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Resistencia a bacterias fitopatógenas mediante ingeniería genética
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Alejandro Mentaberry
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Agrobiotecnología
Curso 2011

Resistencia a bacterias fitopatógenas


mediante ingeniería genética
Alejandro Mentaberry

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular


Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Sumario

Bacterias fitopatógenas

Interacciones planta-bacteria

Defensas inducibles en las plantas

Estrategias para desarrollar resistencia a


bacterias mediante ingeniería genética
- Péptidos antimicrobianos
- Lisozimas
- Tioninas
- Genes de resistencia
- Glucosa oxidasa
- Ornitil carbamoil transferasa

Inhibición de la regulación de factores de


virulencia
Agrobiotecnología
Referencias
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Bacterias fitopatógenas

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Géneros Géneros Especies
y especies División Firmicutes
(gram positivos)
de bacterias Arthrobacter
Clavibacter ilicis

fitopatógenas iranicus, rathayi, tritici,


michiganensis (subsp.
michiganensis, insidiosus,
nebraskensis, sepedonicus,
tessellarius)
xyli (subsp. xyli, cynodontis)

Curtobacterium flaccumfaciens
Rhodococcus fascians

División Gracillicutes
(gram negativos)
Clase Proteobacteria
Subclase alfa
Familia Rhizobiaceae
Agrobacterium rhizogenes, rubi, tumefaciens,
vitis
Familia (sin nombre)
Rhizomas suberifaciens
Agrobiotecnología Subclase beta
Familia Comamonadaceae
Resistencia
a bacterias
Acidovorax avenae (subsp. avenae,
fitopatógenas
citrulli)
Xylophilus ampelinus
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Géneros
Géneros Especies
y especies Subclase
Subclase Gamma
gamma

de bacterias Familia Enterobacteriaceae

fitopatógenas Erwinia amylovora, nigrifluens, quercina,


rubrifaciens, stewartii,
tracheiphila, herbicola, ananas,
carotovora ( subsp. carotovora,
atroseptica, betavasculorum),
chrysanthemi, rhapontici

Familia Pseudomonadaceae

Pseudomonas 1) fuscovaginae, marginalis,


tolaasii
2)
amygdali
amygdali
3) syringae, viridiflava
4) chicorii
5) corrugata

Familia (sin nombre)

Xanthomonas albilineans , campestris,


fragariae, graminis, oryzae,
populi
Agrobiotecnología Familia (sin nombre)

Xylella fastidiosa
Resistencia
a bacterias Géneros de afiliaciónincierta
fitopatógenas Streptomyces Spp.

Tomado de Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.


Esquema de Principales componentes de la ultraestructura
de una bacteria fitopatógena típica
una bacteria
fitopatógena
β

Adaptado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.

Agrobiotecnología

Resistencia Microscopía electrónica de Erwinia


a bacterias pyrifoliae, patógeno del peral. Pueden
fitopatógenas observarse el glicocálix y varios pili.
Bacterias fitopatógenas Gram negativas y Gram positivas

Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.


Microscopía electrónica de
La mayoría de las bacterias
células de Xhantomonas
fitopatógenas tienen forma de con un flagelo polar (arriba)
bastones cortos de 0,6-3,5 µm y de Peudomonas con
de longitud y 0,5-1 µm de diámetro flagelos lofotricos (abajo)

500 nm

Filamentos ramificados,
micelios aereos y cadenas
de esporas características
de Streptomyces spp.

Microscopía electrónica de barrido de células


de Pseudomas syringae.
Ciclo biológico
de una bacteria
fitopatógena
con fase epifita

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas

Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.


Las bacterias fitopatógenas utilizan a los estomas
y lenticelas como vías naturales de ingreso a la planta

Ingreso y dispersión de fitobacterias por aperturas naturales

Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.

Microscopía de barrido de la superficie Pseudomonas syringae pv. morsprunorum exudando


del envés de una hoja de cítrico. de los estomatas de hojas de cerezo infectadas
Se observan células de Xanthomonas citri
colonizando la cavidad subestomática
Muchas bacterias fitopatógenas se localizan en el apoplasma

La mayor parte de las bacterias fitopatógenas se acumula en el espacio


extracelular o en el tejido vascular y utiliza esta vía y los tejidos conductivo
para colonizar diferentes órganos de la planta

A B A B
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.

