Journal of Chromatography B, 1006 (2015) 1-7

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Análisis de la estereoquímica y la biosíntesis de epicatequina en plantas de té

por cromatografía líquida de alta resolución en fase quiral
Yumei Qian un,segundo , Zhao Xianqian do , Zhao Lei re , Lilan Cui un , Li Liu un , Jiang Xiaolan un ,
Liu Yajun do , Gao Liping do,** , Tao Xia un,*
a Laboratorio Estatal Clave de Biología Vegetal de té y utilización, Universidad de Agricultura de Anhui, 130 West Changjiang Rd., Hefei 230036 Anhui,

China segundo Facultad de Ingeniería Biológica y la Alimentación, Universidad de Suzhou, 49 Medio Bianhe Rd., Suzhou 234000 Anhui, China
do
Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Agricultura de Anhui, 130 West Changjiang Rd., Hefei 230036 Anhui, China
re
Escuela de Horticultura, Qingdao clave Laboratorio de Genética y Mejoramiento de Cría en plantas hortícolas, Qingdao Universidad de Agricultura,
700Changcheng Rd., 266109 Qingdao Shandong, China

artículo info abstracto

Historia del artículo: Té (Camellia sinensis) es rica en flavan-3-oles (catequinas), especialmente epicatequina (EC), que es la unidad de extensión
Recibido el 28 de junio de el año 2015 predominante de proantocianidinas polímeras (PAs). Sin embargo, los estudios que evalúan estéreo-ochemistry de CE son
Recibida en forma de 16 revisada en octubre el escasos. Aquí, se aplicó una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento usando tris- amilosa (3, 5-
año 2015 Aceptado el 16 de octubre de el año dimetilfenilcarbamato) inmovilizado en sílice-gel como fases estacionarias quirales (CSP) para explorar su estereoquímica y
2015 Disponible en Internet el 23 de octubre de vía de biosíntesis en las plantas de té. Los resultados revelaron (-) Epicatequina [(-) -EC] fueron los predominantes di-hyroxy-
el año 2015 no-catequinas galloylated, mientras que (+) - epicatequina [(+) - CE] no se detectó. Curiosamente, (-) -EC fue el único producto
obtenido a partir de cianidina usando el parcialmente puri-fied C. sinensis nativo antocianidina reductasa (CsANR) en presencia
palabras clave: de fosfato de reducción de dinucleótido de nicotinamida adenina (NADPH); Mientras tanto, (+) - EC fue el producto principal
cromatografía líquida de alto rendimiento usando CsANR recombinante en las mismas condiciones. En adición, (-) -EC podría ser obtenido a partir de (+) - catequina [(+)
fase quiral
- C] usando CsANR recombi-nant, que está representada C3 actividad -epimerase en presencia de oxidación nicotinamida
Estereoquímica
Biosíntesis adenina dinucleótido fosfato (NADP+). Pero el CsANR nativa parcialmente purificada no poseía esta función. Finalmente, (-) -
epicatequina EC podría resultar de la reacción de ácido de-galato de galato de epicatequina (ECG) catalizada por una novela parcialmente
Té nativa purificada galloylated catequinas hidrolasa (GCH) a partir de hojas de té. En resumen, (-) -EC es probable que el producto
de la proteína nativa de las plantas de té, y (+) - CE sólo se produce en una reacción catalizada por CsANR recombinante in
vitro.

© 2015 los autores. Publicado por Elsevier Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY
(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

