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1. INTRODUÇÃO

Enzimas são proteínas com a capacidade de catalisar reações biológicas, elas


diferem dos demais catalisadores químicos por conta de algumas características:

o Maiores taxas de reação: As taxas de reação quando na presença de uma


enzima geralmente são da ordem de 106 – 1012 maiores que as taxas de uma
reação não catalisada, e suas taxas também são maiores quando
comparadas a reação que utilizam catalizadores químicos convencionais.
o Condições mais brandas: Algumas reações, que em condições
convencionais necessitariam de altas temperaturas e pressões, na presença
de uma enzima, acontecem a pressão e temperatura ambientes.
o Grande especificidade: Enzimas são muito especificas para um determinado
tipo de substrato, e trabalham no esquema “chave-fechadura”, devendo a
isso sua alta especificidade. Por conta disso, dificilmente uma reação
catalisada por enzimas terá subprodutos.
o Capacidade regulatória: A capacidade catalítica de algumas enzimas varia
em resposta a variação da concentração de outros compostos envolvidos no
processo além de seu substrato específico1.

As enzimas responsáveis pelos processos biológicos estão compartimentalizadas


em diferentes organelas, que podem ser isoladas para estudo direto, como
identificação e caracterização. No presente trabalho realizar-se-á a caracterização
da succinato desidrogenase, que se encontra intimamente ligada à membrana
interna da mitocôndria, e catalisa a oxidação do succinato a fumarato no ciclo de
Krebs. Trata-se da única enzima do ciclo que não está dispensa na matriz
mitocondrial. Ela contém um FAD, que atuará como aceptor de elétrons nessa
etapa. Estando permanentemente ligado à enzima, este grupo prostético não pode
funcionar como metabólito como acontece com o NADH, sendo assim, a succinato
desidrogenase é reoxidada pela cadeia transportadora de elétrons. A figura 1
mostra o acima descrito1.

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Figura 1: Succinato desidrogenase catalisa estereoespecificamente a desidrogenação do
succinato a fumarato.

Essa enzima é fortemente inibida pelo malonato, um análogo estrutural do succinato


que acaba atuando como um excelente inibidor competitivo, que se configura como
uma estrutura que compete diretamente com o substrato pelo sítio ativo da enzima.
Geralmente são similares ao substrato na região que se liga à enzima, mas o
restante de sua estrutura é diferente, então a reação não ocorre. A inibição causada
pelo malona na succinato desidrogenase acontece porque embora sua estrutura
seja similar, ele não pode ser desidrogenado. A figura 2 mostra as reações
genéricas para o processo de inibição1.

Figura 2: Reações genéricas para o processo de inibição.

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O estudo da a atividade da succinato desidrogenase, num sistema in vitro, pode ser
realizado pela oxidação do succinato a fumarato, seguido da transferência dos
elétrons para o aceptor artificial de elétrons, 2,3,5-trifeniltetrazólio, que apresenta
coloração amarela na forma oxidada, em solução aquosa, e vermelho na sua forma
reduzida (trifenil-formazan), ou seja, após receber os elétrons2. A alteração
molecular que ocorre no aceptor de elétrons é mostrada na figura 3.

Figura 3: Alterações moleculares que ocorrem no aceptor de elétrons.

2. OBJETIVOS

Os objetivos desta pratica envolvem a demonstração da técnica de isolamento de


mitocôndrias, o esclarecimento de conhecimentos a cerca da atividade enzimática,
a caracterização da presença da succinato desidrogenase no extrato de mitocôndria
e a demonstração da inibição enzimática competitiva.

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. Materiais e reagentes

- Meio de extração: sacarose 0,32 M em tampão fosfato 0,02 M pH 7,3 contendo


EDTA 0,01 M;

- Cloreto de 2,3,5- trifenil- tetrazólio a 0,56 g% pH 7,3;

- Succinato de sódio 0,5 M pH 7,3;

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- Suspensão de mitocôndrias (contendo a desidrogenase succínica) com
concentração de proteínas entre 40 e 50 mg/mL;

- Tampão fosfato 0,02 M pH 7,3.

