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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA

INGENERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

INFORME FINAL DEL PROYECTO INTEGRADOR

NIVEL: IV

“Extracción de bromelina de la piña (Ananas comosus) en comparación con la papaína


y la ficina obtenidas de la papaya y el higo respectivamente.”

Silvana Romo

Karina Cabascango

PORTADA
Sangolquí, Enero 2018

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RESUMEN

Durante esta investigación, poniendo en práctica ciertas variables de medición de la


actividad enzimática se compararon tres clases de enzimas: bromelina, papaína y ficina,
tanto de la piña, papaya e higo respectivamente. Este proceso de comparación se lo
llevó a cabo mediante la hidrólisis de la gelatina en condiciones ambientales normales
(temperatura y presión), tomando como variables el tiempo de hidrólisis y la variación
de la acción de la fruta inmadura con respecto a la fruta madura; así como también
como factor principal la observación de cuál de las enzimas actúa de manera más
favorable. En base a conocimientos bibliográficos y experimentaciones desarrolladas
resultó ser la bromelina, el enzima con mayor eficacia en cuanto a desnaturalización,
hidrólisis y por tanto acción como ablandador de carne en tanto a procesos
biotecnológicos se hace referencia.

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ÍNDICE

Contenido
PORTADA ...................................................................................................................................... 1
RESUMEN ...................................................................................................................................... 2
ÍNDICE ........................................................................................................................................... 3
1. Tema...................................................................................................................................... 4
2. Justificación........................................................................................................................... 4
3. OBJETIVOS............................................................................................................................. 4
Hipótesis ....................................................................................................................................... 5
CAPÍTULO I .................................................................................................................................... 5
4. Fundamento Teórico.......................................................................................................... 5
4.1. Generalidades ............................................................................................................ 5
4.2. Composición química ................................................................................................ 6
4.3. Enzimas ..................................................................................................................... 8
4.3.1. Tipos de enzimas ................................................................................................... 8
4.4. Factores ................................................................................................................... 10
4.5. Aplicaciones ............................................................................................................ 10
5. Materiales y métodos ...................................................................................................... 13
5.1. Materiales ................................................................................................................ 13
5.2. Métodos ................................................................................................................... 13
CAPÍTULO III ................................................................................................................................ 16
6. Resultados ....................................................................................................................... 16
6.2. Discusión ................................................................................................................. 21
CAPÍTULO IV ................................................................................................................................ 26
7. Conclusiones ................................................................................................................... 26
8. Recomendaciones ............................................................................................................ 26
9. Bibliografía ..................................................................................................................... 27
10. ANEXOS ........................................................................................................................... 30
ANEXO A ............................................................................................................................... 30

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1. Tema: Comparación de la actividad enzimática de enzimas bromelina, papaína y
ficina mediante pruebas de hidrólisis para la elaboración de un ablandador de carne.
2. Justificación:

Este proyecto se enfoca en las enzimas que son de gran interés en varios campos de la
industria como la alimentaria. Las enzimas son el centro de estudio para la bioquímica
de alimentos y la biotecnología, pues es usada en procesos enzimáticos de elaboración y
conservación de alimentos (Schmidt, 2001).

El Ecuador posee una gran variedad de frutas gracias a la posición geográfica en la que
se encuentra ubicado y a la existencia de microclimas (PRO Ecuador, 2015). Se pone
como objeto de estudio estas enzimas, debido a que no existen estudios que analicen y
comparen estas enzimas, además solo hay información de ablandadores de carne
elaborados con bromelina.

De acuerdo a la investigación que se lleva a cabo se debe optar por desarrollar un


protocolo con un eficiente procedimiento de extracción de las enzimas mencionadas, lo
mismo que facilita incluso la comercialización del producto elaborado.

La presente investigación tiene suma importancia en el campo de las enzimas y sus


aplicaciones. El trabajo es un aporte para nosotros como estudiantes ya que permite el
crecimiento tanto de conocimientos como de experiencia en la formación como
profesionales en la Carrera de Ingeniería en Biotecnología.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo general

Extracción y comparación entre la enzima bromelina, ficina y papaína para medir su


actividad proteolítica y aplicarlas en distintos procesos biotecnológicos.

3.2. Objetivos específicos:


 Determinar un método para la extracción de la enzima y el análisis de actividad
enzimática.
 Comparar la actividad enzimática en frutos maduros e inmaduros.
 Analizar el factor temperatura en la actividad enzimática.

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Hipótesis:

La actividad enzimática de las enzimas del tipo proteasas es óptima en cuanto a la que
se extrae de la piña comparada con otras frutas como la papaya y el higo, enzimas
papaína y ficina, respectivamente.