1. Introducción Estudios previos han encontrado que la 2R-flavan-3-oles son

Té [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze], se originó en China, es una de las
bebidas más ampliamente cultivadas y consumidas en todo el mundo. Flavan-
3-oles (catequinas) son la principal clase de metabolitos secundarios en plantas
de té; que son responsables de la calidad del té y beneficioso para la salud
humana[1-4].
Debido a dos átomos asimétricos en el C2 y C3 posiciones, se conocen
cuatro tipos flavan-3-ol heterogéneos, incluyendo (2R, 3R) -cis-flavan-3-oles
(es decir, (-) Epi-form), (2S, 3S) cis-3-oles flavan (es decir, (+) - epi-forma),
(2S, 3R) trans-flavan-3-oles (es decir, (-) -forma), y (2R, 3S) -trans--3-oles
flavan (es decir, (+) - forma) (Figura 1UN).
principalmente de dos tipos (es decir, de forma epi y no epi-forma) que
consisten en (-)-galato de epigalocatequina [(-) -EGCG], (-) -epigallocatechin
[(-) -EGC], (-) Galato de epicatequina [(-) -ECG], (-) -EC, (+) - C y (+) -
galocatequina [(+) - GC] en plantas de té, utilizando la tecnología de
cromatografía de papel de dos vías [5]. El contenido de epicatequinas (EC), el
término colectivo para (-) -EC, (-) -EGCG, (-) -EGC, y (-) -ECG, podría verse
afectada por diferentes condiciones de cultivo; por ejemplo, el contenido de
ECs disminuyó por el sombreado[6]. Sin embargo, los EC con-stitute los
principales componentes de catequinas totales en las hojas de té [7] (Figura
1SEGUNDO). 2S-flavan-3-oles, siendo no nativo flavan-3-oles, tales como (-)
Galato de -gallocatechin [(-) -GCG], (-) -gallocatechin [(-) -GC],

* **
Autor correspondiente. Fax: +86 551 65785729. Autor
correspondiente. Fax: +86 551 65785729.
Correos electrónicos: gaolp62@126.com (L. Gao), xiatao62@126.com (T. Xia).
(-) Catequina [(-) -C], y (-) Galato de catequina [(-) -CG], solamente se
detectaron en el té elaborado. Por ejemplo, Chen et al. reportó que (-) los niveles
-GCG podrían alcanzar tanto como 50% de catequinas totales en algunas
bebidas de té, utilizando HPLC [8]; Además, Gotti et al. reportó que (-) -GC y
(-) -C fueron detectados en la infusión de té a las 85 ◦ C para