Microscopía electrónica de Xanthomonas Microscopía electrónica de una sección longitudinal (A)


campestris colonizando una hoja y transversal (B) de Pseudomonas syringae pv tabaci
de Brassica. Las bacterias están en el espacio intercelular del mesófilode hojas de tabaco.
generalmente rodeadas de un polisacárido
extracelular (EPS) y proliferan en estrecho
contacto con las paredes celulares (CW)
Principales tipos de enfermedades bacterianas
y síntomas que producen en el huésped

Tipo de Síntomas Tejidos afectados Patógenos


enfermedad
Manchas foliares Necrosis con hidroceles Espacios intercelulares Principales especies
y en frutos Manchas angulares o alargadas y necrosis del fitopatógenas de
Manchas necróticas con halo parénquima Pseudomonas y
Xanthomonas
Perdigonado de hojas
Clorosis de hojas jóvenes
Desecamiento foliar
Manchas en frutos
Exudados
Chancros y Necrosis de la corteza Invasión del floema y Pseudomonas
marchitamieto Marchitamientoo desecamiento de xilema a través de syringae pv. syringae
en plantas brotes jóvenes y corimbos florales heridas, yemas, Erwinia amylovora
leñosas Necrosis de yemas cicatrices foliares, hojas Xanthomonas axonopodis
jóvenes y flores
Gomosis
Marchitamientos Marchitamiento Invasión del floema y Clavibacter y
en plantas Enanismo xilema Curtobacterium
herbáceas Podredumbre en anillo P. solanacearum
Manchas en ojo de pájaro Algunas Erwinias y
Xanthomonas
Principales tipos de enfermedades bacterianas
y síntomas que producen en el huésped
Tipo de Síntomas Tejidos afectados Patógenos
enfermedad
Podredumbres Pudrición blanda de tubérculos, Maceración de la lámina Erwinias pectinolíticas y
blandas bulbos o rizomas media y pared primaria algunas Pseudomonas
Pie negro celular

Hiperplasia y Tumores en cuello y raíz Estimulación anormal de la Agrobacterium


proliferación Tumores en ramas división celular y del Rhodococcus fascians
Hiperproliferación radicular crecimiento de tejidos P. syringae pv. savastanoi
meristemáticos
Roñas o Necrosis eruptivas rugosas, con Tejidos más externos Streptomyces
costras costras o pústulas y epidérmicos,
suberificadas subepidérmicos y
parenquimáticos

Microscopía electrónica de
barrido de la
lesión del cancro
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas

Infección de geranio por


Xhantomonas hortorum pv pelargonii
(clorosis y necrosis foliar)

Infecciones de caña de azúcar por


Pseudomonas rubrilineas (bandas
necróticas; arriba derecha) y de
Platycerium bifurcatum por
Pseudomonas gladioli (lesiones
necróticas; derecha)
Infección por
Xanthomonas
axonopodis
(cancro de
los cítricos)

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias Tomado de: Daniels. IRL Press, 1993.
fitopatógenas Síntomas de cancrosis en frutos,
hojas y ramas de Citrus.
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas

Infección de peral (arriba)


y de manzano (derecha) por
Erwinia amylovora (tizones)
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas

Arriba izquierda:
Infección de
tubérculos de
papa
por Streptomyces
scabies (escaras)

Abajo izquierda:
Infección de fruto
de tomate por
Clavibacter
michiganensis
(cancros)

Derecha:
Infección de
tubérculos de
papa por Erwinia
carotovora subsp.
atroséptica
(podredumbre
blanda)

Tomado de: Scnaad et al. APS Press, 2001.


Síntomas de algunas enfermedades bacterianas

Infección de una cucurbitácea por Erwinia tracheiphila


(invasión del xilema con goma bacteriana)
Métodos de control de bacteriosis en cultivos

• No existe control químico eficiente


• Pulverizaciones a base de cobre

Pulverización
de citrus con
un preparado a
base de sulfato
de cobre de
para el control
de cancrosis
Métodos de control de bacteriosis en cultivos

• Erradicación y quema de las plantas infectadas

Quema de citrus infectados con cancrosis


Interacciones planta-bacteria

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
La enfermedad
resulta de la • No se produce enfermedad cuando:
interacción entre - La planta posee defensas preformadas o su sistema
. defensivo reconoce moléculas presentes en la
el hospedante, . superficie del patógeno (PAMPs; patrones moleculares
el patógeno y el . asociados al patógeno) desencadenando una respuesta
. de protección general (resistencia de no específica).
medio ambiente
- Se gatillan los mecanismos defensivos inducibles de la .
. planta (Respuesta Hipersensible, Resistencia Sistémica
. Adquirida) y el patógeno resulta restringido en la zona inicial
. de la infección. (resistencia específica).
- Las condiciones ambientales externas cambian y el
. patógeno muere antes de llegar a una etapa en que la
. infección es irreversible.

• Se produce enfermedad cuando:

Agrobiotecnología - Las defensas preformadas son inadecuadas


Resistencia - El patógeno es capaz de neutralizar las respuestas
a bacterias . defensivas de la planta y/o de retardar el inicio de las mismas
fitopatógenas
- Las condiciones externas son favorables para la infección
La especificidad
del patógeno
bacteriano y de
los genes de
resistencia de
la planta
determinan
diferentes tipos
de interacción

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
(variedades) (variedades)

Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997.