CAPÍTULO I

4. Fundamento Teórico

4.1. Generalidades
Papaya

La papaya es una fruta dulce propia


del clima tropical de algunas zonas
del Ecuador, la producción de
papaya se concentra actualmente en
las provincias de Los Ríos, Santo
Domingo y Santa Elena; la fruta es
cultivada y producida durante todo
Figura 1. Papaya, fruta tropical
el año. Hay algunas variedades de
esta fruta como: hawaiana. Se utiliza principalmente para elaboración de jugos, puré,
compotas y postres (PRO Ecuador, 2015).

Es una planta dicotiledónea, perenne de consistencia herbácea y hojas grandes. Como se


puede verificar en la figura 1, los frutos son jugosos de cáscara lisa y el tamaño varía
según la variedad y tipo de planta (Jiménez, 2002). El fruto de la papaya es una baya
que puede ser cilíndrico, alargado, en forma de pera o puede ser cilíndrico, alargado, en
forma de pera o de forma globular oval o redondo. La pulpa es rica en agua, azúcares,
vitaminas, minerales y sustancias colorantes. Su color varía de amarillo pálido a
amarillo rojizo. (García, 2010)

Piña

Es una planta herbácea monocotiledónea que pertenece a la familia Bromeliácea, tiene


un desarrollo óptimo en suelos ácidos. El Ecuador posee condiciones agroclimáticas
para su producción (Basantes, 2012). La piña (Ananas comosus) tiene hojas moradas,
rígidas y espinosas; su fruto es grande, carnoso y de sabor muy apreciado. Las flores
dan fruto sin necesidad de fecundación, es decir, tienen reproducción asexual (Avelino,
5
2009). El tallo es carnoso y se encarga de almacenar
los nutrientes que son desarrollados por las hojas. La
inflorescencia contiene aproximadamente 200 flores
dispuestas en forma espiral fusionadas entre sí y con
el tallo central, dando origen a un fruto
partenocárpico del cual la cáscara está formada por
los sépalos y brácteas de la flor. El fruto es no
climatérico en forma de cilindro, una de las
Figura 2. Piña, generalidades
características que se puede apreciar en la figura 2.
(Rivera, 2011)

Higo

Frutal perenne no nativa con adaptación en


la zona andina ecuatoriana, es una plata
dicotiledónea que alcanza hasta los 20
metros en suelos y climas apropiados. El
fruto es un sicono blando, carnoso,
mucílago con numerosos aquenios en su
interior, según lo manifestado en la figura 3.
Los frutos tiernos son verdes mientras que
Figura 3. Aquenios en el interior del fruto de la
los maduros pueden ser negros o morados higuera
(Nieto, 2007).

4.2. Composición química

Papaya

Formada por agua (90%), proteína, grasa, carbohidratos, fibra y vitaminas. En cuanto al
contenido vitamínico se tiene caroteno (vitamina A), vitamina C, vitamina B1 y B2.
(Jiménez, 2002)

Piña

Fruta rica en azúcares, vitaminas del grupo A,B,C y E, sales minerales, calcio, fósforo,
hierro, ácidos orgánicos, ácido málico, cítrico y ascórbico, sacarosa, glucosa, levulosa y
su ingrediente activo, la Bromelina (Rivera, 2011).

6
Su alto contenido en tiamina y vitamina C favorece el desarrollo y buen funcionamiento
de los músculos y sistema nervioso; tiene cantidades mínimas de magnesio y potasio
(Avelino, 2009).

Higo

El higo por su parte no es un fruto con alto contenido proteico, sin embargo después del
agua los componentes mayoritarios son los hidratos de carbono (glucosa, fructosa y
sacarosa), por lo mismo que es recomendable para deportistas. A su vez presenta todos
los aminoácidos esenciales, posee mucha fibra favoreciendo al tránsito intestinal; a
pesar de no ser una fruta rica en minerales contiene potasio y cierta cantidad de calcio,
fósforo y magnesio. En cuanto a vitaminas presentes en el higo se puede mencionar
provitamina A, vitaminas C, B1, B6 y niacina; cada uno de los elementos mencionados
se ven expresados con sus correspondientes cantidades en la tabla 1. Los higos no se
pueden consumir si no han madurado puesto que los verdes presentan látex que puede
irritar a la piel (MOREIRAS, 2013).

Tabla 1. Composición nutricional del higo

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4.3. Enzimas

Según (GILVERY & R., 1977), una enzima es una proteína que se combina con uno o
más compuestos de forma que reaccionan a mucha mayor velocidad que lo harían sin el
enzima. Tienen estructura primaria y se pliegan de modo que sus grupos reactivos se
disponen para dar al conjunto actividad biológica, los procesos biológicos que se llevan
a cabo mediante las enzimas son: degradación de nutrientes, transformaciones
energéticas, síntesis de moléculas orgánicas, regulación de procesos metabólicos, etc.