http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2015.10.024
1570-0232 / 2015 © los autores. Publicado por Elsevier Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
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Figura 1. Estereoquímica de flavan-3-oles. (A) cuatro tipos de flavan-3-oles; (B) epicatequinas típicos en las plantas de té.
5 min a través de un quiral electrocinético Chromatog-raphy ciclodextrina-
micelar método (CD-MEKC) [9].
cromatografía líquida de alto rendimiento bien conocido por
enantioseparación directa basada en diferentes CSPs (es decir, HPLC quiral) ha
recibido una atención creciente debido a sus ventajas, y los CSP basadas en
polisacáridos son más potente, gracias a su alta capacidad de carga y una amplia
aplicabilidad[10,11]. Para nuestro conocimiento, los estudios que utilizan
HPLC quiral con tris- amilosa (3,5-dimetilfenilcarbamato) inmovilizado en
sílice-gel para identificar la estereoquímica de flavan-3-oles en las hojas de té
frescas son susto.
Por (-) -EC biosíntesis, puede haber tres biosintéticas de caminos maneras
en las plantas de té. La principal es la síntesis de novo (Figura 2). Xie et al.
descrito antocianidinas como los sustratos más eficaces, y reductasa
antocianidina (ANR) como enzimas claves codificadas por genes impor-tantes;
por ejemplo, BANYULS (BAN) de Arabidopsis thaliana y truncatul Medicago
podrían convertir cianidina en (-) -EC en presencia de NADPH [12]. El estudio
adicional reveló (-) -C como un subproducto menor en el sistema de reacción
de la enzima anteriormente, directamente de (-) -EC después de un no
enzimática C2 -epimerization [13].
Recientemente, se han propuesto nuevos desarrollos para el func-ción de la
ANR. Gargouri et al. informado de que (+) - CE y (-) -C son producidos a partir
cianidina utilizando recombinante Vitis vinifera reductasa antho-cianidina
(VvANR) en presencia de NADPH[14]. Pang también informó de que CsANR
recombinante podría convertir cianidina a los mismos productos como
anteriormente en vitro [15]. Sin embargo, (+) - CE y (-) -C no se detectan en la
planta del té; específicamente, (+) - EC rara vez se encuentra en el reino
vegetal[dieciséis]. Hasta ahora, los estudios anteriores han informado de la
estereoquímica de la CE obtenida de cianidina mediante el uso de reco-binant
ANR in vitro, pero no informó de que por la ANR nativa in vivo.
La segunda ruta biosintética se asume que (-) Resultados de -ec de (+) - C
por epimerización. Los numerosos estudios han demostrado
que epimerización de flavan-3-oles se puede clasificar en dos tipos, a saber, no
enzimática y enzimática epimerización. epimerización no enzimática a menudo
se produce en el extremo C2 posición bajo condiciones ambientales externas
extremas tales como alta temperamento-Ature o pH mayor que 6,0 [17-20]. En
condiciones físicas moderadas, epimerización no enzimática entre (-) -EC y (-)
-C podría ser observado sólo después de la incubación de (-) -EC en tampón
mM Tris-HCl 100 con pH 7 a temperaturas superiores a 30 ◦ C durante 30 min,
pero no en tampón MES [13]. Mientras tanto, la epimerización enzimática se
produce en el C3posición. Curiosamente, VvANR recombinante podría actuar
como un puro C3 -epimerase de 2R-flavan-3-oles en dirección inversa, pero no
+
2S-flavan-3-oles en presencia de exceso de NADP ; en otras palabras, (-) -EC
se obtuvo a partir de (+) - C por enzimática epimeriza-tionin vitro[14].
En la tercera ruta de biosíntesis, (-) -EC puede resultar de la reacción de
ácido ECG a través de-galato. Nuestro estudio anterior indica que una proteína
nativa novela, llamado catequinas galloylated hidrolasa (GCH), podría catalizar
ECG en CE[21]. Este documento, se identificó mediante el uso de HPLC quiral
que (-) -EC podrían obtenerse de reacción ácido-galato DE.
De acuerdo con informes anteriores, surgen varias preguntas en cuanto a (-
) -EC la biosíntesis de las plantas de té. Por ejemplo, ¿cuál es la estereoquímica
de la CE en las plantas de té? Hacer las mencionadas tres vías de biosíntesis de
(-) -EC realmente existir en las plantas de té? A continuación, se utilizó HPLC
quiral para determinar la estereoquímica de la CE, y encontramos (-) -EC, no
(+) - CE, en las plantas de té. Posteriormente, hemos demostrado que (-) -EC
fue el único producto de la CsANR nativo parcialmente purificado a partir de
hojas frescas de té utilizando cianidina como sustratos, y el ATypI-cal flavan-
3-ol (+) - EC fue el principal producto de CsANR recombinante en las mismas
condiciones. En adición, (-) -EC podría ser obtenido a partir de (+) - C a través
de C3 -epimerization catalizada por recombinante CsANRin vitro.
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Figura 2. ruta de biosíntesis de (-) -EC en las plantas de té. PAL: amoníaco fenilalanina
liasa; C4H: cinamato 4-hidroxilasa; 4CL: 4-cumaroil-CoA ligasa; CHS: fíos
cono sintasa; CHI: chalcona isomerasa; F3H: flavanona 3-hidroxilasa; F3 H:
flavonoide 3-hidroxilasa; DFR: dihidroflavonol 4-reductasa; LAR: leucoanthocyani-din
reductasa; ANS: antocianidina sintasa; ANR: reductasa antocianidina; ECGT, epicatequina
glucosiltransferasa; GCH, galloylated catequinas hidrolasa.
Sin embargo, nativo C3-epimerase no se detectó en las plantas de té.
Finalmente, (-) -EC se obtuvo de ECG después de la catálisis por el GCH par-
cialmente purificada a partir de hojas de té frescas mediante la reacción de ácido
de-galato.
2. materiales y métodos
2.1. Materiales vegetales
Los brotes jóvenes (de raíz, hojas primera y segunda) de plantas de té [C.
sinensis (L.) O. Kuntze] se selecciona del jardín de té Experimental,
Universidad de Agricultura de Anhui, Anhui, China, durante el comienzo del