3.2. Procedimento experimental

3.2.1. Preparação de proteínas.

Lavou-se o fígado fresco de boi com meio de extração gelado, para remover o
sangue. Cortou-o em pedaços pequenos com o auxílio de um estilete. Pesou-se 50
g de fígado picado em um béquer e transferiu-se para um almofariz, macerando
vigorosamente com pistilo. Durante o processo de maceração adicionou-se cerca
de 50 mL de meio de extração gelado aos poucos para realizar a extração da
enzima. Em seguida, filtrou-se a mistura em funil com gaze, a fim de reter as
partículas maiores do fígado. Recolheu-se o filtrado em um erlenmeyer de 125 mL,
previamente mantido no banho de gelo. A porção líquida (homogeneizado), foi
transferida para tubos plásticos de centrífuga, também acondicionados a baixa
temperatura. Equilibraram-se os tubos da centrífuga contendo o material, com
auxílio de balança adequada e em seguida centrifugou-se o material durante 10
minutos a 2000 rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um
béquer (conservado em banho de gelo), desprezando o material sedimentado. Tal
sobrenadante foi redistribuído em tubos de centrífuga, mantendo-os em banho de
gelo durante 5 minutos. Posteriormente, após conferencia dos pesos na balança,
centrifugou-se o material durante 15 minutos a 6000 rpm. Após a segunda
centrifugação, desprezou-se o sobrenadante. O material sedimentado nos tubos foi
solubilizado em um volume total de 3 mL com meio de extração gelado, obtendo-se
assim uma suspensão de mitocôndrias que foi utilizada como fonte de enzima (a
suspensão mitocondrial deve ser feita de modo a assegurar uma concentração de
40 a 50 mg de proteína/mL). Pipetou-se 1 mL da suspensão em um tubo de ensaio
e que foi levado ao banho-maria fervente, durante cerca de 5 minutos. A figura 4
mostra o fluxograma do procedimento descrito.

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Figura 4: Fluxograma do preparo das mitocôndrias.

3.2.2. Quantificação da proteína na enzima mitocondrial.

Prepararam-se seis soluções a partir dos reagentes indicados, com diferentes


concentrações, como apresentado na tabela 1.

Tabela 1: Concentrações dos reativos para a quantificação da enzima mitocondrial.

Os tubos foram agitados e deixados em repouso durante 10 minutos. Em seguida,


realizou-se a leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda igual a 540

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nm, usando o tubo nº 1 para zerar o aparelho. Após a leitura da absorbância,
calculou-se a concentração de proteínas na suspensão mitocondrial, que deveria
estar entre 40 e 50 mg/mL. A figura 5 mostra o fluxograma do procedimento descrito.

Figura 5: Fluxograma da quantificação da proteína na enzima mitocondrial.

3.2.3. Determinação da atividade da desidrogenase succínica.

Preparam-se seis soluções com os reagentes descritos em diferentes


concentrações como apresentado na tabela 2.

Tabela 2: Determinação da atividade da desidrogenase succínica.

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Os tubos foram suavemente agitados e colocados em banho-maria a 37 ºC.
Posteriormente, foi possível visualizar a mudança de cor entre 10 - 30 minutos de
incubação. Os resultados foram interpretados em função dos componentes de cada
um dos tubos incubados. A figura 6 mostra o fluxograma do procedimento descrito.
Figura 6: Fluxograma da determinação da atividade da enzima desidrogenase succínica.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1. Preparação das mitocôndrias.

O fígado é a maior víscera do corpo humano, e é essencial na regulação do


metabolismo dos carboidratos, proteínas e lipídios, no armazenamento de
substâncias e na degradação e excreção de hormônios. Outras funções incluem a
transformação e excreção de drogas, a hemostasia e o auxílio à resposta imune3.