Interacciones
planta-bacteria Eventos de señalización
que regulan la interacción planta-bacteria

Agrobiotecnología

Resistencia
Modificado de: Keen, Nat. Biotechnol., 1999.
a bacterias
fitopatógenas
Factores que intervienen en la interacción planta-patógeno

Factores de patogenicidad: imprescindibles


para general la enfermedad; no determinan
los síntomas en forma directa (ejemplo,
proteínas hrp; proteínas vir)

Factores de
virulencia:

Factores de virulencia: responsables de la


sintomatología; modulan la gravedad de la
enfermedad (ejemplo, toxinas, enzimas
degradadoras, fitohormonas)

Factores de Requeridos para el reconocimiento del


avirulencia: patógeno por parte de la planta
Factores secretados por bacterias fitopatógenas

SIDEROFOROS FITOTOXINAS

PROTEINAS
EXOPOLISACARIDOS BACTERIA NUCLEADORAS

EXOENZIMAS FITOHORMONAS

BACTERIOCINAS

Algunos factores bioquímicos producidos por las bacterias fitopatógenas que


tienen una función en la virulencia y en la colonización de la planta huésped
Sistemas de secresión en bacterias Gram negativas

Tomado de: Nature Reviews Microbiology, 2009.


El sistema de secreción de tipo III
Secresión de proteínas mediada por el
sistema Hrp
La región de patogenicidad Hrp contiene:
- El agrupamiento conservado de genes hrp
(subconjunto hrc en púrpura)
- El gen hrpZ que codifica a la harpina HrpZ (Z
amarilla)
- Multiples genes avr (cruzado) en regiones
Nutrientes flanquentes variables

Agua El sistema Hrp (tipo III) secreta:


-HrpZ al medio (parte del aparato de
Incremento secresión extracelular?)
de pH
- Proteínas Avr directamente dentro de la
célula vegetal (transferencia gatillada por
contacto con el hospedante?)

Parasitismo

HR y
Pared defensa
celular

Factores de incompatibilidad (avirulencia)


Factores de compatibilidad (virulencia)
- Un amplio espectro de proteínas del hospedante codificadas por genes R
- Las proteínas secretadas por el sistema Hrp (símbolos rojos/verdes) interactúan
(símbolos negros) acopladas a las rutas de señalización de las respuestas
con la proteínas o ácidos nucleicos del hospedante (símbolos negros)
defensivas (flechas en zig-zag) conforman el sistema de vigilancia
- Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran)
- Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran)
- Las mutantes bacterianas poseen fenotipos de virulencia débil (parte verde de
- La Respuesta Hipersensible (HR) es gatillada por la interacción de cualquier
los símbolos rojos/verdes)
par correspondiente de proteínas R y Avr (parte roja de los símbolos
- Estas proteínas promueven colectivamente el parasitismo vía:
rojos/verdes) o de proteínas R y productos enzimáticos Avr (no se muestran)
. Supresión de las defensas?
- Las interacciones avirulentes son epistáticos sobre las interacciones
. Promoviendo la síntesis o liberación de nutrientes
virulentas (compatibles)

Modelo de patogenia bacteriana que involucra la liberación mediada por el sistema Hrp de
factores de patogenicidad y factores de avirulencia dentro de la célula vegetal
Defensas inducibles en las plantas

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
La planta y su sistema defensivo

Respuesta Hipersensible (HR) y Resistencia Sistémica Adquirida (SAR)


en el sistema de genes RPS2-avrRPt2/RPM1-avrRPM1

RPS2 (Resistance to P. syringae 2) confiere


resistencia a cepas que expresa el factor de
avirulencia avrRpt2. RPM1 de A. thaliana
(Resistance to P. syringae pv maculicola 1)
confiere resistencia a cepas que que expresan
el gen de avirulencia avrRPM1.

Adaptado de: Mackey et al., Cell, 2003.


El modelo gen
El modelo de resistencia “gen por gen” (Flor, ca. 1940)
por gen explica
los casos de
compatibilidad de
incompatibilidad
planta-patógeno

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias Modificado de: Keen, Ann. Rev. of Gen., 1990.
fitopatógenas Para que exista resistencia (incompatibilidad) se requiere un gen Avr
del patógeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. En presencia
de los alelos recesivos ocurre la enfermedad (compatibilidad)
Localización
de proteínas
de resistencia
y esquema
de sus
dominios
funcionales

Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.


