celular

https://doi.org/10.1007/s13238-018-0527-6 Proteína y de la célula

R ARTÍCULO NVESTIGACIONES

Mieloide especí fi c focalización de Notch aminora renal murino fi

fibrosis vía reduce en fi filtración y la activación de macrófagos
de médula marrow- derivada

Yali Jiang 1,2, Wang Yuanyuan 1,2, Pengfei Ma 1, Un Dongjie 1, Zhao Junlong 1, Shiqian Liang 1, Vosotros Yuchen 1,
Yingying Lu 2, Peng Zhang 2, Liu Xiaowei 2 y, Han Hua 1 y, hongyan Qin 1 y

Estado clave Laboratorio de Biología del Cáncer del Departamento de Genética Médica y Biología del Desarrollo, Cuarta Universidad Médica Militar, Xi ' un 710032, China

Proteína y de la célula
1

2 Departamento de Nefrología, Hospital Xijing, Cuarta Universidad Médica Militar, Chang-Le Xi calle # 15, Xi ' un 710032, China

y Correspondencia: liuxiaow@fmmu.edu.cn (X. Liu), huahan@fmmu.edu.cn (H. Han), hyqin@fmmu.edu.cn (H. Qin) Recibido el 28 de noviembre de, 2,017

Accepted 28 de febrero 2018

ABSTRACTO Por último, encontramos que mieloide especí fi renal activación de c Notch agravado fi
fibrosis, que fue mediada por macrófagos + CCR2 en fi filtración. En resumen,
Los macrófagos juegan papeles críticos en renal fi fibrosis. Sin embargo, los
nuestros datos han revelado que mieloide especí fi c focalización de Notch podría
macrófagos muestran heterogeneidades ontogénicas y funcionales, y que la
mejorar renal fi fibrosis mediante la regulación de los macrófagos BM-derivado
población de macrófagos contribuye a renal fi fibrosis y los mecanismos subyacentes
reclutamiento y la activación, proporcionando una nueva estrategia para la
siguen sin estar claros. En este estudio, nos centramos genéticamente señalización
intervención de esta enfermedad.
de Notch mediante la interrupción de la unión señal de recombinación factor de
transcripción proteína-J κ ( RBP-J), para revelar su papel en la regulación de los
macrófagos durante la obstrucción ureteral unilateral (OUU) inducida por renal
PALABRAS CLAVE renal fi fibrosis, la señalización Notch, los macrófagos,
murino fi fibrosis. Mieloide especí fi c interrupción de RBP-J atenuada renal fi fibrosis
la heterogeneidad, EMT
con la reducción de la deposición de matriz extracelular y myo fi activación
broblastos, así como la transición epitelial-mesenquimal atenuada, probablemente
debido a la reducción de la expresión de TGF β. Mientras tanto, INTRODUCCIÓN

Renal fi fibrosis es un proceso patológico común en las enfermedades en fase

terminal renal crónica (ERC), incluyendo glomerulonefritis crónica, nefropatía
diabética, y la obstrucción ureteral (Vernon et al., 2010 ). La característica
RBP-J eliminación signi fi macrófagos obstaculizado significativamente en fi filtración y
dominante de la renales fi fibrosis es la deposición excesiva de la matriz extracelular
la activación en fi renal fibrótica, aunque su proliferación apareció inalterada.
(ECM) en el intersticio renal, que se deterioró por en Florida inflamación, mio fi acumulación
Mediante el uso de experimento de limpieza de los macrófagos, se encontró que
broblastos, y atrofia tubular (Cochrane et al., 2005 ). Hasta el momento, ninguna
los macrófagos residentes del riñón hicieron contribución insignificante, pero
especificación fi terapia c se ha establecido para curar renal fi fibrosis, debido al mal
médula ósea (MO) derivada de macrófagos juegan un papel importante en la
de fi mecanismos celulares y moleculares definidas de esta enfermedad.
renales fi brogenesis. Otros análisis mecanicistas mostraron que la emigración Notch
bloqueo reducido de monocitos a partir de BM por abajo de la regulación CCR2 expresión.