O fígado e o músculo esquelético constituem os principais locais de estoque de


glicogênio. Quando a glicemia está elevada, o fígado sintetiza glicogênio. Quando
a glicemia cai, o fígado utiliza o glicogênio armazenado para sintetizar glicose
(glicogenólise), atuando para manter os níveis glicêmicos relativamente constante.
O fígado também é o órgão mais importante para a gliconeogênese (produção de

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glicose pela conversão de aminoácidos, lipídios ou carboidratos simples). Todos
esses processos são regulados por diversos hormônio. O fígado possui uma grande
quantidade de mitocôndrias devido as funções que desempenha, sendo muito
adequado para a extração e caracterização da succinato desidrogenase, além de
ser facilmente obtido e não ser de alto custo3.

Em células eucarióticas, as enzimas que catalisam diferentes vias metabólicas


estão compartimentalizadas em organelas distintas4. Com o objetivo de extrair a
enzima succinato desidrogenase realizou-se o processo de maceração descrito nos
procedimentos. Tal processo é necessário pois a enzima de interesse encontra-se
dentro da mitocôndria, especificamente integrada a membrana interna desta
organela, sendo assim foi necessário causar a quebra dos envoltórios presentes
tanto na célula quando na organela em si, além da estrutura macroscópica do órgão.
O resultado da caracterização em si depende muito desta primeira etapa, uma vez
que quanto melhor for realizado o particionamento do material mais enzimas ficarão
disponíveis para estudo. A filtração realizada intentou retirar as partículas maiores
que restaram após a maceração, e as subsequentes centrifugações seguiram
também este princípio, sendo que na primeira desprezou-se o material
sedimentado, pois continha os restos de células íntegras, hemácias, núcleos e uma
pequena parte de mitocôndrias. Na segunda, o precipitado obtido continha as
mitocôndrias de interesse, que foram novamente suspendidas no meio de extração
para serem utilizadas nas etapas seguintes do estudo5. Vale ressaltar que todo o
de extração e subsequente manuseio do extrato de mitocôndria contendo as
enzimas foi realizado a baixa temperatura, com o auxílio de cubas de gelo, isso foi
necessário tendo em vista que a temperatura influencia na atividade enzimática, e
intentava-se evitar a desnaturação pelo calor e/ou a perda da atividade da enzima
à medida que a temperatura é elevada. A maioria das enzimas perde a sua atividade
com temperaturas a partir de 55° C 6.

Uma vez finalizada a extração e preparação da suspensão de mitocôndrias realizou-


se um ensaio para determinar a quantidade de enzimas presentes. Para tal obteve-
se uma curva de calibração em espectrofotômetro por meio do método do Biureto,

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que é utilizado para a caracterização de proteínas, e pode ser empregado para a
quantificação das mesmas mediante a colorimetria. O método se baseia no fato de
que as proteínas formam um complexo violeta com o íon cúprico (Cu 2+) em meio
alcalino, e tal complexo apresenta um pico de absorção em 540 nm. A coloração
violeta apresentada pelo complexo é proporcional à concentração das proteínas na
amostra. Essa reação é positiva para peptídeos constituídos de no mínimo três
aminoácidos; assim, a Reação do Biureto será negativa para dipeptídeos e
aminoácidos livres7.

Para realizar a calibração utilizaram-se três tubos de ensaio contendo o padrão da


proteína estudada, um tubo branco para calibração e dois tubos com a suspensão
de mitocôndrias, um a mais do que o previsto no procedimento devido a
recomendações recebidas durante a prática, ente tubo extra recebeu 0,1 mL a mais
de água e consequentemente 0,1 mL a menos da suspensão em relação as
quantidades apresentadas na tabela para a quantificação. Os valores de
absorbância foram medidos e para o padrão obteve-se uma média de 0,152, com
concentração de 5 mg/mL. A partir destes valores e das absorbâncias medidas para
as amostras da suspensão de mitocôndrias chegou-se a um valor de concentração
igual a 100 mg/mL nos dois casos, ou seja, tanto nas condições propostas no
procedimento quanto nas condições de correção apresentadas pela professora.
Isso indica que o procedimento experimental foi realizado de maneira adequada.