Las enzimas permiten las reacciones en las condiciones de temperatura, presión y pH


propios del medio intracelular, reduciendo la energía de activación necesaria para que se
produzca la reacción. Las enzimas no experimentan cambios estructurales al final del
proceso químico que catalizan (BIOLOGÍA SUR, 2013).

4.3.1. Tipos de enzimas

Según (GUERRA, 2012), los enzimas se agrupan y nombran de acuerdo al tipo de


reacción catalizada, su terminación es –asa. Según lo mencionado se presentan seis
clases de enzimas ilustradas de manera creativa en la figura 4:

Oxidorreductasas: Son aquellas que intervienen en las reacciones de oxidación-


reducción con pérdida y ganancia de electrones (Deshidrogenasas y oxidasas).

Transferasas: se encargan de la transferencia de grupos funcionales entre moléculas


(Transaminasas, transcarboxilasas, transmetilasas).

Hidrolasas: son aquellas que se encargan de la hidrólisis (Carbohidrasas, esterasas,


peptidasas, nucleasas).

Liasas: Son aquellas que se encargan de la adición de moléculas sencillas a dobles


enlaces (Aminasas, carboxilasas, hidratasas).

Isomerasas: Realizan la transformación de un isómero en otro.

Ligasas o sintasas: Se encargan de la unión de moléculas o de un grupo funcional a una


molécula, utilizando la energía proporcionada por el ATP.

8
Figura 4. Clases de enzimas (BIOLOGÍA SUR, 2013).

La papaína es una proteasa sulfhídrica (thiol proteasa) que tiene la capacidad de


hidrolizar los enlaces peptídicos donde los residuos de aminoácidos aromáticos del
grupo carbonil son arginina, lisina o glutamina. Es análoga en funciones a la pepsina
(enzima que se encuentra en el estómago humano y descompone las proteínas).

Se ha convertido en una proteasa de origen vegetal de mayor uso en la industria. Se la


utiliza a nivel de industrias de alimentos, en la industria textil, farmaceútica, cosmética
en el tratamiento de desechos, etc (Castillo,
2012).

Es de baja especificidad hidroliza proteínas y


péptidos de pequeño tamaño, tiene la
capacidad para digerir las proteínas de los
alimentos. Esta enzima ilustrada en la figura 5
se consigue por la extracción del látex, un
líquido blanco lechoso obtenido mediante

Figura 5. Estructura de la proteasa cortes en frutos inmaduros (Taboas, 2002).

La enzima Bromelina es una proteasa ácida que se activa por la cisteína, tiosulfato y
glutatión. Su actividad proteolítica no se modifica por el pH trabaja muy bien entre 3 y
8, está constituida por aminoácidos que se encuentran enrrollados en dos partes
separadas por un puente que tiene un lugar activo con un grupo tiol (SH) libre
(Gallardo, 2008).

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La ficina es una enzima cisteinilproteinasa, cuya actividad proteolítica se manifiesta al
desnaturalizar sus proteínas sustrato mediante la ruptura de enlaces disulfuro generados
por aminoácidos con azufre (Cisteína), enterneciendo la carne. Esta enzima se obtiene
del látex coagulado proveniente de cortes de los brotes de los tallos de la higuera con un
rendimiento de 11-12 gramos de polvo a partir de 100mL de látex (VEGA, 2013).

4.4. Factores
La velocidad a la que las reacciones enzimáticas suceden depende de varios factores
como el pH, temperatura, concentración de sustrato y enzima.

Efecto del pH

La actividad de las enzimas depende de la concentración de los iones hidronio del


medio, ya que afecta el grado de ionización de los aminoácidos de la proteína
incluyendo al sitio activo, todo esto influye en la estructura tridimensional de la enzima,
ya que no hay una actividad óptima por la desnaturalización (Badui, 2006).

Temperatura

La velocidad de las reacciones enzimáticas se incrementa con la temperatura, al


aumentar la energía cinética de las moléculas ero sólo en el intervalo en que la enzima
es estable y retiene su capacidad catalítica; en casos extremos, cuando el incremento es
muy grande, se favorece la desnaturalización y consecuentemente la proteína pierde su
capacidad catalítica (Badui, 2006).