verano. Todas las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido
y se almacenaron a-80 ◦ C hasta su uso.
2.2. Sustancias químicas y reactivos
Los compuestos (-) -C, (+) - C, (-) -EC, y ECG fueron adquiridos de Sigma
+
(St. Louis, MO, EE.UU.). sal tetrasódica de NADPH y NADP sal de sodio se
obtuvieron de Roche Diagnostics (indi-anapolis, IN, EE.UU.). metanol grado
HPLC, acetonitrilo, ácido acético, acetato de etilo, n-hexano, etanol y 2-
propanol se adquirieron de Tedia Co., Ltd. (Fairfield, OH, EE.UU.). cloruro de
cianidina se adquirió de Axxora Co., Ltd. (Lausanne, Suiza). reactivos Analyti-
Cal, incluyendo triclorometano, ácido fórmico, concentrados
3
ácido clorhídrico, vainillina, y otros disolventes usados para la extracción
fueron adquiridas de Sinopharm Agentes químicos Co., Ltd. (Shang-Hai,
China).
2.3. Extracción y purificación de catequinas
catequinas totales se extrajeron y se purificaron como método anterior [22],
con una ligera modificación. Brevemente, se molió 1 g de la muestra a polvo
en nitrógeno líquido y se extrajo con 10 ml de metanol durante 10 minutos en
un sonicador de ultrasonidos a 4 ◦ C. Después de centrifugación a 5000 g
durante 10 min a 4 ◦C, se recogieron los sobrenadantes para la extracción total
de catequinas. Los residuos se volvieron a extraer dos veces como se describe
anteriormente. catequinas totales se purificaron en capa fina CHRO-
matography (TLC, GF254 hoja de TLC, 5×20 centímetros; Biotecnología Co.,
Hefei, China) usando cloroformo: metanol: ácido fórmico (28: 10: 1, v / v)
como eluyente, y se detectaron con 1% de vainillina-HCl (w / v). manchas
CHRO-matography CE y C fueron identificados por valores de Rf y la
comparación con los estándares; estas manchas de cromatografía se recogieron
y se disolvieron en metanol. Después de centrifugación a 5000 g durante 10 min
a 4◦ C, los sobrenadantes se filtraron a través de una membrana de 0,22 m para
un posterior análisis de cromatografía.
2.4. El análisis por cromatografía en fase inversa de (epi) -catechins
La CE y C en metanol se separaron y se identificaron mediante
cromatografía de fase inversa (RP-HPLC) en una columna de Fusion-RP80
Phenomenex Synergi 4 (5 m, 4,6 ×250 mm). análisis RP-HPLC se llevó a cabo
como se informa por Liu et al.[23]. El sistema disolvente consistió en 1% (v /
v) de ácido acético (A) y 100% de acetonitrilo
(SEGUNDO). Un gradiente lineal a una velocidad de flujo de 1,0 ml / min fue
establecido después de injec-ción (5 L) como sigue: B de 13 a 30% (v / v) en
30 min, y B de 30 a 13% (v / v ) durante 30-35 min. Los espectros de ultravioleta
se registraron en un detector de matriz de Aguas 600UV (Waters Corporation,
Milford, MA, EE.UU.) a 280 nm. Los compuestos fueron identificados por los
espectros de UV y características cromatográficas con patrones auténticos.
2.5. El análisis por cromatografía de fase quiral de (epi) -catechins
Los estereoisómeros de (+) - C (y-) -EC fueron separados en una columna
de HPLC chi-ral (nº de catálogo 80325;. Chiral Technologies; 5 m, 4,6 ×250
mm) con tris- amilosa (3,5-dimetilfenilcarbamato) inmovilizado en sílice-gel.
La HPLC quiral analítica se formó per-como se ha descrito por Pang et al.[15]
con algunas modificaciones. Disolventes A (ácido 0,5% acético en hexano) y B
(ácido acético al 0,5% en etanol) se usaron a una velocidad de flujo de 1 ml /
min con el seguimiento-ing gradiente: 0-10 min, 15% B; 10-20 min, 15-20% de
B; 20-23 min, 20-50% de B; 23-38 min, 50% B; 38-45 min, 50-15% de B. Los
otros con-diciones fueron los mismos que RP-HPLC.
Para construir las curvas de calibración, los estándares de (+) - C y (-) -EC
se disolvieron y se diluyeron en metanol a una serie de diferentes
concentraciones (es decir, (+) - C con rangos ,50-0,01 mg / ml y (-) -EC con
rangos de desde 0,35 hasta 0,02 mg / ml). El contenido de los estereoisómeros
de (+) - C y (-) -EC en las hojas de té frescas se calcu-lated por las curvas de
calibración.
2.6. extracción enzimáticos y ensayos
proteínas nativas de las hojas de té frescas se extrajeron en accor-dance con
el método de Zhang et al. [24].precipitación con sulfato de amonio se utilizó
para la purificación preliminar de las proteínas nativas. Las fracciones de 0-
40% y sulfato de amonio% 40-70 se recogieron como CsANR nativo
parcialmente purificado y CsGCH pro-teins respectivamente para el ensayo
enzimático. El CsANR recombinante expresada en Escherichia coli se preparó
y se purificó de acuerdo con el estudio previo[25].
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Fig. 3. Análisis de la estereoquímica de (epi) catequina en hojas frescas. (A) Aislamiento y purificación del total de flavan-3-oles de hojas frescas vía TLC; (B) análisis de RP-HPLC de la primera
mancha cromatográfica en TLC; (C) más análisis HPLC quiral de la primera mancha cromatográfica en TLC; (D) Cromatografía de fase inversa de los niveles de C y CE; (E) la cromatografía en fase
quiral de los estándares de (-) -C, (+) - C y (-)-CE.
con un predominio de (-) -EC de acuerdo con el análisis cuantitativo. El
reacciones de ensayo ANR se incubaron a 45 ◦ C durante 0,5 h en un contenido de (-) -EC fue 5,49 ± 0,53 mg / g DW y la de (+) - C
volumen total de 1 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 6,5), contiene-ing mM de
cloruro de 0,5 cianidina, NADPH 2 mM, y 0,8 mg parcialmente proteína ANR
nativa purificada o 0,2 mg de proteína CsANR recombinante.
epimerización CsANR recombinante se llevó a cabo a 30 ◦ C durante 0,5 h
en un volumen total de 1 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,5), que contiene
+
NADP 2,5 mM , 0,25 mM (+) - C o (-) -EC, y 0,2 mg de proteína CsANR
recombinante.

