Vol.55, n. 1: pp.

145-149, janeiro-fevereiro de 2012

ISSN 1516-8913 Impresso no Brasil
ARQUIVOS BRASILEIROS DE
BIOLOGIA E TECNOLOGIA
ANINTERNATIONALJOURNA L
Biorremediação de Herbicida Velpar K
®
In Vitro em Aquoso
Solução com Aplicação de EM-4 (Efetivo
Microorganismos)
Márcio Antônio Gomes Ramos
*
e Sergio Akinobu Yoshioka
1 Instituto de Química de São Carlos; Universidade de São Paulo; Av Trab. São Carlense, 400; CP: 780; 13560-
970; São Carlos - SP - Brasil
ABSTRATO
Este trabalho avaliou a biorremediação do herbicida Velpar K ® , in vitro em
solução aquosa, utilizada contra plantas daninhas
cana-de-açúcar no estado de São Paulo. O herbicida continha Hexazinona e
Diuron. Foi utilizado o microbiano
inoculante denominado Microorganismos Efetivos (EM-4), pool de
microrganismos do solo que continha
e bactérias fotossintéticas, fungos, leveduras e actinomicetos para
biorremediação. Resultados para a profundidade do cultivo
em ágar-ágar inoculado com EM-4 mostrou o crescimento de
microrganismos nas concentrações entre 0,2% e
1,0% do Velpar K ® no gel. A análise de cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC) mostrou que o
O EM-4 foi efetivo para a biorremediação do herbicida, que atingiu os
valores de 80% para diuron e 70% para
hexazinona após 21 dias em solução de 2: 1 de relação Velpar K ® / EM-
4. Esses resultados podem ser úteis para planejar
biorremediação de áreas contaminadas com Velpar K ® .
Palavras-chave : Velpar K®, herbicida, biorremediação, microrganismos
eficazes
* Autor para correspondência: marcioagramos@hotmail.com
INTRODUÇÃO
Fertilizantes e pesticidas são usados com os principais
objetivo de aumentar a produtividade agrícola
produtividade, embora a maioria seja de substâncias
que causam problemas ambientais e de saúde pública
danos. O processo de degradação natural de tais
substâncias no meio ambiente e suas
eliminação é chamada de biorremediação. Este método
tem principalmente aplicações em
ambientes como água, solo, sedimentos de
os rios, lagos e oceanos. Durante o último
décadas, tem havido considerável
desenvolvimentos sobre o uso de microorganismos para
promover a biodegradação e a biorremediação
(Boopathy 2001).
O ambiente natural pode ser modificado ou
beneficiaram com objectivos diferentes, incluindo o
aplicação para biorremediação microbiana de
áreas impactadas (Silva et al. 1999). Com o
complexidade do ambiente onde o
contaminação ocorre, assim como a biorremediação,
que é dependente de interdisciplinar
abordagens (envolvendo as áreas de química,
microbiologia, bioquímica, engenharia, ecologia,
geologia e outros), a biorremediação
tecnologia pode ser aplicada como um tratamento in situ ou
ex situ de contaminação (Melo et al. 1999).
Vários estudos foram realizados para minimizar,
reduzir ou mesmo eliminar a presença de substâncias
materiais no meio ambiente, como o
biodegradação de organoclorados, carbamatos e
organofosfatos. O processo de biorremediação

