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Resistencia a bacterias fitopatógenas mediante ingeniería genética
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Alejandro Mentaberry
University of Buenos Aires
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Agrobiotecnología
Curso 2011
Bacterias fitopatógenas
Interacciones planta-bacteria
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Géneros Géneros Especies
y especies División Firmicutes
(gram positivos)
de bacterias Arthrobacter
Clavibacter ilicis
Curtobacterium flaccumfaciens
Rhodococcus fascians
División Gracillicutes
(gram negativos)
Clase Proteobacteria
Subclase alfa
Familia Rhizobiaceae
Agrobacterium rhizogenes, rubi, tumefaciens,
vitis
Familia (sin nombre)
Rhizomas suberifaciens
Agrobiotecnología Subclase beta
Familia Comamonadaceae
Resistencia
a bacterias
Acidovorax avenae (subsp. avenae,
fitopatógenas
citrulli)
Xylophilus ampelinus
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Géneros
Géneros Especies
y especies Subclase
Subclase Gamma
gamma
Familia Pseudomonadaceae
Xylella fastidiosa
Resistencia
a bacterias Géneros de afiliaciónincierta
fitopatógenas Streptomyces Spp.
Agrobiotecnología
500 nm
Filamentos ramificados,
micelios aereos y cadenas
de esporas características
de Streptomyces spp.
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
A B A B
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.
Microscopía electrónica de
barrido de la
lesión del cancro
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias Tomado de: Daniels. IRL Press, 1993.
fitopatógenas Síntomas de cancrosis en frutos,
hojas y ramas de Citrus.
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
Arriba izquierda:
Infección de
tubérculos de
papa
por Streptomyces
scabies (escaras)
Abajo izquierda:
Infección de fruto
de tomate por
Clavibacter
michiganensis
(cancros)
Derecha:
Infección de
tubérculos de
papa por Erwinia
carotovora subsp.
atroséptica
(podredumbre
blanda)
Pulverización
de citrus con
un preparado a
base de sulfato
de cobre de
para el control
de cancrosis
Métodos de control de bacteriosis en cultivos
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
La enfermedad
resulta de la • No se produce enfermedad cuando:
interacción entre - La planta posee defensas preformadas o su sistema
. defensivo reconoce moléculas presentes en la
el hospedante, . superficie del patógeno (PAMPs; patrones moleculares
el patógeno y el . asociados al patógeno) desencadenando una respuesta
. de protección general (resistencia de no específica).
medio ambiente
- Se gatillan los mecanismos defensivos inducibles de la .
. planta (Respuesta Hipersensible, Resistencia Sistémica
. Adquirida) y el patógeno resulta restringido en la zona inicial
. de la infección. (resistencia específica).
- Las condiciones ambientales externas cambian y el
. patógeno muere antes de llegar a una etapa en que la
. infección es irreversible.
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
(variedades) (variedades)
Agrobiotecnología
Resistencia
Modificado de: Keen, Nat. Biotechnol., 1999.
a bacterias
fitopatógenas
Factores que intervienen en la interacción planta-patógeno
Factores de
virulencia:
SIDEROFOROS FITOTOXINAS
PROTEINAS
EXOPOLISACARIDOS BACTERIA NUCLEADORAS
EXOENZIMAS FITOHORMONAS
BACTERIOCINAS
Parasitismo
HR y
Pared defensa
celular
Modelo de patogenia bacteriana que involucra la liberación mediada por el sistema Hrp de
factores de patogenicidad y factores de avirulencia dentro de la célula vegetal
Defensas inducibles en las plantas
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
La planta y su sistema defensivo
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias Modificado de: Keen, Ann. Rev. of Gen., 1990.
fitopatógenas Para que exista resistencia (incompatibilidad) se requiere un gen Avr
del patógeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. En presencia
de los alelos recesivos ocurre la enfermedad (compatibilidad)
Localización
de proteínas
de resistencia
y esquema
de sus
dominios
funcionales
Interacción
R2
proteína “guardiana”
moleculares BA
Adaptado de: Lamb et al., Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol., 1997.