Ph Temperatura
Bromelina 3-8 40-60 °C
Papaína 5-6 65 °C
Ficina 5-8 60 °C

4.5. Aplicaciones
Papaya

Los usos de la papaya son diversos como medicinales


combate los parásitos intestinales, expectorante, mejora
la digestión, anti anémico, etc.; todo ello bajo distintas
recetas medicinales obteniendo varios beneficios de Figura 6. Beneficios medicinales de la
papaya

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las frutas mencionadas como ejemplo se ubica la figura 6, que incluso no presenta mal
aspecto físicamente. Una de las aplicaciones culinarias más comunes es usarla como
ablandador de carnes debido a la papaína que se encuentra en la fruta, ésta puede actuar
en un medio alcalino, ácido o neutro (Jiménez, 2002).

Algunos productos obtenidos a partir de su industrialización son: papaína, pectina,


esencias, medicamentos, aceites, entre otros (García, 2010).

Piña

Posee propiedades anticoagulantes, ayuda en la digestión de los alimentos, y por su


poder antiinflamatorio es eficaz en los tratamientos de la artritis (Rivera, 2011). Se
utiliza principalmente como ablandador de carne (tiene buena actividad sobre los
tendones y tejido conectivo rico en elastina), hidroliza proteínas solubles de la cerveza
que pudieran precipitar y causar opacidad por el enfriamiento (Carrera, 2003), las
proteínas hidrolizadas por la bromelina dejan como residuo polipéptidos que dan sabor
a la cerveza y la capacidad de generar espuma (Oliveira, 2001).

En la industria vinícola estabiliza las proteínas presentes en el vino blanco, ayuda en el


proceso de clarificación (Benucci, 2010). En la industria de los aceites vegetales se
utiliza para refinar aceites y productos grasos, además se usa en la industria panificadora
(Moodie, 2001).

Higo

El higo es una infrutescencia que presenta múltiples beneficios, así por ejemplo como
efectos medicinales se hace referencia al higo como:

Laxante: para utilizar el fruto como laxante se debe hervir 3 higos en un litro de agua,
tomar el líquido y comer los higos; desinfectante: la misma preparación puede usarse
como desinfectante para heridas, cortes o inflamaciones en la boca; expectorante: ayuda
en el tratamiento de la bronquitis y exceso de tos; antirreumático: previene la aparición
de enfermedades reumáticas; para tratamiento de verrugas: la savia con tonalidad blanca
y consistencia viscosa se debe aplicar en las verrugas; para tratar diabetes: el higo
reduce los niveles de azúcar en sangre y reduce la presión arterial, esto con ayuda del té
de las hojas del higo (OLGUÍN, 2013).

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Las proteasas vegetales son la papaína, bromelina y ficina, de las mencionadas la más
utilizada es la bromelina, es un poco más cara que la papaína pero no difiere tanto en
cuanto a su actividad enzimática. La ficina no ha sido usada debido a su alto costo y
disponibilidad (Moodie, 2001).

Ablandadores de carne

La dureza de la carne de vaca depende de muchos factores y en muchas ocasiones se


utilizan medios mecánicos como una maza o una piedra para romper la fibra, sin
embargo, también se suele utilizar la carne con zumo de piña o de papaya, el efecto que
se produce es muy eficiente, a pesar de ello este procedimiento supone una alteración en
el sabor de la carne la misma que puede ser tanto de vaca como de chancho o pollo
(COCINISTA, 2014).

Según (COCINISTA, 2014), es preferible usar un ablandador de carne en polvo, que


contenga enzimas de la piña y la papaya para facilitar que se rompan las fibras más
duras de carne y además no den sabor. Este producto será eficiente en trozos pequeños
de carne dejando actuar entre 1 y 2 horas.

En general de acuerdo a las enzimas que se utilizan en los ablandadores de carne pueden
mencionarse algunos ejemplos de los mismos:

Tabla 2. Ablandadores comerciales

ENZECO® BROMELAIN ENZECO® DUAL PROTEASE


Una proteasa derivada de la piña (Ananas Una combinación de bromelina y papaína
comosus), se caracteriza por su hidrólisis disponible en polvo. Particularmente útil para
selectiva controlada sobre un amplio rango de suavizar mariscos como almeja y calamar
condiciones.
ENZECO® FICIN 100 ENZECO® FUNGAL PROTEASE 300
Derivado del látex del ficus glabrata, tiene un Una enzima fúngica proteólica concentrada
rápido rango de reacción y se desactiva con una procedente de Aspergillus oryzae. Presentación
temperatura baja. en polvo. 300,000 HUT/gramo
ENZECO® NEUTRAL BACTERIAL LIQUIPANOL® T100
PROTEASE 160B
Procedente de amyloliquefaciens, anteriormente Papaína líquida con formula especial.
B.subtilis. Esta preparación enzimática fue
aprobada como suavizante de carne en 1999. La
enzima se desactiva en una temperatura similar a
la ficina pero su costo es mucho menor y su
abastecimiento es más consistente
En un inicio recomendamos de 1000 a 3000 MCU por cada libra de carne
(CORPORATION, 2006).