Los macrófagos juegan un papel fundamental en renal fi fibrosis (Vernon et al., 2010
; Wang y Harris, 2011 ), Como el agotamiento de los macrófagos mejora las renal
murino fi fibrosis inducida por la obstrucción ureteral unilateral (OUU) (Kitamoto et al., 2009
Yali Jiang y Yuanyuan Wang contribuyeron igualmente a este trabajo. ), Lo que sugiere que los macrófagos podrían servir como una diana terapéutica. Sin
embargo, extensas observaciones han sugerido que algunos macrófagos presentan
material complementario electrónico La versión en línea de este artículo ( https://doi.org/10.1007/s13238-018-0527-6
pro- fi fibrótica, mientras que las actividades
) Contiene material suplementario, que está disponible para los usuarios autorizados.

© El autor (s) 2018 proteína

 ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Yali Jiang et al.

otros juegan un anti- fi papel fibrótica (Kluth et al., 2004 ; Wang et al., 2007 ;
Henderson et al., 2008 ). Esta polémica es una reminiscencia de reciente fi hallazgos
Revelando el heterogeneidad ontogénica y plasticidad funcional de los macrófagos
(Wynn y Vannella, 2016 ). Los macrófagos en los tejidos adultos están constituidos
por macrófagos residentes establecidos durante la embriogénesis, y macrófagos
reclutados desde la médula ósea (BM) monocitos derivados. La mayoría de los
macrófagos residentes persisten en los tejidos de toda la vida y la renovación de
los mismos a través de la auto-renovación. Los monocitos, por otro lado, se
movilizan después de la lesión del tejido en función de la señalización de la
quimiotaxis, y reclutados a la en Florida sitios inflamatorios, donde se diferencian en
macrófagos. Macrófagos en los tejidos se activan y polarizados en diferentes
subpoblaciones en función de locales
Franklin et al., 2014 ; Zhao et al., 2016 ). Recientemente, nuestros datos han demostrado
que la interrupción de RBP-J en los macrófagos aminora hepática fi fibrosis mediante la
atenuación de Florida inflamación a través de cilindromatosis (CYLD) en ratones (He et
al., 2015 ). Sin embargo, debido a las funciones complicadas de Notch en la
diferenciación de macrófagos y la activación, es valiosa para determinar el papel de la
señalización de Notch en los macrófagos durante renal fi brogenesis. En este estudio,
mostramos que mieloide especí fi c Notch señalización signi fi cativamente modular renal fi
brogenesis como en el hígado. Sin embargo, en contraste con hepática fi fibrosis, señal
Notch regula macrófagos con mecanismos diferentes en renal fi fibrosis, a saber, el
reclutamiento de monocitos mediada por CCR2 y la activación de macrófagos local.
Colectivamente, nuestro estudio indica que la orientación de la señal Notch en los
macrófagos puede ser una nueva estrategia terapéutica para el riñón fi fibrosis.

medio inmunológica (Ginhoux y

Guilliams, 2016 ). En respuesta a IFN γ y / o LPS, macrófagos adoptan la activación
M1 y producen TNF α, IL-1 β,
RESULTADOS mieloide especí fi c RBP-J de fi deficiencia renal atenuada
y NO, lo que lleva a una mayor en Florida inflamación, Th1-sesgada respuesta
Proteína y de la célula

inmune y agrava la lesión tisular. Por el contrario, tras el tratamiento con IL-4 / UUOinduced fi fibrosis