epimerización no enzimática se realizó a 80 ◦ C durante 0,5 h en un volumen

total de 1 ml de solución acuosa que contiene 0,25 mM (+) - C o (-)-CE.

reacción ácido De-galato se incubó a 30 ◦ C durante 0,5 h en un volumen

total de 1 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,0), que contienen ECG 8 mM,
ácido ascórbico 4 mM, y 0,08 mg de proteína parcialmente purificada GCH
nativo.

Todas las reacciones enzimáticas se iniciaron mediante la adición de la

solución de enzima apropiada, y se terminaron mediante la adición de acetato
de etilo. Los productos enzimáticos se identificaron a través de la anteriormente
RP-HPLC o HPLC quiral.

3. Resultados y discusión

3.1. Análisis cualitativo y cuantitativo de (epi) -catechins

estereoquímica en las hojas de té frescas

En las últimas décadas, la importancia de la estereoquímica ha recibido una

gran atención, y HPLC quiral como un método eficaz que se ha solicitado la
enantioseparación[26-30]. En este caso, se utilizó HPLC chi-ral para identificar
la estereoquímica de catequinas en las hojas frescas de té.

En primer lugar, las catequinas totales se extrajeron de las hojas de té

frescas y se disolvieron en metanol, y posteriormente aislarse y purificarse por
TLC (verFig. 3UN). De acuerdo con las normas, la primera mancha
cromatográfica sobre TLC representaba la mezcla de CE y C, y se cionado-col
para la identificación adicional por RP-HPLC y HPLC quiral (verFig. 3segundo
y C). Sobre la base de la (-) -EC y (+) - estándares auténticos C se muestra en
la Fig. 3E, (-) -EC y (+) - C existía principalmente en las hojas de té frescas,
fue 0,52 ±0,03 mg / g DW. Sin embargo, el (+) - CE y (-) -C no se detectaron.

3.2. Identificacion de (-) -EC de reacción de reducción enzimática

Múltiples estudios han demostrado que la CE es el producto de ANR

usando cianidina como sustrato [12,17,24,25,31-33]. Sin embargo, pocos
genealógicos IES se han centrado en la estereoquímica de estos productos
enzimáticos [14,15].

Para investigar la estereoquímica de EC producido a partir de cyani-din en

las plantas de té, los productos de la reacción catalizada por la CsANR nativa
a partir de hojas de té frescas se aislaron y se purificaron por TLC.
Posteriormente, los productos purificados se recogieron y piel-Ther analizaron
usando HPLC quiral. Como se muestra enFig. 4UN, (-) -EC fue el único
producto obtenido a partir de cianidina usando CsANR nativo parcialmente
purificado en presencia de NADPH.