Agrobiotecnología
BS2: gen de resistencia de pimiento que confiere resistencia a Xanthomonas campestris pv vesicatoria; Cf-2,4,5 y 9: genes de
resistencia a las razas 2, 4, 5 y 9 de Cladosporium fulvum; FLS2: gen de resistencia a bacterias de Arabidopsis thaliana; L6: gen
Resistencia de resistencia a la roya del lino 6; PBS1: gen de A. thaliana que confiere resistencia a Pseudomonas syringae; Pto: gen de
a bacterias resistencia a P. syringae pv. tomato; RPG1: gen de resistancia a Puccinia graminis sp. tritici 1; RPM1: gen de resistencia a P.
fitopatógenas syringae pv. maculicola; RPP5: gen de resistencia a Peronospora parasitica; RPW8: gen de resistencia de A. thaliana que
confiere resistencia a Erysiphe orontii, E. cichoracearum y Oidium lycopersici; RRS1: gen de resistencia a Ralstonia
solanacearum 1; Xa21: gen de resistencia a X. oryzae pv. Oryzae; Va1 y Va2: genes de resistencia de tomate que confieren
resistencia a Verticillium alboatrum. ECS: señal de endocitosis; NLS: secuencia de localización nuclear; PEST: secuencia Pro-
Glu-Ser-Thr-like; CC: dominio coiled-coil; NB: dominio de unión a nucleótidos; TIR: domino similar a Toll/receptor de
interleuquina; LRR: leucine rich repeat; WRKY: dominio de “dedos de zinc” . Dominios 1-4: sin homología conocida.
Modelo de interacción proteína R/factor de avirulencia:
hipótesis de la “proteína guardiana”

Interacción

R2

proteína “guardiana”

Adaptado de: Loh et al., Curr. Opin. in Biotechnol., 2002.


Las respuestas Procesos defensivos inmediatos, locales y sistémicos
defensivas comprendidos en una respuesta inducible
inducibles por
patógenos
comprenden
diversos
mecanismos Cl -

moleculares BA

Adaptado de: Lamb et al., Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol., 1997.

Agrobiotecnología - Engrosamiento de la pared celular


- Inducción de genes involucrados en la síntesis
Respuesta de metabolitos secundarios. Síntesis de fitoalexinas
Resistencia defensiva - Síntesis de tioninas
- Síntesis de proteínas relacionadas con la defensa (PRs)
a bacterias
a patógenos
fitopatógenas - Síntesis de ácido salicílico Inducción de Resistencia
Sistémica Adquirida (SAR)
Genes involucrados en resistencia local a patógenos
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.

COL1

EIN2

CET1/CET3: constitutive expression of thionin 1/3; COI1: coronatine insensitive 1; EDR1: enhanced disease resistance 1; EN2: ethylene-
insensitive 2; NRD1: non-race specific disease resistance 1; PAD4: phytoalexin-deficient 4; PDF1.2: plant defensin 1.2; Pti4/5/6: factores de
transcripción Pto-interacting 4, 5 and 6; SID2: SA induction deficient 2; SS2: suppressor of salicylate insensitivity of NPR1-5.
TGAs: factores de transcripción de unión a TGACG
Genes involucrados en resistencia local a patógenos
SIR SAR ISR
Dth9: detachment 9;
ISR1: induced systemic
resistance 1;
Independiente de SAR JAR1: JA resistance 1;
NPR1-1 inducible;
SNI1: suppressor of SAR
SON1: suppressor of nim1-1;
SAG: salicylic acid glucoside.

Dir1?

Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.


Estrategias para desarrollar resistencia
a bacterias mediante ingeniería genética

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias
por medio de ingeniería genética

Especie Nivel de
Proteína Origen Resistencia a
transgénica resistencia
Producción de compuestos antibacterianos no vegetales
Shiva-1 Gusano de seda Tabaco Ralstonia solanacearum Parcial
MB39 Gusano de seda Tabaco Pseudomonas syringae pv. tabaci Parcial
Atacina E Gusano de seda Manzano Erwinia amylovora Parcial
Lisozima Bacteriofago T4 Papa Erwinia carotovora Parcial
Lisozima Humano Tabaco Pseudomonas syringae pv. tabaci Parcial
Lactoferrina Humano Tabaco Ralstonia solanacearum Parcial
Taquiplesina Cangrejo herradura Papa Erwinia carotovora Parcial

Inhibición de la patogenicidad o de factores de virulencia bacterianos


Proteína de
Pseudomonas
resistencia a Tabaco Pseudomonas syringae Total
syringae pv. tabaci
tabtoxina
OCTasa Pseudomonas
Pseudomonas syringae pv.
insensible a syringae pv. Haba Total
phaseolicola
faseolotoxina phaseolicola
Modificado de: Düring et al., Mol. Breed. 1996.
Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias
por medio de ingeniería genética

Especie Nivel de
Proteína Origen Resistencia a
transgénica resistencia

Incremento de los sistemas de defensa naturales


Pectato liasa Erwinia carotovora Papa Erwinia carotovora Parcial
Proteína Xa21 Cultivares resistentes Arroz Xanthomonas oryzae Total

Glucosa oxidasa Aspergillus niger Papa Erwinia carotovora Parcial

Pseudomonas syringae pv.