IL-13, los macrófagos están polarizados en la activación M2 caracterizado por la

expresión arriba regulada de IL-10, TGF β, Arg1, y YM1. macrófagos M2 exhiben
Nosotros fi rst renal inducida por la OUU establecido fi fibrosis en ratones normales.
anti-en Florida actividades inflamatorias y la respuesta Th2, que promueven la
Masson ' s tinción y hematoxilina y eosina (H & E) tinción mostró que renal fi fibrosis
reparación de tejidos y la remodelación (Vernon et al., 2010 ; Wynn y Vannella, 2016 ).
se indujo 1 semana o 2 semanas después de la OUU (Fig. S1A y S1B). Mientras
en renal
tanto, inmuno Florida fluorescencia tinción indicó que la en fi filtración de macrófagos
aumentó signi fi cativamente en riñón obstruido en comparación con el riñón
fi fibrosis, se ha informado de que los macrófagos M1 ejercen pro- fi papel fibrótica
contralateral (Fig. S1C), consistente con informes anteriores (Kitamoto et al., 2009 ;
mientras que los macrófagos M2 son anti- fi fibrótica (Nishida et al., 2005 ; Wang y
Vernon et al., 2010 ; Wang y Harris, 2011 ). la señalización de Notch está involucrado
Harris, 2011 ). Sin embargo, los macrófagos M2 expresan alto nivel de TGF β, un pro- fi
críticamente en la activación de macrófagos (Wang et al., 2010 ; Zhang et al., 2010 ;
citoquinas fibrótica que promueve la deposición de ECM y la transición
Xu et al., 2012 ; He et al., 2015 ; Zhao et al., 2016 ). Para determinar el papel de la
epitelial-tomesenchymal (EMT), que conduce a renal fi brogenesis (Miyajima et al., 2000
señalización de Notch en los macrófagos durante renal fi fibrosis, RBPJ- Florida oxed ratones
). Revelando el papel de estas diferentes poblaciones de macrófagos en renal fi fibrosis
se cruzaron con Lyz2-Cre ratones transgénicos para obtener macrófagos especí fi do
es un requisito previo de la terapia de macrófagos-dirigidos.
RBP-J knockear ( Lyz2-Cre / RBP-J f / f, RBP-J CKO) y control ( Lyz2-Cre / RBP-J + / F, Ctrl
ratones) de acuerdo con nuestro estudio anterior (He et al., 2015 ). Cuantitativa (q)
PCR utilizando ADN genómico a partir de macrófagos renales según mostraron
Un número de vías de señalización regular macrófagos reclutamiento, la
que la ef fi ciencia de RBP-J deleción era casi completa en la RBP-J ratones cko
activación y la proliferación. La señalización CCL2-CCR2 es esencial para la
(Fig. S2A y S2B). desarrollo mieloide no se alteró al parecer en el
emigración de los monocitos de BM en la corriente sanguínea (Kitagawa et al., 2004 ;
Seki et al.,
2009 ). M-CSF / c-fms y vías / CSF2R GM-CSF apoyan la proliferación de los
macrófagos residentes en respuesta a microambiente alterado (Le Meur et al., 2002 ;
Hashimoto et al., 2013 ). Además, varias vías de células intrínseca, tales como p38 /
MAPK, c-Jun / JNK-, y la señalización mediada por ERK, se han implicado en los
RBP-J ratones cko (datos no mostrados) (He et al., 2015 ). Renal fi fibrosis fue
macrófagos reclutamiento y la activación (Han et al., 2008 ; Ma et al., 2009 ). La vía
inducida por la OUU en el RBP-J ratones cko y control. Masson ' s tinción y tinción
de Notch constituye la señalización célula-célula mediada por contacto
Sirius Red en el día 14 después de la operación indicó que renal fi fibrosis se redujo
(ArtavanisTsakonas et al., 1999 ). la activación de Notch se inicia por γ-
notablemente en el RBP-J ratones cko: el área de colágeno intersticial en el fi renal
fibrótica de la RBP-J ratones cko era aproximadamente la mitad de la del control
(Fig. 1 A y 1 SEGUNDO). En consonancia, la expresión de α- actina de músculo liso ( α-
escisiones secretasa dependiente de receptores Notch, liberando el dominio
SMA), un marcador de myo fi fibroblastos (Lin et al., 2009 ), Disminución notable en
intracelular Notch (NIC) que se transloca en núcleos para asociar con la señal de
el fi renal fibrótica de RBP-J ratones cko como se determina mediante la tinción de
recombinación de unión proteína-J κ ( RBP-J). Este evento conduce a la
immunohischemistry (Fig. 1 Un panel inferior y 1C). A continuación, examinó el nivel
transactivación de genes aguas abajo que son responsables de la proliferación y la
de mRNA de
diferenciación celular (Chen y Al-Awqati, 2005 ; Hu y Phan,

2016 ). la señalización de Notch está involucrado críticamente en la diferenciación de

α- SMA y colágeno I usando qRT-PCR, y se encontró que la expresión de ambas
macrófagos y la activación en diferentes modelos de enfermedad (Wang et al., 2010 ;
moléculas era signi fi cativamente reducida en
Zhang et al., 2010 ; Xu et al., 2012 ;