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CAPÍTULO II

5. Materiales y métodos

5.1. Materiales
Extracción de enzimas

Para llevar a cabo la extracción de enzimas los materiales y equipos que se utilizarn
fueron: 2 cajas petri, 2 hojas de bisturí, espátula, balanza analítica, estufa, mortero,
tubos de ensayo, centrifuga refrigerada, tubos eppendorf, EDTA, citrato de sodio,
bisulfito de sodio.

Actividad Enzimática

En cuanto a los materiales y equipos a ser utilizados en el análisis de la actividad


enzimática se encuentran: vasos de precipitación, pipeta, agitador de vidrio, plancha de
calentamiento, termómetro, cuchillo, balanza analítica, potenciómetro, incubadora.

5.2. Métodos
Extracción de enzimas

Ficina y papaína

 Extracción del látex


1. Limpiar y desinfectar tanto el área de trabajo como los materiales con los que se
va a realizar la extracción.
2. Se lavaron, secaron y pesaron por separados los frutos: babaco e higo para la
extracción del látex.
3. Se realiza cortes longitudinales en la superficie del fruto de 1 a 3mm de espesor,
la recolección del látex se puede realizar en intervalos de tres a cuatro días.
(Barahona, 1983)

 Procesamiento del látex


 Método tradicional

1. El látex obtenido se pesó y se colocó en una caja Petri. Luego se procede a


secarlo en una estufa a 40°C, por aproximadamente 3 horas hasta observar una
consistencia cristalizada.

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2. Después se tritura la muestra obtenida y se procede a su almacenamiento para
posteriores análisis.

 Secado por aspersión

1. Inmediatamente después de la recolección del látex se pesan las muestras y se


adicionan los aditivos (preservantes): bisulfito de sodio, citrato de sodio, EDTA
y se refrigeraron.
2. El látex fue centrifugado a 8000 rpm durante 60 minutos a 4°C, el precipitado se
desecha y el sobrenadante se pesa.
3. La papaína cruda se microencapsula en goma arábiga mediante un secador de
aspersión (Arana, 2012)

Bromelina

1. Se lavó los frutos y se cortó en trozos.


2. Se coloca en un mortero de porcelana para la maceración, se adicionó 5
mililitros de agua destilada.
3. Se colocó en un baño de hielo durante 5 minutos y se agregó 5 mililitros de
acetona fría (1°C) dejando reposar hasta observar un precipitado blanco.

Método 2

1. Se fracciona la pulpa en trozos y se licúa la pulpa.


2. Filtrar el jugo y medir el volumen obtenido.
3. Añadir etanol al 96% a la muestra 1 y NaCl al 10%, 1.5 más veces que el
volumen de la muestra.
4. Almacenar en el congelador a -10°C por 7 días
5. Centrifugar a 4500 rpm durante 20 minutos en tubos Falcon de 15 mililitros
6. Se elimina el sobrenadante y los precipitados se transfieren a vasos de
precipitación.
7. Secar las muestras a 40°C por 48 horas.
8. Enfriar las muestras en el desecador por 10 minutos.
9. Mantener las muestras en refrigeración a 5°C (Dalgo, 2012).

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Actividad Enzimática

Curva de calibración con caseína-Método de Biuret

El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la


formación de un complejo estable entre proteínas y cobre (II). Se presenta un color
violeta característico, observado entre 310 y 560 nm. Después de la adición del reactivo
de cobre se requiere de tiempo para desarrollar la coloración de Biuret considerando
además la posible influencia de aminoácidos libres de la solución buffer (Chang, 1999).

Luego de acuerdo a los datos obtenidos tanto de las absorbancias, como de las
concentraciones se determina la curva d calibración para determinar las concentraciones
desconocidas más precisas por medio de la ley de Beer, las concentraciones deben
caracterizarse por tener valores de concentración cercanos a los reales (López, 2013)

Método casero

Para comprobar la actividad proteolítica de las enzimas se realiza la hidrólisis con


gelatina como sustrato. Se toma dos frutos de cada especie: papaya, piña e higo, un
fruto con grado de maduración 0 (inmaduro) y el otro maduro. Se pesa 7,5 g de gelatina
sin sabor y se disuelve en 200 mililitros de agua. Se coloca la gelatina y trozos de cada
fruta en los vasos de precipitación respectivos, se los coloca en la incubadora a 60°C
por 24 horas para observar la cantidad en ml de hidrolizado de gelatina.