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matéria orgânica é baseada na atividade metabólica
de aeróbica e anaeróbica heterotrófica
microorganismos, e é afetado por um grande número de
de fatores físicos e químicos, que incluem
fontes de energia (doadores de elétrons), elétron
receptores, nutrientes, pH, temperatura e
metabólico
inibidores
(Seabra
2008).
A biorremediação é uma estratégia ou processo que usa
microorganismos ou suas enzimas para desintoxicar o
contaminantes a níveis aceitáveis de poluentes em
o meio ambiente através da transformação do
contaminante em formas inofensivas (Tapajós, 2008).
Portanto, a biodegradação é baseada na
processos de degradação microbiana e química
processos combinados com engenharia, que é
capaz de maximizar a transformação de orgânicos
contaminantes do meio ambiente (Moreira et al.
2002). Entre as bactérias e fungos descritos como
decompositores eficientes, existem aqueles que pertencem
os gêneros:
Azospirillum, Pseudomonas,
Alcaligenes, Enterobacter, Proteus, Klebsiella,
Serratia. Bacillus, Arthrobacter, Nocardia,
Streptomyces, Mucor, Fusarium, Chaetomium,
e Phanerochaete Trametes .
Vários produtos químicos podem ser tratados biologicamente
com sucesso, como petróleo bruto, óleo derivado do petróleo
refino e craqueamento como gasolina, benzeno, xileno,
tolueno, etilbenzeno, óleo diesel, querosene, madeira
conservantes, solventes, vários esgotos urbanos
lodo ou industrial, e outros biogênicos ou
compostos xenobióticos. Entre os xenobióticos,
os inseticidas e herbicidas são substâncias de
uso generalizado na agricultura, e são classificados
de acordo com a estrutura química, mas o mais
método comum é aquele implementado
de acordo com a ação e espécies biológicas alcançadas.
No Brasil, grandes quantidades de herbicida Velpar K ® são
usado em culturas de cana-de-açúcar. Este herbicida é
seletiva no controle do pré e pós-
germinação de ervas daninhas que possuem folhas largas. o
produto opera na inibição da fotossíntese,
e é comercializado sob a forma de grânulos
que são solúveis em água. Seus ingredientes ativos
pertencem aos grupos de ureia substituída e
triazinonas, cujos nomes IUPAC são: 3 - (3,4 -
(diclorofenil) -1,1-dimetilureia ou diuron,
contendo
53,3%
e
3-ciclohexil-
6 (dimetilamina) -1-metil-1,3,5, triazina-2, 4
(1H, 3H) diona ou hexazinona, contendo 6,7%
e os restantes 40% de ingredientes inertes (DU
PONT BRASIL 1989). Por causa do alto
solubilização, o diuron e a hexazinona presentes
grandes riscos, pois são facilmente lixiviados e oferecem
maiores riscos de contaminação das águas subterrâneas
(Gomes et al. 2001). Por esta razão, existe
interesse em monitorar a contaminação em
águas subterrâneas por estes herbicidas. Hexazinona
presente neste herbicida deve ser removido após
desempenhando seu papel quando presente em excesso. Isto é
feito frequentemente através da rota microbiana, que
depende do equilíbrio dinâmico da microbiota
população. Isso pode ser alterado pelas mudanças
condições ambientais, como os pesticidas
adição ou outras substâncias biologicamente activas
(Silva 1996).
Existem vários estudos sobre o uso de
actinomicetos, fungos, bactérias e leveduras em
indivíduo ou consórcio para a biorremediação de
pesticidas no solo com a finalidade de reduzir ou
eliminando seus produtos perigosos (Gaylarde
2005). O uso de EM-4 promoveu a prática de
agricultura natural (Okuda et al. 1999). A mira de
este trabalho foi avaliar a biorremediação de
Velpar K em solução aquosa usando EM-4, e para
analisar por HPLC seus princípios ativos sem
biodegradação.
MATERIAL E MÉTODOS
Inoculante EM-4 é uma cultura mista de muitas espécies
de bactérias e fermentos, cujo desenvolvimento é
realizada de preferência em melaço a partir de diluído
cana de açúcar. Os padrões diuron e hexazinone
foram comprados da Aldrich. Velpar K ® (Du Pont
1989) foi obtido de uma empresa agrícola local
loja.
Crescimento de EM-4 em Velpar K ® como o único
fonte de carbono
Uma amostra de 1,0mL do EM-4 (5x10 2 células / mL),
previamente ativado com melaço foi banhado
utilizando a técnica de inoculação por profundidade
placa) em triplicado. Então 15-20 mL de ágar sólido
Velpar-K ® foram colocados em placas de Petri estéreis,
previamente fundido a 45 ° C, contendo 2% de agar
(Merck ®) e concentrações variáveis de Velpar K ®
(0,0, 0,2, 0,8 e 1,0%, v / v) e arrefecido. O Petri
as placas foram mantidas a 30 ± 1 o C durante sete dias
a fim de verificar o crescimento de microorganismos
contando as unidades formadoras de colônia (CFU) com um
contador de colônias (Phoenix - modelo EC 589).
Quantificação por HPLC de Velpar K ®
Para isso, o cromatógrafo Shimadzu C-R4A,
acoplado a bomba LC 9A e detector UV (SPD - 6