© El autor (s) 2018

la señalización de Notch mieloide aumenta renal fi fibrosis ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

UN Ctrl RBP-J cko 80

segundo do 60

**
60 **

a-SMA + área (%)

área de colágeno (%)
40
**
40 20
Masson

20

0 0
50 micras cko
Ctrl cko Ctrl

re □ Ctrl
■ cko
a-SMA ColIα1
6 30
* *

nivel de mRNA relativa

rojo Sirio

4 20

2 10
50 micras

0 0

Contra Obstr Contra Obstr

Proteína y de la célula
a-SMA

50micras
50 micras

Figura 1. mieloide especí fi c RBP-J de fi ciencia atenuada renal inducida por la OUU fi fibrosis. ( A) La RBP-J ratones cko y de control se sometieron a la OUU. Masson y Sirius tinción con

rojo, y anti- α- SMA tinción inmunohistoquímica de secciones de riñón se realizaron 2 semanas después de la operación. (B) Las áreas de colágeno-positivas en (a) se cuanti fi Ed y

comparación. (C) La α- áreas SMA-positivas en (A) fueron cuanti fi DE en el RBP-J cko y los ratones de control y comparación. (D) Los riñones de la RBP-J ratones cko y de control se

analizaron para la expresión de mRNA relativa de α- SMA y coli α 1 2 semanas después de la OUU usando RT-PCR. Bares = media ± SD, n = 6. *,

P < 0,05, **, P < 0.01.

el fi renal fibrótica de RBP-J ratones cko en comparación con el control (Fig. 1 RE).
Estos resultados indicaron que myeloidspeci fi c interrupción de RBP-J resultado en
renal atenuada
fi fibrosis en ratones.
inhibe la expresión de pro fi factores brogenic y EMT reducida en el riñón
de RBP-J ratones cko después de la OUU
marcadores vimentina y N-cadherina fue menor en el fi renal fibrótica de la RBP-J ratones
cko en comparación con la del control (Fig. 2 C y 2 RE). La expresión de Snail, un
EMT factor de transcripción de conducción, también fue menor en el fi renal fibrótica
de la RBP-J ratones cko (Fig. 2 DO). Por lo tanto, myeloidspeci fi c supresión de RBP-J
renal mejorado fi Brosis a través de, al menos en parte, el TGF-atenuada β expresión
y EMT en el riñón.

A fin de verificar si RBP-J de fi deficiencia en Florida uida la capacidad de los

TGF β es una de las principales citoquinas que promueven renal fi brogenesis través
de EMT (Zavadil y Böttinger, 2005 ; Böttinger
2007 ; Kalluri y Weinberg, 2009 ). Por lo tanto, hemos examinado TGF β expresión en
el riñón de la RBP-J ratones cko y de control sometidas a OUU usando qRT-PCR y
ELISA. Los resultados mostraron que el TGF β fue significativamente las reguladas
en el fi renal fibrótica de la RBP-J ratones cko en comparación con el control (Fig. 2 A
y 2 SEGUNDO). A continuación, se evaluó la EMT en el fi riñones fibrótica de la RBP-J
cko y ratones de control mediante la determinación de la expresión de los
marcadores relacionados con EMT-utilizando qRT-PCR e inmunotransferencia de
tipo Western. El resultado mostró que, en comparación con el control, el marcador
epitelial E-cadherina fue mayor, mientras que el mesenquimales
macrófagos para inducir la EMT, cultivamos células primarias proximales tubulares
epiteliales (PTEpiC) de ratones de tipo salvaje con el medio condicionado (CM)
recogidos a partir de macrófagos renales cultivadas que fueron ordenados desde fi renal
fibrótica de la RBP-J ratones cko o de control durante 24 h. El fenotipo y la pureza de
los macrófagos renales según se muestran en la Figura complementario 3 A. La
morfología de las células de los túbulos cultivadas con la CM de control se convirtió
en fusiforme, similar a activado fi fibroblastos, mientras que las células de los túbulos
cultivadas con el RBP-J cko macrófagos derivados de CM mantuvo apariencia
cobblestonelike de células de los túbulos normales (Fig. S3B). Después de recoger
co-cultivadas PTEpiC, la expresión de mRNA de EMTand fi marcadores relacionados
Brosis-se examinó usando qRT-PCR.