Factor temperatura en la actividad enzimática

En 5 vasos de precipitación se prepara una solución de 7,5 g de gelatina en 200


mililitros de agua. Se corta la piña en trozos pequeños y se coloca en un recipiente con
agua, se saca los trozos de piña a las siguientes temperaturas: 30, 40, 50, 60, y 70 °C.
Después se coloca cada trozo en el vaso de precipitación correspondiente y se observa la
hidrólisis en 24 horas.

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CAPÍTULO III
6. Resultados

6.1. Imágenes

Imagen 1: Hidrólisis de gelatina con piña Imagen 2: Hidrolizado mediante


madura piña madura

Imagen 3: Hidrólisis de gelatina Imagen 4: Hidrolizado mediante


mediante papaya inmadura papaya inmadura

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Imagen 5: Deshidratación del látex Imagen 6: Látex de higo semi
de higo en la estufa deshidratado

Imagen 7: Peso del látex de higo Imagen 8: Trituración del látex


extraído cristalizado

Imagen 9: Peso del babaco Imagen 10: Peso de los higos


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Imagen 11: Recolección de látex de Imagen 12: Hidrólisis de gelatina
babaco mediante papaya madura

Imagen 13: Extracto de ficina Imagen 14: Extracto de papaína

Imagen 15: Hidrólisis de la gelatina Imagen 16: Fracciones de la piña


con ficina. 18
Imagen 17: Filtración del jugo de Imagen 18: Filtrado obtenido del
piña jugo de piña

Imagen 19: Filtrado de jugo de piña Imagen 20: Proceso de precipitación de


con etanol la enzima bromelina.

En la imagen 1 se pueden visualizar las condiciones iniciales de la experimentación de


la hidrólisis con la aplicación de la fruta completa en trozos en este caso haciendo actuar
el enzima denominado bromelina obtenido de la fruta antes mencionada; mientras que
en la imagen 2 se pueden ver claramente los resultados mismos de la acción de la
bromelina tras algunos días de aplicación, a pesar de ello la fruta se encontraba en
estado de madurez.

En la imagen 3 y 4 mientras tanto se puede observar la acción del mismo enzima, sin
embargo el efecto no es el mismo al tratarse de una experimentación con la fruta en

19
estado de inmadurez, siendo así la fruta inmadura más efectiva durante la hidrólisis de
la gelatina.

Por otro lado, en cuanto al proceso de extracción en la imagen 5 se puede observar el


proceso de secado en la estufa (esto para en caso de la Ficina – enzima presente en el
látex de la higuera), tras 4 horas y 30 minutos se puede obtener látex semideshidratado,
lo mismo que se puede verificar en la imagen 6.

Cabe mencionar que el proceso de extracción de la Ficina tuvo ciertos inconvenientes


por lo que tuvo que realizarse en repetidas ocasiones, puesto al inicio la cantidad de
látex no era suficiente, por ello en la imagen 7 se puede verificar que la cantidad es
considerable.

En la imagen 8 siguiendo el protocolo se puede visualizar el siguiente paso de la


obtención del enzima que es la pulverización mediante un mortero, siendo una
característica de los ablandadores de carne comerciales tener un estado sólido (en
polvo). Este procedimiento se lleva a cabo una vez que se ha deshidratado el látex por
completo.

En la imagen 9, 10 y 11 se puede visualizar algunos de los materiales y equipos


utilizados, así se ubican en la última la caja Petri importante al momento de la
deshidratación puesto que la misma sin estar contaminada se debe colocar en la estufa,
la balanza analítica con el peso del babaco y de los higos que se utilizarán para la
extracción del látex, del mismo que se extrae la Ficina, para la extracción de la papaína
(obtenida de la papaya) se realiza el mismo procedimiento que para la Ficina.

La hidrólisis de la gelatina para realizar la comparación enzimática en bromelina (piña),


fiina (higo) y papaína (papaya); se analiza con fruta madura e inmadura como otro
factor de análisis, es así que en la imagen 12 se puede visualizar que la papaína en
estado de madurez no produce mayor hidrólisis, por su parte la Ficina en la imagen 15
produce mayor hidrólisis la fruta en estado de inmadurez como en el resto de frutas, sin
embargo la que mayor hidrólisis produjo fue la bromelina.

En la imagen 13 y 14 se puede visualizar el látex pulverizado tanto en Ficina como en


papaína respectivamente. Es de vital importancia que los frutos tengan un grado de
maduración 0, debido a que en este período de desarrollo del fruto hay mayor
concentración de enzimas.