Por conta de o valor obtido para a concentração ter sido maior que 50 mg/mL, para
o prosseguimento do experimento ao invés de se utilizar 0,3 mL nos tubos de
ensaio, este valor foi reduzido para 0,2 mL e os volumes de tampão adicionados
foram modificados de maneira recíproca. Uma vez finalizada a montagem dos tubos
de ensaio eles foram incubados a 37 °C até alteração de cor, e na figura 7 há uma
imagem dos resultados obtidos.

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Figura 7: Colorações obtidas após incubação.

Da esquerda para direita tem-se: o branco, o branco da proteína, a reação completa,


o teste com proteínas degradas, e nos dois últimos, os testes de competição. Os
brancos são realizados para vias de comparação com as demais reações
realizadas, no caso do branco de proteína, ele foi realizado para que fosse possível
visualizar a coloração do extrato, a fim de evitar confusões na identificação dos
resultados negativo e positivo. As proteínas não possuem cor, entretanto, por tratar-
se de um extrato de tecido animal existem muitos compostos residuais, que são
responsáveis pela cor observada no segundo tubo.

No terceiro tubo observa-se claramente um resultado positivo do teste realizado, a


coloração observada deve-se a redução do aceptor artificial de elétrons, mostrando
que a enzima de interesse, succinato desidrogenase, estava adequadamente
presente no extrato, uma vez que ele podia conter também outras proteínas
residuais. No quarto tubo não houve coloração, uma vez que ele continha a alíquota
de extrato que foi tratada com calor, gerando a desnaturação e até degradação das
enzimas presentes, por conta disso não era sequer possível que ocorre alteração
neste tubo.

Os dois últimos tubos demonstram a atividade do malonato como inibidor


competitivo do succinato pelo sítio ativo da enzima, já que no quinto tubo, onde o
malonato estava em maior quantidade, o resultado foi negativo, já que a reação não
ocorre na presença deste composto. De maneira análoga, no ultimo tubo, onde o
succinato estava em maior quantidade, é possível observar um resultado positivo,

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uma vez que a reação ocorreu adequadamente com o substrato que estava
disponível na solução.

5. CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos é possível concluir que a prática foi muito bem-
sucedida, uma vez que se realizou a quantificação da enzima adequadamente,
obtendo um valor adequando e bem definido, igual a 100 mg/mL no extrato de
mitocôndria. Além disso, a caracterização também resultou em dados coerentes e
de acordo com o esperado baseando-se na literatura, o efeito de inibidor competitivo
também foi claramente observado.

REFERÊNCIAS.

1 VOET, D.; VOET, J. G. Biochemistry. John Wiley & Sons, USA, 1990.
2 PAZIAN, N. D. O.; TELEGINSKI, F. Adaptação De Uma Metodologia De Caracterização Da
Atividade Da Succinato Desidrogenase De Origem Vegetal: Uma Aula Prática De Bioquímica.
12.° CONEX. 2014.
3 SCHINONI, M. I.; Fisiologia Hepática. Faculdade de Medicina da Bahia da UFBA; Salvador, BA,

Brasil.
4
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 5ª. Edição, Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1991.
5
CAMPBELL, M. K.; FARRELL, S. O. Bioquimica. 5ª. Edição, São Paulo: Cengage Learning, 2016.
6
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica, 4ª. Edição, Editora
Sarvier, 2006.
7 MOURA, D. S. de; CARRER, H.; GALLO, L. A.; BASSO, L. C. Bioquímica – LCB 208 - Roteiro

De Aulas Práticas. USP – Escola superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”. Piracicaba, 2014.

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