© El autor (s) 2018

 ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Yali Jiang et al.

UN segundo re Contra Obstr

TGF-β
15 3
Ctrl cko Ctrl cko

□ Ctrl

Serum TGF-β (×
E-cadherina
mRNA relativa

10
■ cko

10 3 pg / ml)
*
nivel de

N-cadherina
5 1

Ctrl 0 2 *
Vimentina
0
Contra Obstr cko

-actina

do

1.5 E-cadherina vimentina E-cadherina N-cadherina

5 2.5 2.5

2.0 2.0
1.0
3
4 1.5 1.5
** **
* 1.0 * 1.0
0.5 2
0.5 0.5

nivel de mRNA relativa nivel de

1

0.0 0.0
0.0 0
Obstr Contra Obstr
Contra Obstr Contra Obstr
Proteína y de la célula

proteína relativa

vimentina □ Ctrl
2.5 Caracol
2.0 Contra
□ Ctrl ■ cko
2.0 1.5
■ cko
1.5 * 1.0

1.0 ***
0.5
0.5
0.0
0.0 Contra Obstr
Contra Obstr

mi F
□ Ctrl
2.0 600
1.5 1.5 ■ cko

*
1.5

sobrenadante cultivado
nivel de ARNm relativa

TGF-β (pg / ml) el

1.0 1.0
400
1.0
*
*
200 *
0.5 * 0.5
0.5 **

0
0.0 0.0 0.0
Ctrl cko
E-cadherina vimentina Caracol a-SMA Coll I TGF-β

Figura 2. Disminución de la expresión de TGF β y EMT en el riñón de mieloide especí fi c RBP-J de fi ratones ciente después de la OUU.

(A) expresión de ARNm relativa de TGF β en el riñón de la RBP-J cko y control de ratones se determinó 2 semanas después de la OUU usando RT-PCR ( n = 6). (B) El nivel de TGF β en el

suero de la RBP-J cko y control de ratones se determinó con ELISA ( n = 6). (C) la expresión de ARNm relativa de los marcadores relacionados con la EMT en el riñón se determinó por

RT-PCR ( n = 6). (D) El nivel de proteína de los marcadores relacionados con la EMT en los extractos renales se detectó mediante transferencia de Western, y cuantitativamente en

comparación entre los grupos ( n = 6). (E) Primary proximal se aislaron células epiteliales tubulares de ratones normales, y se cultivaron durante 24 h en presencia del medio condicionado

(CM) a partir de macrófagos de riñón de la RBP-J ratones cko o de control que sufren de la OUU durante 2 semanas. Y a continuación, se recogieron las células epiteliales tubulares

co-cultivadas para la detección de la expresión de ARNm de EMT-y fi marcadores relacionados Brosis-utilizando QRT-PCR ( n = 3). (F) el nivel de proteína de TGF β se detectó en medio

condicionado de macrófagos renales cultivadas de fi renal fibrótica de RBP-J cko y los ratones de control por ELISA ( n = 3). Bares = media ± SD. *, P < 0,05, **, P < 0,01, ***, P < 0,001.

El resultado mostró que el nivel de mRNA de E-cadherina CM (Fig. 2 MI). Mientras tanto, la expresión de TGF β en sobrenadante cultivado de RBP-J
aumentado, mientras que la de Vimentina, Caracol, α- SMA, colágeno I macrófagos cko se redujo signi fi cativamente en comparación con el control (Fig. 2 F).
y TGF β disminuido en PTEpiC cultivaron con el RBP-J Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que RBP-
cko macrófagos derivados de CM en comparación con el control

© El autor (s) 2018

la señalización de Notch mieloide aumenta renal fi fibrosis ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