20
Para la extracción de la bromelina se lleva a cabo un proceso simple, pero detallado es
así que primero se debe conseguir una piña en estado de maduración 0, luego a esta la
pelamos y cortamos en trozos pequeños, se licua y se procede a filtrar, seguidamente se
coloca el jugo obtenido en un vaso de precipitación para tratarlo con etanol como se
menciona en el procedimiento, una vez que se coloca etanol tras un tiempo se procede a
observar y lo que debe resultar es un precipitado de color blanco que será tratado para
obtener de nuevo un pulverizado que contenga en sí el enzima de interés, que en este
caso es la bromelina; todo ello se puede visualizar en las imágenes 16, 17, 18, 19 y 20,
según lo expuesto en el anexo A.

6.2. Discusión

Para este estudio se utilizó tres tipos de enzimas: bromelina, papaína y ficina, que se
encuentran en la piña, papaya e higo respectivamente, para la elaboración de un
ablandador de carne. Para la extracción de bromelina se utilizó todo el fruto en sí,
aunque las concentraciones de la enzima son variables en toda la planta, teniendo una
mayor concentración en el tallo y en el fruto inmaduro (López I. , 2009). En cuanto a la
papaína, ésta se encuentra en toda la planta, pero el látex contiene niveles altos de la
enzima (Andrade M. , 2011) al igual que la ficina en el látex del higo (Bertoluzzo,
2008).

Para la extracción de todas las enzimas, las muestras se basaron en frutos inmaduros
como lo indica la literatura. Para la bromelina se utilizó etanol al 96% y se obtuvo un
precipitado blanco correspondiente a 100ml de enzima cruda, después de estar 4 horas
en la estufa a 40°C, se obtuvo la bromelina cristalizada, la cual tuvo un 47,5% de
humedad. En base al peso de materia prima y bromelina cristalizada obtenida se
determinó un rendimiento del 52,5% (Magallanes, 2013). La extracción se realizó por
triplicado.

Para la papaína se utilizó el látex que debe tener un manejo cuidadoso debido a que la
actividad enzimática se reduce en el lapso del almacenamiento del látex (Fernández,
2005). Se añadió NaCl para la conservación de la muestra y posteriormente se
deshidrató a 50°C por 5 horas hasta obtener un látex seco, el porcentaje de humedad
corresponde al 25,33%. La papaína obtenida es un polvo granuloso de color, parduzco
(Villavicencio, 2011).

21
Para la ficina el látex se recolectó de frutos inmaduros que ya no se encontraban en la
higuera, lo cual dificultó una mayor recolección del látex. La temporada en la que se
recogió el látex correspondió a la de invierno por lo que no se puede obtener un buen
rendimiento. (Chew, 2016). La muestra se secó a 55°C por 6 horas y se obtuvo un ligero
cristalizado por la consistencia misma del látex, el cual no permitió la trituración del
mismo.

Para la determinación de la actividad enzimática, se utilizó gelatina como sustrato y los


jugos de cada fruta para medir la hidrólisis y determinar cuál de las tres enzimas trabaja
de mejor manera. Como se indica en la tabla 4 se registró la cantidad de hidrolizado de
gelatina en mililitros tanto para los frutos inmaduros como maduros.

En la figura 7 se visualiza que en los frutos inmaduros la actividad enzimática es mayor


y que entre las tres frutas del análisis, la bromelina que se encuentra presente en la piña,
tiene una actividad 6 veces mayor a la ficina y dos veces mayor para la bromelina lo
cual se contrasta con la bibliografía que indica que la mayoría de ablandadores de carne
tiene como base en su fórmula industrial a la bromelina como enzima principal, debido
a que en el procesamiento industrial de la piña se generan desechos como la cáscara,
tronco y corona que contiene niveles altos de la enzima, mientras que en la papaya el
único residuo es la cáscara que contiene cantidades mínimas de papaína, y en cuanto al
higo, su procesamiento es muy costoso (López I. , 2009).

En cuanto al experimento casero, se utilizó como sustrato la gelatina para realizar su


hidrólisis con las diferentes enzimas, los datos experimentales se indican en la tabla 4,
que son los ml de hidrolizado de gelatina respecto de las frutas maduras e inmaduras,
como resultado se obtiene que la enzima que tiene una alta actividad enzimática es la
bromelina ya que trabaja a temperaturas entre los 30 y 60°C que se determinó en el
experimento del factor temperatura (Badui, 2006).

En base a este análisis casero de la actividad enzimática se optó por modificar los
factores a los que puede ser susceptible la bromelina como lo es la temperatura. En la
tabla 7 se determinó que la temperatura óptima para la reacción se encuentra entre 40 y
60°C, así como también en la figura 8 se puede verificar la actividad enzimática con
respecto a la temperatura. Inclusive se tiene la tabla 6 en la que se comparan los
porcentajes de humedad en cada uno de los casos.