Tionina Cebada Tabaco Parcial
tabaci

Muerte celular inducida artificialmente en el sitio de infección


Halobacterium Pseudomonas syringae pv.
Bacterio-opsina Tabaco Total
halobium tabaci
Interferencia con el mecanismo de quorum sensing
aiiA Bacillus spp. Tabaco Erwinia carotovora Parcial
ExpR Erwinia carotovora Tabaco Erwinia carotovora Parcial
Modificado de: Düring et al., Mol. Breed. 1996.
Péptidos Estructuras de algunos péptidos antimicrobianos
antimicrobianos

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.
fitopatógenas
En rojo: aminoácidos básicos (cargados positivamente)
En verde: aminoácidos hidrofobitos
La estructura
Mecanismos de acción postulados
anfipática para péptidos antimicrobianos
de los péptidos
antimicrobianos
determina
su especificidad
y mecanismo de
acción

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas

Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.


Mecanismos de acción postulados para péptidos antimicrobianos

Modelo de Shai-Matzusaki-Huang para el mecanismo de acción de péptidos líticos


A: reconocimiento de la
membrana bacteriana.
B: inserción a la
membrana mediada por
la atracción
electrostática
C: formación de poros
en la membrana.
D: transporte de
péptidos y lípidos a la
capa interna de la
membrana.
E: acción de los
péptidos sobre
“blancos” intracelulares
F: colapso de la
membrana bacteriana y
ruptura de la célula.
Llípidos en amarillo:
carga negativa. Lípidos
en negro: sin carga neta

Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.


Expresión en Transformación de cloroplastos de tabaco
plantas de un con el gen del análogo de magainina MSI-99
8.104 8.105 8.105
péptido lítico
antimicrobiano
análogo de 8.102
8.103
magainina 8.102
8.103

Transgénica Wild type

8.105
8.105

Agrobiotecnología
Transgénica Wild type
Resistencia
Tomado de: Chakrabarti, Planta, 2003.
a bacterias
Bioensayos en plantas de tabaco transformadas con el gen MSI-99. Se trataron
fitopatógenas
áreas de 5-7 mm de hojas de plantas transformadas R0 y de plantas control con
un papel de lija fino y se inocularon en las mismas 10 µl de 8x105, 8x104, 8x103
y 8x102 células de Pseudomonas syringae pv tabaci.
Resistencia
a bacterias Expresión de sarcotoxina en plantas
transgénicas de cítricos
mediada por
sarcotoxina,
un péptido
aislado de
Sarcophaga
peregrina

Tomado de: Ohshima et al. J. Biochem., 1999.


Agrobiotecnología

Resistencia Hojas de plantas de naranja inoculadas con Xanthomonas axonopodis


a bacterias pv. Citri (104 ufc/mL), bacteria causante de la cancrosis en cítricos.
fitopatógenas Izquierda: planta control no transgénica; derecha: planta transgénica que
expresa el gen de sarcotoxina. Fotos obtenidas a los 26 d post-infección.
La lisozima es
Resistencia antibacteriana en plantas de papa
una enzima transformadas con el gen de lisozima del fago T4
de reconocida
acción
bacteriolítica

Agrobiotecnología

Resistencia Tomado de : Düring et al. The Plant Journal, 1993.


a bacterias
fitopatógenas Estructura del vector pSR-2 conteniendo el gen quimérico de la lisozima
del fago T4 fusionado a la secuencia codificante del péptido señal de
α-amilasa de cebada. El gen es dirigido por el promotor de 35S del CaMV
Ensayos de maceración con distintas densidades de inóculo

La resistencia
fue clasificada
determinando
la superficie
macerada
sobre el total
de la superficie
de cada disco.
En a) se
muestra el
promedio de 5
experimentos;
en b) se
muestra el
promedio de 4
experimentos.
La edad de los
tubérculos fue
de 2-3 meses
Evaluación de resistencia mediante ensayos de maceración
en plantas de papa transformadas con lisozima del fago T4

Ensayos de maceración con Erwinia carotevora pv atroséptica a lo largo de 1-12 días.


Se presentan los resultados correspondientes a los controles, el mejor transformante
y el valor promedio de todos los transformantes
Plantas Ensayos de brotación de tubérculos en plantas
transgénicas de papa transformadas con lisozima del fago T4
de papa que
expresan el
gen de la
lisozima
Comparación de la brotación en plantas de papa control y transformadas con la lisozima del fago
T4 en condiciones de invernadero. Se plantaron trozos de tubérculo infectados con Erwinia
carotovora pv atroséptica. Izquierda: plantas transgénicas T424; derecha: plantas control Z2

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Tomado de: Düring et al. The Plant Journal, 1993.

