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INTERAÇÕES

ANTÍGENO-ANTICORPO

Detecção, quantificação e
caracterização dos
anticorpos e seu uso como
ferramenta para pesquisa e
diagnóstico
RESPOSTA DE ANTICORPOS

Quantidade
N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua
produção.
 Isotipo
Determina a persistência (meia vida in vivo diferente).
A composição determina a função dos Ac e os locais onde são
encontrados.
 Diversidade
 Valência
Características das interações Ag-Ac

Avidez

- Força de interações total entre Ac e Ag.


- Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos

Especificidade

- Capacidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ags.


Características das interações Ag-Ac

Reação cruzada
-
Dois Ag diferentes apresentam epítopos estruturalmente
semelhantes
- Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não
relacionado, mas com propriedades químicas similares.
INTERAÇÕES
 Reações reversíveis.

 Ligações não covalentes:


-Pontes de hidrogênio
-Interações hidrofóbicas
-Interações DD
-Ligações iônicas
MÉTODOS

1) Reagentes não marcados


• Reação de precipitação
• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados
• RIA
• ELISA
• Imunofluorescência
• Western Blotting
MÉTODOS
 PRECIPITAÇÃO APLICAÇÕES
- Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial
- Imunoeletroforese - Pesquisa
 AGLUTINAÇÃO - Diagnóstico
- Aglutinação direta e indireta - Soroepidemiologia
- Inibição da aglutinação
- Teste de Coombs
 IMUNOENSAIOS
- RIA
- ELISA
- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo
- Western Blotting
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
 Precipitação:
Formação de complexos Ag/Ac.

 Aglutinação:
É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas
de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas
adjacentes.

 As reações de precipitação e de aglutinação decorrem,


respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e
particulado.
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
 Interação entre Ac e Ag solúvel
 Ac precisa ser bivalente
 Ag precisa ser bi ou polivalente
 A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação
que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA

PRECIPITADO
É importante levar-se em conta como ocorre a
ligação Ag-Ac em diferentes concentrações
dos mesmos. Observe abaixo:

Anticorpo livre + - -
Antígeno livre - - +

100%--
Percentual
de

complexo
imune
Zona de excesso Zona de Zona de excesso
precipitado de anticorpo equivalência de antígeno
Quantidade de antígeno adicionado
TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL

IMUNODIFUSÃO
Imunodifusão Dupla:

• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as


soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac
IMUNODIFUSÃO DUPLA
 As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se
encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela
formação de uma linha de precipitação:
 Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das
proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com
corante
Utilização: muito usada em
pesquisa e diagnóstico de
algumas doenças, como
Ag Ag cisticercose

Ac

Ag Ag Ag Ag

Ac Ac

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Precipitação em gel
Imunodifusão Dupla
IMUNODIFUSÃO RADIAL

 Permite a quantificação do
antígeno ou do anticorpo.
 O processo continua até ser
atingida a zona de equivalência,
com os complexos precipitando-
se em um anel (halo) em torno
do orifício.

Utilização: dosagem
Poços onde são
de IgG, IgA e IgM e
colocados padrões
proteínas séricas.
e amostras a serem
dosados
Agarose
contendo Halo de precipitação
anticorpos IgG – anti-IgG
anti-IgG humana
IMUNOELETROFORESE
 Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são
separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
 As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de
acordo com os seus PM e cargas elétricas.
 Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se
difunde.
 Ag e Ac formam arcos de precipitação.
1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na canaleta
coluna

Ag
canaleta
+ -
Ag

3- Difusão e precipitação

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REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
 Ac + Ag multivalente particulado
 Título: maior diluição que ainda causa aglutinação
(semi-quantitativo)
 Prozona: excesso de Ac
 Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga
elétrica (repulsão)
 Agregação visível de
partículas = Eritrócitos,
bactérias, fungos e látex
 Teste de Aglutinação Passiva

Ag livres
são
agrupados
com
partículas
carreadoras
com Ac
específicos
AGLUTINAÇÃO DIRETA
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)


1) Amostra de sangue na placa teste:

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

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AGLUTINAÇÃO DIRETA
4) Mistura-se:

3) Controle negativo:

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AGLUTINAÇÃO DIRETA

5) Leitura do resultado:

negativo positivo

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação


visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como
ilustrado acima.