COL1
EIN2
CET1/CET3: constitutive expression of thionin 1/3; COI1: coronatine insensitive 1; EDR1: enhanced disease resistance 1; EN2: ethylene-
insensitive 2; NRD1: non-race specific disease resistance 1; PAD4: phytoalexin-deficient 4; PDF1.2: plant defensin 1.2; Pti4/5/6: factores de
transcripción Pto-interacting 4, 5 and 6; SID2: SA induction deficient 2; SS2: suppressor of salicylate insensitivity of NPR1-5.
TGAs: factores de transcripción de unión a TGACG
Genes involucrados en resistencia local a patógenos
SIR SAR ISR
Dth9: detachment 9;
ISR1: induced systemic
resistance 1;
Independiente de SAR JAR1: JA resistance 1;
NPR1-1 inducible;
SNI1: suppressor of SAR
SON1: suppressor of nim1-1;
SAG: salicylic acid glucoside.
Dir1?
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias
por medio de ingeniería genética
Especie Nivel de
Proteína Origen Resistencia a
transgénica resistencia
Producción de compuestos antibacterianos no vegetales
Shiva-1 Gusano de seda Tabaco Ralstonia solanacearum Parcial
MB39 Gusano de seda Tabaco Pseudomonas syringae pv. tabaci Parcial
Atacina E Gusano de seda Manzano Erwinia amylovora Parcial
Lisozima Bacteriofago T4 Papa Erwinia carotovora Parcial
Lisozima Humano Tabaco Pseudomonas syringae pv. tabaci Parcial
Lactoferrina Humano Tabaco Ralstonia solanacearum Parcial
Taquiplesina Cangrejo herradura Papa Erwinia carotovora Parcial
Especie Nivel de
Proteína Origen Resistencia a
transgénica resistencia
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.
fitopatógenas
En rojo: aminoácidos básicos (cargados positivamente)
En verde: aminoácidos hidrofobitos
La estructura
Mecanismos de acción postulados
anfipática para péptidos antimicrobianos
de los péptidos
antimicrobianos
determina
su especificidad
y mecanismo de
acción
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
8.105
8.105
Agrobiotecnología
Transgénica Wild type
Resistencia
Tomado de: Chakrabarti, Planta, 2003.
a bacterias
Bioensayos en plantas de tabaco transformadas con el gen MSI-99. Se trataron
fitopatógenas
áreas de 5-7 mm de hojas de plantas transformadas R0 y de plantas control con
un papel de lija fino y se inocularon en las mismas 10 µl de 8x105, 8x104, 8x103
y 8x102 células de Pseudomonas syringae pv tabaci.
Resistencia
a bacterias Expresión de sarcotoxina en plantas
transgénicas de cítricos
mediada por
sarcotoxina,
un péptido
aislado de
Sarcophaga
peregrina
Agrobiotecnología
La resistencia
fue clasificada
determinando
la superficie
macerada
sobre el total
de la superficie
de cada disco.
En a) se
muestra el
promedio de 5
experimentos;
en b) se
muestra el
promedio de 4
experimentos.
La edad de los
tubérculos fue
de 2-3 meses
Evaluación de resistencia mediante ensayos de maceración
en plantas de papa transformadas con lisozima del fago T4
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Tomado de: Düring et al. The Plant Journal, 1993.
Ensayos de
infección con
Erwinia
carotovora
de plantas
transgénicas
(derecha) y
controles
(izquierda) de
Solanum
tuberosum
que expresan
combinaciones
de uno, dos y
tres genes
antimicrobianos
controles transgénicas controles transgénicas
Ensayos de maceración en tubérculos de plantas transgénicas
Ensayos de
maceración
en
tubérculos
de Solanum
tuberosum
inoculados
con Erwinia
carotovora
Las tioninas
son proteínas Desarrollo de plantas de tabaco
ricas en que expresan tioninas de trigo y de cebada
cisteína
tóxicas para
las bacterias
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Tomado de: Carmona et al., The Plant Journal, 1993.