Cuantificación de los resultados de un bioensayo de brotacion de tuberculos en invernadero


luego de la infección con Erwinia carotovora pv. atroséptica
Plantas de Solanum tuberosum transformadas
con genes de osmotina AP24, lisozima y dermaseptina

Plantas control Plantas transgénicas


Plantas de Solanum tuberosum transformadas
con genes de osmotina AP24, lisozima y dermaseptina

Ensayos de
infección con
Erwinia
carotovora
de plantas
transgénicas
(derecha) y
controles
(izquierda) de
Solanum
tuberosum
que expresan
combinaciones
de uno, dos y
tres genes
antimicrobianos
controles transgénicas controles transgénicas
Ensayos de maceración en tubérculos de plantas transgénicas

Ensayos de
maceración
en
tubérculos
de Solanum
tuberosum
inoculados
con Erwinia
carotovora
Las tioninas
son proteínas Desarrollo de plantas de tabaco
ricas en que expresan tioninas de trigo y de cebada
cisteína
tóxicas para
las bacterias

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Tomado de: Carmona et al., The Plant Journal, 1993.
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas
con Pseudomonas syringae pv tabaci
Lesiones causadas por las bacterias 6 días después
UP1 WT de la inoculación en plantas transformadas con la
tionina de cebada (UP1) y no transformadas (WT)

Datos de infección. El porcentaje de infección fue


medido 90 h después de la inoculación y representa
la proporción de puntos de inoculación que formaron
lesiones necróticos.

SNN: N. tabacum Sansum NN no


transformada
SNN+CS: plantas de N. tabacum Samsun NN
transformadas con un vector vacío
UP1 hz y UP2 hz: plantas homocigotas
transformadas con la tionina de cebada
UP6 pg y UP7 pg: progenies heterocigotas
de UP1 y UP2
UP3 hz y UP4 hz: plantas homocigotas
transformadas con la tionina de trigo.
Tomado de: Carmona et al., The Plant Journal. 1993.
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas
con Pseudomonas syringae pv tabaci

El desarrollo de la infección
se midió titulando el número
de bacterias. Los títulos en las
plantas UP1 a las 34 y 48 h
fueron significativamente
diferentes de los de las
(trigo) plantas UP3 y controles. Los
títulos en UP3 no son
significativamente diferentes
de los de los controles

(cebada)
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas
con Pseudomonas syringae pv tabaci

A: lesiones causadas por el patógeno en


plantas transgénicas (UP1) y control (WT)
a los 4 días de la infección
B: Datos de infección. Se midió el área
necrótica a los 4 días de la infección en el
Experimento 1 y a los 3 días de la
infección en el Experimento 2.
Modo de acción de la faseolotoxina

La OCTasa de
Pseudomonas es
insensible a su propia
toxina.
Se la expresó la secuencia
de la la OCTasa en plantas
para proteger de la acción
de la faseolotoxina.
A la secuencia de la
OCTasa se le agregó una
señal de transporte al
cloroplasto (en plantas, ruta
faseolotoxina
de síntesis cloroplastídica).
Ensayos con faseolotoxina
en plantas transgénicas SSU-OCTasa

Efecto de faseolotoxina en la actividad de ornitil carbamoil transferasa


(OCTasa) de plantas transgénicas SSU-OCTasa y plantas control.
Actividad OCTasa
Planta
Sin toxina Toxina (37 ng/ml) Toxina (375 ng/ml)
Control 2,50 ± 0,02 0,10 ± 0,02 N.D.
SSO-T1 5,50 ± 0,10 2,10 ± 0,15 2,10 ± 0,30
SSO-T13 14,20 ± 0,26 10,70 ± 0,14 10,30 ± 0,30
SSO-T16 22,90 ± 0,66 19,90 ± 0,15 19,80 ± 0,40
Control
6,0 ± 0,05 0,90 ± 0,03 N.D.
(cloroplastos)
SSO-T3
68,00 ± 6,10 59,80 ± 2,40 N.D.
(cloroplastos)
Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.

La actividad de OCTasa está expresada como mmoles de citrulina formados por


min/mg de proteína, con la excepción de extractos de cloroplastos, que fueron
reportados por mg de clorofila. Las actividades mostradas representan un
promedio de tres experimentos independientes. N.D. = no determinado.
Ensayos con
faseolotoxina
con plantas
transgénicas
SSU-OCTasa

Agrobiotecnología
Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.

Resistencia
a bacterias A: Clorosis típica inducida en hojas de Phaseolus tratadas con faseolotoxina.
fitopatógenas B y D: Plantas control independientes no transformadas tratadas con faseolotoxina.
C y E: Plantas transgénicas independientes tratadas con faseolotoxina. Todos los
tratamientos en las hojas fueron con 2 µl de una solucion de 3 µg/ml de toxina.
Las flechas señalan los sitios de inoculación de la toxina
Ensayos con Efecto de la inoculación con Pseudomonas syringae pv
Pseudomonas phaseolitica sobre las plantas transgénicas OCTasa
syringae en A B
plantas
transgénicas
SSU-OCTasa

C D

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.