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AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Ag solúveis associados a outras superfícies
(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de


Chagas:

• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação


covalente) e então distribuídas nos poços da placa.

• O soro teste e os controles positivos e negativos,


devidamente diluídos, são adicionados aos poços da
referida placa.

• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se


aglutinam e formam uma camada no fundo do poço.
Quando não existe Ac específico, as células formam um
botão no fundo do poço.
Aglutinação Positiva
Negativa
 Teste de Inibição da Hemaglutinação

A capacidade de
hemaglutinação de
um vírus é
bloqueada quando
esse vírus reage
com o anticorpo
específico
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

+ Resultado negativo:
Urina Soro anti - hCG (ausência de hCG na
urina).
Adicionam-se Partículas Ocorre aglutinação,
revestidas com hCG pois os anticorpos
São incubados e
colocados numa anti-hCG não são
placa bloqueados na
incubação inicial,
porque não havia o
hormônio na urina.
Resultado positivo:
(presença de hCG
Livres, podem
na urina): não ocorre aglutinar as partículas
aglutinação. revestidas de hCG.

Ac se ligaram no hCG da urina,


(ficando bloqueados), na incubação inicial

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TESTE DE COOMBS
 Ac antiimunoglobulinas (Robert
Coombs);
 DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;
 Não aglutinam os eritrócitos;
 Direto: Ac ligados aos
eritrócitos fetais;
 Indireto: Ac anti-Rh não
aglutinantes no soro materno.
 Permite detectar
incompatibilidades Rh, prevenindo
contra DHRN.
 Teste de Neutralização

Os vírus infecciosos
quando interagem
com o anticorpo
específico são
neutralizados e por
conseguinte perdem a
capacidade de infectar
células permissivas
Teste de Fixação do Complemento

O complemento, um
agente lítico, é fixado
por um complexo Ag-
Ac.
1ª fase: o Ac, Ag e o
complemento são
misturados e
incubados.
2ª fase: O complexo
formado por hemácia-
Ac anti-hemácia é
adicionado a mistura
IMUNOENSAIOS
 Reagentes marcados (enzimas,
fluorocromos, isótopos)
 Tipos:
- RIA
- ELISA
- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO
- WESTERN BLOTTING
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
Princípio da técnica:

 Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente)


a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por
radiações UV, emite luz no espectro visível.
 Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo
conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e
vice-versa.
 A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas
que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV
(microscópio de fluorescência).
 Principais fluorocromos: fluoresceína e rodamina. Tipos: direta,
indireta.
Microscópio de fluorescência com epiluminação

fluorescência emitida
luz UV atinge o ma- chega ao observador
terial examinado
 Teste de Imunofluorescência Direta

Um conjugado de
especificidade
conhecida é adicionado
às células infectadas
por vírus que estão
fixados numa lâmina de
microscópio, ocorrendo
formação de complexo
Ag-Ac que é
visualizado pela
imunofluorescência
Imunofluorescência Direta
Aplicações:
- Detecção direta de microrganismos
(secreções, urina, cortes de tecidos);
- Identificação de subpopulações de
linfócitos;
- Fenotipagem de células tumorais

Ex.: Detecção de Chlamydia trachomatis


em secreção uretral
 Teste de Imunofluorescência Indireta
1ª fase:Ac não marcados
são adicionados a células
infectadas fixadas a uma
lâmina de microscópio.
Após incubação, as
lâminas são lavadas.
2ª fase:Um Ac
imunoglobulina +
fluoresceína é conjugado
e visto a microscopia de
fluorescência
Imunofluorescência Indireta

Aplicações:
- Detecção de anticorpos específicos contra
diversos microrganismos;
- Diagnóstico de doenças auto-imunes;

Ex.: Detecção de Ac anti- T. cruzi


Detecção de Ac anti-nuclear
IFA indireta

Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas


como:
 Doença de Chagas,
 SIDA/AIDS,
 Hepatites
 Complexos em doenças auto-imunes.