Bajo las condiciones de reacción anteriores, CsANR recombinante

convierte principalmente cianidina en productos de (+) - EC y (-) -C (Fig. 4B),
y un producto de menor importancia (-)-CE. Estos hallazgos se afirmaron que
con-(-) -EC resultó de reacción de reducción CsANR en plants.However té, los
mecanismos catalíticos de CsANR nativa en plantas de té y CsANR
recombinante in vitro son diferentes.

3.3. Identificacion de (-) -EC de epimerización

La epimerización puede constituir otra vía de biosíntesis de (-) -EC y ANR

es probablemente una epimerasa. Gargouri et al. informó de que VvANR
recombinante actuó no sólo como reductasa, sino también como C3 -epimerase
in vitro [14,34].
A fin de abordar si CsANR tiene una doble función, CsANR recombinante
se incubó en tampón de fosfato a pH 7,5 y 30 ◦ C durante 0,5 h usando (-) -EC
+
o (+) - C como sustrato, respectivamente, en presencia de NADP .
Curiosamente, (-) -EC y (+) - C fueron convertidos en sus respectivos C3 -
epimers, (+) - C y (-) -EC (ver Fig. 5UN y SEGUNDO); Además, C3 -
epimerization no se detectó con Salida CsANR o con la proteína CsANR
hervida (la fecha no se muestra). Estos resultados indicaron que CsANR
+
recombinante también actúa como C3 -epimerase en presencia de NADP in
vitro. En otras palabras, (-) -EC podría derivar a partir de (+) - C también. Sin
embargo, C3 No se detectó reacción -epimerase gato alyzed por CsANR nativa
a partir de hojas frescas, y
 Y. Qian et al. / J. Chromatogr. B 1006 (2015) 1-7 5

Fig. 4. El análisis por HPLC quiral de productos resultó de cianidina por CsANR nativo parcialmente purificada o CsANR recombinante en presencia de NADPH. Productos (a) resultó de la parcialmente
purificada catálisis CsANR nativo después de la purificación mediante TLC; (B) los productos de la CsANR recombinante.

Fig. 5. análisis HPLC quiral de los productos usando (epi) catequina como sustratos en CsANR recombinante o reacción no enzimática, respectivamente. (A) los productos de CsANR recombinante
utilizando (+) - C como sustrato en presencia de NADP +; (B) los productos de CsANR recombinante utilizando (-) -EC como sustrato en presencia de NADP +; (C) productos de (+) - C incubaron en
agua a 80◦DO; (D) los productos de (-) -EC se incubaron en agua a 80◦ DO.

epimerización no enzimática no ocurrió en el C3 posición en vitro.
Estudios previos que evaluaban epimerización no enzimática en el extremo
C2 posición han demostrado que la transformación recíproca entre CE y C se
produce a menudo durante el procesamiento de alimentos principalmente
debido a las altas temperaturas [13,16,18,19]. Aquí, la epimerización en la
posición C2 posición no se detectó en 30 ◦ C o 45 ◦C en diferentes soluciones
(tampón Tris-HCl, tampón fosfato y agua purificada) para diferentes tiempos
de calentamiento (de 0,5 h a 5 h) con pH 6,0 a 7,5 (fecha no se muestra). Sin
embargo, la epimerización en la posición C2 Se observó posición en 80 ◦ C
durante 0,5 h usando (-) -EC o (+) - C como sustrato, respectivamente, en agua
purificada (ver Fig. 5do y D), que era consistente con los informes anteriores
[18,19,35].
la investigación ha indicado que galloylated catequinas, incluyendo (-) - EGCG
y (-) -ECG, comprenden hasta 76% de catequinas totales en las plantas de té
[36]. Es importante destacar que, Liu et al. descubierto una nueva enzima nativa
implicados en la ruta biosintética de catequinas galloylated[23]. Nuestros
experimentos preliminares revelaron también otra proteína nativa novela que
pertenece a las enzimas hidrolíticas, lo que podría convertir ECG a EC y ácido
gálico (GA) mediante la reacción de ácido de-galato
[21] (ver Fig. 6UN).
Se analizaron también la estereoquímica de los productos de reacción de
ácidos de-galato usando HPLC quiral después de la purificación mediante TLC,
y se encontró que (-) -EC era de hecho el producto de la reacción catalítica de
ácido de-galato de enzima (ver Fig. 6SEGUNDO). Por lo tanto, (-) -EC podría
resultar de (-) -ECG través de la reacción de ácido de-galato.