UN re
10 8
15 ILLINOIS- 6
20
Ctrl RBP-J cko
8 6 □ Ctrl

TNF-α (pg / ml)

mRNA relativa

4 10 ■ cko *B

Contra
* T Obstr NF-α **
nivel de

64 15
10
lo Obstr L-1 β
5
2 5
2
*
0 0 0 0
Contra Contra Obstr Contra Ctrl cko

Obstr
do C ArtNo O rtsb 50 micras

Ctrl cko Ctrl cko □ Ctrl

células CD11b +
40
10 10 ■ cko
4

47.1 10
44.9 4
65.2 10
54.3 50 □ Ctrl
*
4 4

F4 / 80 + células / campo
30

(× 10 5 / gramo)
10 10 ■ cko
CD11b

10 10
Obstr 50
3 3 3 3

10 20
*
2 10 2 10 2 10 2
40
30
10
0
Contra 20
10 0 200 400 600 800 1K 10
0 1 10 0 200 400 600 800 1K 10
0 1 10 0 200 400 600 800 1K 10
0 1 10 0 200 400 600 800 1K 10
0 1
10

FSC □ Ctrl 0

CD11b + F4 / 80 + células
10 10 10 10
■ cko Contra Obstr
*
4 4 4 4

10 10 10 10

(× 10 5 / gramo)
3 3 3
CD11b

38.7 35.6 42.4 31.7

10 2 10 2 10 2 10 2
10

Proteína y de la célula
10 1 10 1 10 1 10 1
Obstr 0 20 30

10 100 0
Contra
10 1 10 2 10 3 10 10 10
4 0 0 10 1 10 2 10 3 10 10 104 0 0 10 1 10 2 10 3 10 10 10
4 0 0 10 1 10 2 10 3 10 4

F4 / 80

mi 1.0 □ Ctrl F 1.0 □ Ctrl

■ cko ■ cko
nivel de mRNA

*
relativa nivel de

*
mRNA relativa

*
0.5 0.5
**
** **

0.0 0.0
TNF-a iNOS IL-1β YM1 IL-10 TGF-β1 ARG

Figura 3. Mejoría en Florida inflamación y macrófagos en fi filtración y la activación en fi renal fibrótica de mieloide especí fi c RBP-J de fi ratones ciente después de la OUU. ( UN) RBP-J ratones

cko y de control se sometieron a la OUU. La expresión de mRNA IL-1 β, TNF α y IL-6

en el riñón se determinó 2 semanas después de la OUU mediante qRT-PCR. (B) El nivel de proteína de TNF α se detectó por ELISA en el suero de

RBP-J ratones cko y de control en (a). (C) Las suspensiones de células individuales se prepararon a partir de riñón obstruido y contralateral de RBP-J

cko y los ratones de control, respectivamente, y después se realizó el análisis FACS. CD11b + células (células mieloides) y CD11b + F4 / 80 + células (macrófagos) se compararon

cuantitativamente. (D) Secciones de riñón en (a) se tiñeron con anti-F4 / 80 anticuerpo utilizando inmuno Florida tinción de fluorescencia, y la F4 / 80 + macrófagos se contaron y

compararon. suspensiones de células individuales (E y F) se prepararon a partir de los riñones 2 semanas después de la OUU, y macrófagos (CD11b + F4 / 80 +) fueron ordenados y

después se cultivaron in vitro durante 24 h. La expresión de ARNm de M1 (E) y marcadores de activación de macrófagos M2 (F) se determinó usando qRT-PCR. Bares = media ± SD, n = 6.

*,

P < 0,05, **, P < 0.01.

J de fi macrófagos cientes mostraron una capacidad reducida de inducir EMT de las et al., 2009 ). El número total de en fi granulocitos infiltrado (CD11b + Ly6G Hola) en el fi renal
células epiteliales tubulares. fibrótica de la RBP-J ratones cko era comparable con la del control (Fig. S4B). Por
otra parte, hemos detectado la significación fi cativamente reduce CD11b + células
mieloides y CD11b + F4 / 80 + macrófagos en el fi renal fibrótica de la RBP-J ratones
La disminución de los macrófagos en fi filtración y la activación en el
cko que en el control (fig. 3 DO). inmuno Florida tinción de fluorescencia con anti-F4 /
riñón de RBP-J ratones cko sobre OUU
80 también mostró que F4 / 80 + macrófagos disminuyeron obviamente en el fi renal
Tinción H & E mostró una reducción en fi filtración de en Florida células inflamatorias en fibrótica de la RBP-J ratones cko (Fig. 3 RE). Estos datos sugirieron que atenúan en Florida
las regiones intersticiales del fi renal fibrótica de la la respuesta inflamatoria en el fi renal fibrótica de RBP-J ratones cko probable el
RBP-J ratones cko después de la OUU, sugiriendo una comprometidas en Florida inflamación resultado de la reducción en Florida macrófagos inflamatorios en fi filtración.
(Fig. S4A). Consistentemente, en el nivel de Florida citoquinas inflamatorias, incluyendo
TNF α, IL-1 β, e IL-6 disminuyó signi fi cativamente en el fi renal fibrótica de RBP-J ratones
cko en comparación con el control (Fig. 3 A y 3 SEGUNDO). A continuación se
analizaron las poblaciones mieloides en el fi renal fibrótica de la RBP-J cko y los ratones Para evaluar adicionalmente el papel de la señalización de Notch en la regulación de
de control usando FACS (Lin los macrófagos en renal fi fibrosis, CD11b + F4 / 80 + macrófagos fueron ordenados
desde el fi renal fibrótica de la RBP-J

