onda que se
use, por eso, los más utilizados son los de fluorita o
los apocromáticos.
● También se deben utilizar objetivos con
autofluorescencia extremadamente baja.
5. Microscopía de fluorescencia

Instrumentación: Objetivos
● Puede ocurrir que aunque estén todos los factores
anteriores optimizados exista un ruido de fondo.
Éste se debería a la propia muestra debido a la
fijación, la autofluorescencia o a un proceso de
tinción inadecuado.
5. Microscopía de fluorescencia

Luz transmitida vs luz incidente


● Luz transmitida:

Los microscopios de fluorescencia antiguos eran


poco eficaces en luz transmitida.

Los lugares de fluorescencia débil eran difíciles de


observar entre la radiación que no era específica de
la fluorescencia.
5. Microscopía de fluorescencia

Luz transmitida vs luz incidente


● Luz transmitida:

El problema se solventó parcialmente utilizando


condensadoras de fondo oscuro.

La luz incidente sobre la muestra queda restringida a


un área que no entra en el objetivo.
Consecuentemente sólo la radiación que surge de la
dispersión o de la fluorescencia se recoge en la
lente objetivo. Los lugares de fluorescencia débil se
observan sobre un fondo oscuro.
5. Microscopía de fluorescencia

Luz transmitida vs luz incidente


● Luz transmitida:

Este sistema es más útil en aumentos bajos de


aproximadamente 40X y tiene la ventaja de que el
contraste es alto.

Una desventaja es que se requiere aceite de


inmersión no fluorescente o glicerol entre la parte
superior de la lente condensadora y la lente objetivo
para evitar pérdidas de luz de excitación.
5. Microscopía de fluorescencia

Luz transmitida vs luz incidente


● Luz incidente:

Con el desarrollo del espejo dicroico aumentó el


número de aplicaciones de la microscopía de
fluorescencia ya que hay muchas muestras que no
se pueden observar por transmisión.

El espejo dicroico lleva la radiación a través del


objetivo para la excitación y se usa de nuevo para
permitir la observación de la radiación fluorescente.
5. Microscopía de fluorescencia

Luz transmitida vs luz incidente


● Luz incidente:

De esta manera el objetivo funciona también como


condensadora y la intensidad de la fluorescencia es
inversamente proporcional a la cuarta potencia de
los aumentos.

El brillo máximo se obtiene con un ocular de


aumento mínimo y el objetivo de apertura numérica
máxima.
5. Microscopía de fluorescencia

Luz transmitida vs luz incidente


● Luz incidente:

Las ventajas son que la luz de excitación pasa a


través de menos superficies de vidrio y así se pierde
menos luz en el camino debido a absorción interna.

Como la lente objetivo también es condensadora el


área observada es la misma que el área iluminada.

Además no hace falta aceite de inmersión en la


condensadora.
5. Microscopía de fluorescencia

Aplicaciones
● Se aplica a la determinación cuantitativa de
aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y muchos
fluorocromos celulares (para ello se utiliza un
fotómetro que mide la intensidad de la fluorescencia
de una región específica de la muestra).
5. Microscopía de fluorescencia

Aplicaciones
● También es útil en el estudio de diferentes clases de
celulosa, tejidos vegetales, alimentos y
medicamentos, fibras animales, minerales en polvo,
detección de impurezas en mezclas homogéneas y
heterogéneas, polímeros, resinas, cristales líquidos,
telas, fibras, madera, papel, carbón mineral,
petróleo, cemento, vidrio, cerámica,
semiconductores, ciencia forense, farmacia,
restauración de arte, biología y medicina.

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