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas
con Pseudomonas syringae pv tabaci
Lesiones causadas por las bacterias 6 días después
UP1 WT de la inoculación en plantas transformadas con la
tionina de cebada (UP1) y no transformadas (WT)
El desarrollo de la infección
se midió titulando el número
de bacterias. Los títulos en las
plantas UP1 a las 34 y 48 h
fueron significativamente
diferentes de los de las
(trigo) plantas UP3 y controles. Los
títulos en UP3 no son
significativamente diferentes
de los de los controles
(cebada)
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas
con Pseudomonas syringae pv tabaci
La OCTasa de
Pseudomonas es
insensible a su propia
toxina.
Se la expresó la secuencia
de la la OCTasa en plantas
para proteger de la acción
de la faseolotoxina.
A la secuencia de la
OCTasa se le agregó una
señal de transporte al
cloroplasto (en plantas, ruta
faseolotoxina
de síntesis cloroplastídica).
Ensayos con faseolotoxina
en plantas transgénicas SSU-OCTasa
Agrobiotecnología
Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.
Resistencia
a bacterias A: Clorosis típica inducida en hojas de Phaseolus tratadas con faseolotoxina.
fitopatógenas B y D: Plantas control independientes no transformadas tratadas con faseolotoxina.
C y E: Plantas transgénicas independientes tratadas con faseolotoxina. Todos los
tratamientos en las hojas fueron con 2 µl de una solucion de 3 µg/ml de toxina.
Las flechas señalan los sitios de inoculación de la toxina
Ensayos con Efecto de la inoculación con Pseudomonas syringae pv
Pseudomonas phaseolitica sobre las plantas transgénicas OCTasa
syringae en A B
plantas
transgénicas
SSU-OCTasa
C D
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.
Plantas control
Plantas transgénicas
C
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Zhang et al., Nature Biotech. 2000.
Transformación de arroz con el gen de resistencia Xa21
Planta transgénica
Planta control
glucosa oxidasa
β-D-glucosa + O2
. ácido glucónico + H2O2
Inhibición del
crecimiento Erwinia
carotovora en discos
de tubérculos de
plantas transgénicas
Se midió el número de
bacterias entre 1 y 5 días
luego de la inoculación.
Los símbolos vacíos
corresponden a los
controles de plantas no
transformadas o
transformadas con el
vector vacío. Los símbolos
llenos corresponden a dos
líneas transgénicas que
expresan el gen de
glucosa oxidasa
Ensayos de infección in vitro con Erwinia carotovora
de plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Un gran número
de bacterias Quorum sensing
Gram – se
• Mecanismo de comunicación comunitario presente en
comunican . diversas especies de bacterias. Fue detectado por
sintetizando, . primera vez en Vibrio fischeri
secretando y • Capacidad de los microorganismos de percibir y
respondiendo a . responder a la densidad poblacional a través de la
. producción de moléculas difusibles de reducido peso
compuestos . molecular
difusibles
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Moléculas señal: acil-homoserin lactonas (AHSLs)
El incremento de una población bacteriana determina una
elevada concentración de factores difusibles
Proteína R
activada
Agrobiotecnología
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
endoglucanasas ,
proteasas y polisacáridos
estrategia
de resistencia
antimicrobiana
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Mecanismos que afectan la regulación
mediada por homoserin lactonas
Enzimas degradadoras de A-
- HSLs
Porcentajes de
Agrobiotecnología infección observados
para dos líneas
Resistencia transgénicas (barras
a bacterias verde y anaranjada) y
fitopatógenas de una planta control,
no transgénica (barra
violeta).
Tomado de: Mae et al., MPMI, 2001.
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