22
Para la elaboración del ablandador de carne se utilizó cloruro de sodio 90%, enzima
4,5%, almidón 4,5% y glutamato de sodio 1%. Solo se elaboró el ablandador de carne
con bromelina, debido a que la cantidad de látex de papaína y ficina, fue muy mínima y
en el proceso de secado se perdió casi toda la muestra por el alto contenido en agua.

El ablandador se aplicó en una muestra cárnica con y sin ablandador y se realizó el


análisis sensorial a 20 personas, se obtuvo como resultados una mayor aceptación por la
carne con ablandador, se puede concluir que las enzimas aplicadas a los ablandadores,
rompen las fibras musculares de la carne lo cual facilita el proceso de cocción de la
misma lo que se puede verificar en la figura 9 (Chew, 2016).

6.3. Análisis Estadístico de los Resultados

Tabla 3. Parámetros químicos

Extracto pH
Bromelina 4.1
Papaína 5.5
Ficina 4.6
Tabla 4. Datos de la ctividad enzimática

Bromelina Papaína Ficina


Madura Inmadura Madura Inmadura Madura Inmadura
17 23,7 7,5 13,8 3,5 4,9
15,4 24,1 6,2 9,5 3,4 4,2
16,2 25 7,8 12,3 2,8 3,7
18,6 22,3 5,4 10,9 2,5 4,1
Tabla 5. Medidas centrales de los datos experimentales

Bromelina Fruto maduro Fruto inmaduro


Media 16,8 23,78
Desviación estándar 1,37 1,12
Papaína Fruto maduro Fruto inmaduro
Media 6,73 11,63
Desviación estándar 1,12 1,85
Ficina Fruto maduro Fruto inmaduro
Media 3,05 4,23
Desviación estándar 0,48 0,5

23
Actividad enzimática
25

20

15

10

0
Bromelina Papaína Ficina

Fruto maduro Fruto inmaduro

Figura 7. Diagrama de barras para las medias de la actividad enzimática de bromelina, papaína y
ficina

Tabla 6. Datos de la extracción de las enzimas

Peso de la fruta Peso de extracto Peso de % de


crudo extracto seco Humedad
Piña 1,36 kg 100 ml 15 g 47,5%
Papaya 1,61 kg 11,04 g 0,88 g 25,33%
Higo 1,97 kg 31,55 g 5g 90%

Tabla 7. Datos de reacción enzimática VS temperatura

Temperatura °C ml de hidrolizado
30 4,9
40 7,3
50 7,7
60 7,5
70 2

Actividad enzimática de la bromelina


10
ml de hidrolizado de gelatina

8
6
4
2
0
0 20 40 60 80
Temperatura

24
Figura 8. Curva de la actividad enzimática vs la temperatura
Muestra sin ablandador Muestra con ablandador
Me disgusta Me disgusta

20% 0%
9%
35% Me disgusta Me disgusta
muy poco 43% muy poco
15%
48%
30% Me gusta Me gusta

Me gusta Me gusta
mucho mucho

Figura 9. Análisis sensorial de la aceptación de la muestra cárnica con ablandadores de carne

25
CAPÍTULO IV

7. Conclusiones

 Se determinó por una prueba de hidrólisis de la gelatina, que la bromelina de


fruta en estado de maduración cero, tiene mayor actividad enzimática frente a las
otras enzimas como son la Ficina y la papína, objeto de estudio.
 El método de extracción más adecuado para la bromelina que se determinó es
por precipitación que está detallado en el anexo A, mientras que, para el látex
tanto de Ficina como de papína, es la cristalización del mismo.
 Se analizó los factores que intervienen en la actividad enzimática y la
temperatura desestabiliza la bromelina a temperaturas extremas. Este dato es
importante puesto que de ello depende el producto elaborado.
 El uso del ablandador de carne con bromelina tuvo respuestas positivas en
cuanto a la aplicación en muestras cárnicas, según lo que se manifiesta en las
gráficas correspondientes a las encuestas realizadas.

8. Recomendaciones

 Se recomienda tener mucho cuidado con las condiciones de secado para evitar
que la muestra se queme, es decir un correcto manejo de la temperatura durante
la experimentación.
 Se recomienda utilizar el secado por aspersión para evitar que los extractos
tengan contaminantes y para asegurar la estabilidad de la enzima.
 Mantener las proporciones para la elaboración de carne, ya que elevadas
concentraciones de enzima o glutamato de sodio, puede tener efectos adversos
para el consumo.

26
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29
10. ANEXOS

ANEXO A. Protocolo de extracción de la bromelina

30
31
32
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