A y C: Plantas control no transformadas a los 7 días de la inoculación con Pseudomonas


B y D: Plantas transgénicas SSU-OCTasa a los 7 días de la inoculación con Pseudomonas
Transformación
de arroz Resistencia a la infección
Plantas control con Xanthomonas oryzae
con el gen Plantas transgénicas pv. oryzae en cultivares
susceptibles
de resistencia transformados con
Xa21 el gen Xa21
A: cultivar Minghui 63-12
B: cultivar IR7 2-82
C: Síntomas en plantas
transgénicas (izquierda) y
control (derecha) en
ensayos de campo.

Plantas control
Plantas transgénicas
C

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Zhang et al., Nature Biotech. 2000.
Transformación de arroz con el gen de resistencia Xa21

Segregación de la expresión de Xa21 en la generación R1 de las líneas


transgénicas IR72-82, Minghui 63-12, Minghui 63-22 y BG90-2-27
Transformación Resistencia a la infección de
de arroz Xanthomonas oryzae pv. oryzae
en plantas transformadas con el
con el gen gen Xa26, aislado del cultivar
MH63
de resistencia
MH63: Minghui 63 (con moderada
Xa26 resistencia)
MDJ8: Mudanjiang 8 (susceptible)
RB22: MDJ8 transformado con
Xa26

Lesiones producidas por


Xanthomonas orizae pv. orizae
sobre hojas de plantas de arroz.

IR24: planta susceptibles


Rb17-18: Líneas transgenicas que
Agrobiotecnología expresan el gen Xa26.

Resistencia Controles de la PCR para Xa26:


a bacterias Positivos: MH63 y IRBB3, líneas
fitopatógenas
moderadamente resistentes y
resistentes, respectivamente.
Negativo: MDJ8, línea susceptible.
Tomado de: Sun et al., Plant Journal, 2004.
Transformación
de tabaco con
el gen de

Crecimiento bacteriano [log (cfu/cm2)]


resistencia
Pto de tomate

Planta transgénica
Planta control

Agrobiotecnología Tomado de: Thilmony et al. The Plant Cell. 1995.


Crecimiento de Pseudomonas syringae pv tabaci en plantas de tabaco transformadas
Resistencia con el gen de resistencia Pto (líneas sólidas) y en plantas control no transformadas
a bacterias (líneas discontínuas). Las plantas fueron inoculadas con bacterias que expresan el gen
fitopatógenas avr/Pto (cuadrados) o que no poseen el gen (triángulos). Los tipos de interacciones que
se indican son: [1]: incompatibilidad (presencia de gen R y gen avr; [2]: compatibilidad
(ausencia del gen R y presencia del gen avr; [3]: compatibilidad (presencia del gen R
y ausencia del gen avr); [4]: compatibilidad (ausencia del gen R y del gen avr)
Detección de H2O2 en plantas que expresan
el gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger

glucosa oxidasa
β-D-glucosa + O2
. ácido glucónico + H2O2

A: raíces de planta de papa


no transgénica (izquierda) y transgénica
(derecha)
B: discos de hoja de papa no transgénica
(arriba) y transgénica (abajo) puestos en
medio KI/almidón por 30 minutos
C: Idem que B, pero durante 5 horas
D: discos de tubérculos de papa de
plantas no transgénicas (arriba) y
transgénicas (abajo) puestos en medio
KI/almidón por 30 minutos
E: Idem que D, pero por 5 horas
Detección de H2O2 en plantas que expresan
el gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger

Incremento del nivel de H2O2


en hojas de papa
transgénicas que expresan
el gen de glucosa oxidasa de
Aspergillus niger.
Controles: Russet Burbak no
transformada y planta
transformada con el vector
vacío (17227-1).
Líneas transgénicas: 22587-3,
22587-12 y 22587-33
Ensayos de infección in vitro con Erwinia carotovora
de plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa

Inhibición del
crecimiento Erwinia
carotovora en discos
de tubérculos de
plantas transgénicas
Se midió el número de
bacterias entre 1 y 5 días
luego de la inoculación.
Los símbolos vacíos
corresponden a los
controles de plantas no
transformadas o
transformadas con el
vector vacío. Los símbolos
llenos corresponden a dos
líneas transgénicas que
expresan el gen de
glucosa oxidasa
Ensayos de infección in vitro con Erwinia carotovora
de plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa

A: discos de tubérculo de papa inoculados a 23-24oC bajo condiciones aeróbicas


B: discos de tubérculo de papa inoculados a 23-24oC bajo condiciones anaeróbicas
Los minituberculos de papa de plantas no transgénicas (RB) o de las líneas transformadas con
glucosa oxidasa 22587-3 (3) y 22587-34 (34) se inocularon con 2x105 cfu de Erwinia carotovora
por disco de tubérculo. Los síntomas se evaluaron a los tres días de la inoculación
Inhibición de la regulación
de factores de virulencia

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Un gran número
de bacterias Quorum sensing
Gram – se
• Mecanismo de comunicación comunitario presente en
comunican . diversas especies de bacterias. Fue detectado por
sintetizando, . primera vez en Vibrio fischeri
secretando y • Capacidad de los microorganismos de percibir y
respondiendo a . responder a la densidad poblacional a través de la
. producción de moléculas difusibles de reducido peso
compuestos . molecular
difusibles

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Moléculas señal: acil-homoserin lactonas (AHSLs)
El incremento de una población bacteriana determina una
elevada concentración de factores difusibles

Regulación génica dependiente de la densidad poblacional

Modificado de: Fuqua et al., Curr. Opin. in Microbiol. 1998.


El mecanismo Modelo simplificado de la transducción
de quorum de señales en quorum sensing
sensing es
mediado por
moléculas
difusibles
como las acil-
homoserin
lactonas

Proteína R
activada

Agrobiotecnología
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.

Resistencia Célula bacteriana: proteína I (azul), responsable de la síntesis de las señales


a bacterias difusibles de acil-homoserin lactona (A-HSL; óvalos verdes). La proteína R (rojo),
fitopatógenas sufre un cambio conformacional cuando se une a la señal A-HSL; actúa entonces
como regulador transcripcional, aumentando su afinidad por secuencias
promotoras específicas de los genes regulados por HSLs (“lux” box) .
Otros sistemas de regulación de virulencia en bacterias

El sistema rpf en Xanthomonas campestris

endoglucanasas ,
proteasas y polisacáridos

Gentileza de J. Maxwell Dow


rpf: Regulation of Pathogenicity Factors
Estructura de moleculas señalizadoras de quorum sensing
La interferencia
de la Posibles blancos y estrategias para interferir en la
comunicación entre bacterias (quorum quenching)
comunicación
entre bacterias HSL

es una posible sintetasa

estrategia
de resistencia
antimicrobiana

Agrobiotecnología

Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Mecanismos que afectan la regulación
mediada por homoserin lactonas

Enzimas degradadoras de A-
- HSLs

Organismo Molécula Función

Variovax paradoxus Actividad aminoacilasa Degrada A-HSLs

Bacillus sp. 240B1 A-HSLs lactonasa Degrada A-HSLs


Gen aiiA

Moléculas imitadoras de las A-HSLs

Delisea pulchra Furanonas halogenadas Se unen a receptores de A-HSLs


Inhiben quorum sensing

Plantas superiores Diferentes compuestos Afectan sistema de quorum


(arroz, arveja, etc) sensing

Organismos A-HSLs oportunistas

Salmonella enterica Homólogos de proteína Lux-R Reconocen las A-HSLs


(patógenohumano) No producen A-HSLs producidas por otros organismos
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol., 2002.
Transformación de plantas de papa con el gen
de acil homoserin lactonasa (aiiA) de Bacillus spp.

Cortes transversales de tubérculos de papa


inoculados con Erwinia carotovora.
A la izquierda: tubérculo de planta no transformada.
A la derecha: tubérculo de planta transformada con el
gen aiiA.

Inoculación de hojas con Erwinia carotovora SCG1.


Arriba: hojas de plantas de tabaco transformadas con el gen aiiA
Abajo: hojas de plantas de tabaco control no transformadas
Tomado de: Dong et al., Nature, 2001.
Las plantas que
A B Transformación
expresan transgénica control de plantas de
genes de tabaco con el
N-acil-homoserin gen de la N-acil-
lactona sintasas homoserin
lactona sintasa
exhiben mayor de E. carotovora
resistencia (gen expI)
a Erwinia
carotovora A: detalle de una hoja
de una planta
transgénica infectada
con Erwinia carotovora
B: hoja de una planta
control luego de la
infección

Porcentajes de
Agrobiotecnología infección observados
para dos líneas
Resistencia transgénicas (barras
a bacterias verde y anaranjada) y
fitopatógenas de una planta control,
no transgénica (barra
violeta).
Tomado de: Mae et al., MPMI, 2001.
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Referencias 1. Carmona, M.J., Molina, A., Fernández, J.A., López-Fando, J. J. and


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control phytopathogenic bacteria and fungi. Plant Physiology, 127:852-
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Agrobiotecnología 7. Tai, T.H., Dahlbeck, D., Clark, E.T., Gajiwala, P., Pasion, R., Whalen,
M.C., Stall, R.E. and Staskawicz, B.J. Expression of the Bs2 pepper
Resistencia
a bacterias
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