É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade


(fluorescência é mais intensa) e especificidade.
IMAGENS
Citometria de fluxo
- Detecta, separa e quantifica células contendo um antígeno
particular, marcadas com um fluorocromo;

- Cada anticorpo é marcado com um fluorocromo diferente;


- As células são então analizadas no citômetro de fluxo.
- É um teste qualitativo e quantitativo.
Citometria de fluxo

- As células saem de uma


célula de fluxo e são
iluminadas por um raio laser;

- A quantidade de raios laser


que é dispersa para fora das
células durante a passagem
das mesmas pelo laser pode
ser medida, o que
proporciona informação a
respeito do tamanho das
células.
- O laser pode também excitar o fluorocromo nas células e a
luz fluorescente emitida pode ser medida por um ou mais
detectores.
CD4
Aplicações:

-Caracterização de populações celulares;


CD8
- Contagem de microrganismos;

- Separação de populações celulares de


acordo com a densidade dos antígenos,
tamanho e granulosidade das células; CD19

- Análise de proliferação celular.


Ensaio Imunoadsorvente
Ligado à Enzima - ELISA
 O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois
conjugados com enzimas.

Fosfatase alcalina
Peroxidase
B-galactosidase

 O produto final corado surge por ação da enzima que converte


um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato
alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância
indicadora).
 A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através
de leitura em fotocolorímetro.
 Principais tipos de ELISA: Direto, indireto, sanduíche.
TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto
 Teste
Imunoenzi-
mático
(ELISA)
Ac
conjugados
com enzimas.
O resultado é
dado pela
mudança de
cor da reação.
TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto

INDIRETO DIRETO OU PLACA


SANDUÍCHE UTILIZADA
 Aplicações do ELISA:
 Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de
Pesquisa

 Vantagens:
 Teste de alta sensibilidade
 Permite quantificar Ag ou Ac das amostras
 Seguros e de baixo custo
RADIOIMUNOENSAIO - RIA
 Marcações:
 I125: emite raios gama

 H3: raios beta

 Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
Radioimunoensaios
Utilizam Ac conjugados com radioisótopos
para quantificar os ensaios.
• Vantagens:
– Reprodutibilidade
– Alta sensibilidade(em torno de 10-12g)
– Especificidade
– Permite medidas rápidas e precisas

• Desvantagens:
– Custo
– Vida média dos reagentes
– Risco operacional (radiação)
Eletroforese

Consiste na separação,
através do tamanho molecular,
dos segmentos genômicos dos
microrganismos em gel . Os
seguimentos podem ser
visualizados após a coloração
do gel.
WESTERN BLOTTING

Immunoblotting (western blotting) é um


imunoensaio em suporte sólido que utiliza
antígenos imobilizados para detectar
anticorpos contra proteínas específicas.

A técnica é usada principalmente para


confirmação ou teste suplementar, como o
objetivo de verificar o resultado obtido em
outro teste.
WESTERN BLOTTING
 Eletroforese de
proteínas.
 Identifica
antígenos ou
anticorpos.
WESTERN BLOTTING
WESTERN BLOTTING
HIV – Diagnóstico
Questões Proposta
1. Qual a principal diferença entre os métodos de ELISA e
imunofluorescência?

2. Em uma tipagem sanguínea houve aglutinação ao se misturar o


sangue pesquisado e os soros anti-AB e anti-Rh. Determine o tipo
sanguíneo e faça um esquema explicando a reação ocorrida.

3. Quais as características do anticorpo que podem influenciar a sua


ligação ao antígeno?

4. Ao realizar os exames pré-natais, a gestante J.A.C, 26 anos,


apresentou teste ELISA positivo para HIV. Como você interpreta
este resultado? Qual a conduta que deve ser realizada?Descreva
suscintamente a reação ocorrida.

5. Qual imunoensaio você escolheria para o acompanhar o


prognóstico de um paciente com linfoma? Justifique sua resposta.