De los resultados anteriores, inferimos que la (-) -EC pudieran derivarse de

(-) -C por C2 - epimerización en condiciones ambientales extremas tales como 4. conclusiones
alta temperatura para el tratamiento de tiempo corto, pero no ocurrió en
Flavan-3-oles están ampliamente distribuidos en las plantas de té, frutas y
condiciones fisiológicas (por ejemplo, 30 ◦ C o 45 ◦ DO).
verduras, y existen en formas monoméricas y poliméricas [37-43]. Estudios
anteriores han demostrado que monomérico (epi) catequina era el bloque de
3.4. Identificacion de (-) -EC de la reacción ácido-galato des construcción de poliméricos flavan-3-oles, comúnmente conocido como PAS
(también nombrado taninos condensados), que están implicados en importantes
los tercero posible biosintética camino de (-)-CE es funciones fisiológicas en plantas y beneficioso para la salud humana
por camino de de-galato ácido reacción de (-) -ECG. Anterior
6 Y. Qian et al. / J. Chromatogr. B 1006 (2015) 1-7
Fig. 6. Análisis de los productos de ECG a través de reacción de ácido de-galato catalizadas por el GCH nativo parcialmente purificado a partir de hojas de té frescas. (A) análisis de RP-HPLC de los
productos resultó de ECG; (B) un mayor análisis HPLC quiral de la mancha cromatográfica de CE después de la purificación mediante TLC.
salud [44-49]. En las plantas de té, nuestro estudio anterior indicó que la CE es
la unidad básica para las AP poliméricos que son abundantes en las raíces[50].
Tradicionalmente, CE se considera el producto de ANR usando cyani-din como
sustrato [12,31]. Hasta ahora, pocos estudios se han centrado en la
estereoquímica CE [12-15,51].
En este trabajo, se encontró que (-) -EC fue el predominante di-hidroxi-no-
galloylated-flavan-3-ol en las hojas de té, mientras que (+) - no se detectó EC.
Para entender mejor la biosíntesis de (-) -EC, se utilizó la columna de HPLC
quiral para identificar la estereoquímica de EC catalizada por CsANR nativa en
plantas de té y CsANR recombinante in vitro. En efecto, (-) -EC fue el único
producto resultante de la reacción CsANR nativo, mientras que (+) - EC fue el
principal producto de la reacción CsANR recombinante. A pesar de que (-) -
EC como un prod-UCT menor se detectó en la reacción CsANR recombinante,
basado en los resultados reportados por Xie et al., Podría derivar de (-) -C través
de epimerización no enzimática en el extremo C2 posición [13]. En adición, (-
) -EC podría resultar a partir de (+) - C por CsANR recombinante que posee
C3- actividad de epimerasa en vitro. Sin embargo, el CsANR nativa
parcialmente purificada a partir de hojas de té no exhibió esta función. Basado
en la descripción anterior, podríamos inferir que las funciones CsANR son
bastante complejos, y los mecanismos de CsANR en plantas de té eran
diferentes de los in vitro. Finalmente, (-) -EC resulta probablemente de reacción
ácido-galato de DE de (-) -ECG por una novela parcialmente enzima hidrolítica
purificada en las plantas de té. Para resumir, (-) -EC es probablemente un prod-
UCT de la proteína nativa de las plantas de té, mientras que (+) - CE sólo se
produce por CsANR recombinante in vitro.
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de China
(31570694, 31470689, 31300577, 31200229 y 31170282), el Fondo de
Investigación Especializada para el Programa de Doctorado de Educación
Superior (20133418130001), Proyecto de Demostración de Anhui Mayor para
Leading Talento Equipo de Química del té y Salud y la Biología de clave de
asunto Construcción de Anhui y Ciencia abierta Foun-dación de la Universidad
de Suzhou (2010YKF26). Estamos muy agradecidos con el Dr. Xianzhi Él para
corregir la gramática Inglés en el manuscrito y por sus sugerencias amables.
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