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HS) a 254 nm, controlador SCC-6B, com coluna
HP - C de 18 a 20 cm de comprimento e diâmetro interno
de 4,6 mm e um tamanho de partícula de 10 µm.
A taxa de fluxo foi de 1mL / min, usando 55% (v / v)
acetonitrilo diluído em água Milli-Q como móvel
Estágio.
Curva padrão de hexazinona e diuron
Uma curva padrão foi construída usando 20 μL do
soluções de padrões de hexazinona e diuron a 0,5,
Concentrações de 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0 mg / mL
usando HPLC.
Quantificação de biorremediação
A biorremediação in vitro em solução aquosa
foi realizada em frascos Erlenmeyer de 500 mL
contendo 200 mL de solução, na qual o EM-4
(500 células / mL) foi adicionado na solução de Velpar
K ® (6,25g / L) como o protocolo da Tabela 1 sob
agitação de 100 rpm. Durante 21 dias, amostras de
10 mL foram tomados como mostrado na Tabela 1, que
foram analisados por HPLC após diluição entre 25
e 100 vezes com ua Milli-Q.
Tabela 1 - Proporções e fator de diluição das soluções aquosas de K
Velpar ® (6,25g / L): EM-4 (1: 1000), para
quantificação por HPLC da biorremediação dos compostos diuron e
hexazinone. (Volume total = 200mL).
Ratio
UMA
B
C
D
E
Velpar K ® / EM-4
1/0
1/1
2/1
9/1
0/1
Fator de diluição
1,0
2,0
1,5
1,1
1,0
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Biodegradação de Velpar K ® por EM-4
A contagem da unidade formadora de colônia por mililitro
(CFU / mL) nas placas A, B, C e D após o 5º
dia de cultivo mostrou aumento significativo
o número de células presentes para todas as concentrações
usado com Velpar K ® , comparado ao controle
(agar: EM-4) da placa (a). Isso indicou que
Velpar K ® foi usado como a única fonte de energia
e carbono pelos microorganismos EM-4, como
mostrado na Tabela 2.
Curva de padronização da HPLC de diuron
e hexazinona.
A curva de calibração foi feita analisando 20 μL de
soluções dos padrões de diuron e
hexazinona a 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0 mg / mL
concentrações (HPLC). Os resultados são mostrados em
Tabela 3.
Tabela 2 - Quantificação das unidades formadoras de colônia por mililitro
(UFC / mL) do crescimento EM-4 com ou sem
Presença de Velpar K ® .
Amostra
CFU / mL
Ágar: EM-4
2,3 x 10
3  0,4 x 10
3
Ágar: EM-4: Velpar ®
1,4 x 10
5  0,2 x 10
5
Tabela 3 - Áreas dos cromatogramas de diuron e hexazinona, que indicaram a
curva de concentração do
padrões por HPLC.
Concentração (mg / l)
Unidade de Área (cm 2 )
Diuron
Hexazinona
0,5
46235
24791
1,0
87684
46663
1,5
132988
70571
2,0
185304
99040
2,5
219082
117082
3,0
267390
142817

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O método de regressão linear foi aplicado para
a equação dos padrões de calibração retos de
diuron e hexazinona, indicando uma correlação
entre as concentrações injetadas, como mostrado na
Figura 1. Os valores do fator de linear
regressão (R-diuron = 0.99903 e R-hexazinona
= 0,99895) permitiu quantificar o diuron e
hexazinona na solução aquosa de Velpar K ® .
As figuras 2 e 3 mostram a dinâmica da biorremediação
com EM-4 (500 células / mL) do ativo Velpar K ®
princípios durante 21 dias. A biorremediação para
a relação da solução Velpar K ® : EM-4 de 2: 1
nos primeiros três dias alcançou 42% para o diuron e
29% para hexazinona.
Figura 1 - Curva de calibração por HPLC das soluções padrão de diuron e
hexazinone.
Figura 2 - Biorremediação de diuron por EM-4 durante 21 dias a 25 o C.
Figura 3 - Biorremediação da hexazinona por EM-4 durante 21 dias a 25 o C.

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As Figuras 2 e 3 mostraram que o diuron e
hexazinona poderia ser biorremediada, e que o
proporção do EM-4 teve influência sobre o
cinética da biorremediação. A aplicação de EM
4 em água contaminada com diuron e
hexazinona, destacou a possibilidade de que o
cultura mista de EM-4, foi capaz de degradar diuron
e hexazinona.
Dellamatrice et al (2001), estudando a degradação
de 14 C-diuron, mostrou que o Actinobacter
baumannii , D12 e 12 e outros solos
microorganismos degradaram o diuron. o
degradação foi mais eficiente quando o organismo
tinha presença histórica do herbicida para alcançar
estas condições chegam a 27% da mineralização, com
cerca de 2x10 6 CFU / g solo. Os autores descobriram que
solos com histórico de aplicação, a vida média
diuron foi de 72 dias, enquanto nos solos sem
história de aplicação foi de 444 dias. Considerando
os resultados nas Figuras 4 e 5, pode ser
concluiu que o EM-4 apoiava a degradação de
herbicida, atingindo os valores de 80% para
diuron 70% para hexazinona após 21 dias. Estes
resultados podem ser úteis para o planejamento
biorremediação de áreas contaminadas, ou quando
aplicar este herbicida nas culturas.
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que
foi possível usar o EM-4 para o
biorremediação de áreas contaminadas (água ou
solo), usando o herbicida Velpar K ® para cana-de-açúcar
cultura.
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