© El autor (s) 2018

 ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Yali Jiang et al.

cko y los ratones de control, y la expresión de marcadores de activación de no afectó a la proliferación de macrófagos local en renal inducida por la OUU fi fibrosis.
macrófagos se determinó usando qRT-PCR. Los resultados mostraron que la
expresión tanto de los marcadores M1
iNOS, TNF α, IL-1 β, y los marcadores M2 YM1, IL-10 y
renal señalización Notch regulado fi Brosis principalmente a través de los
TGF β se redujo obviamente en los macrófagos de riñón de la RBP-J ratones cko
macrófagos monocitos-derivados
durante renal fi fibrosis (Fig. 3 e y 3 F), lo que indica que la activación de los
macrófagos se atenuó en el macrófagos tisulares, se han implicado en la lesión y reparación de tejidos
fi renal fibrótica de macrófagos especí fi c RBP-J de fi ratones cientes. Mientras tanto, (Yamasaki et al., 2014 ; Zigmond et al.,
la reducción de TGF β expresión en RBP-J de fi- 2014 ; Stamatiades et al., 2016 ). Con el fin de abordar el papel de los diferentes
macrófagos cientes pueden responsables de la EMT disminuido en orígenes de los macrófagos renales, la RBP-J cko y ratones de control fueron
fi renal fibrótica de RBP-J ratones cko como se muestra en la Fig. 2 . inyectados con clodronato encapsulado en liposomas para agotar los macrófagos
residentes de riñón embrionarias derivadas antes de la OUU acuerdo con el protocolo
publicado (Kitamoto et al., 2009 ), Y después los ratones se sometieron a la OUU
Macrófagos específica fi do RBP-J cko no afectó a la proliferación
durante 7 días. Los análisis de FACS mostró que el CD11b + F4 / 80 + CX3CR1 + macrófagos
de macrófagos
residentes estaban casi completamente agotadas por clodronato-liposomas (CLS)
En el lugar proliferación estimulada por citocinas locales, tales como CSF-1 o IL-4 tratamiento (Fig. 5 UN). Por el contrario, aunque también se vieron afectados los
juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de los CD11b + F4 / 80 macrófagos derivados de monocitos + CCR2 +, esta población era
macrófagos en los tejidos (Le Meur et al., 2002 ; Hashimoto et al., 2013 ). A todavía menos en RBP-J ratones cko que en los ratones de control con independencia
Proteína y de la célula

continuación pregunta si la señalización de Notch podría en Florida renal influencia fi brogenesis

del agotamiento del tejido macrófagos residentes (Fig. 5 SEGUNDO). Mientras tanto,
mediante la regulación de la proliferación de macrófagos en el riñón. los RBP-J cko durante el tratamiento CLS, la in fi infiltrado en Florida células inflamatorias y el grado de
y ratones de control fueron inyectados con BrdU y se sometieron a la OUU. análisis renal fi fibrosis en RBP-J ratones cko y ratones de control no alteraron obviamente en
FACS mostró que mientras que el porcentaje de macrófagos en proliferación era comparación con aquellos después del tratamiento de liposomas (PLS), como se
signi fi cativamente mayor en el fi renal fibrótica en comparación con el riñón muestra por tinción H & E (Fig. 5 C dejó panel y 5 D) y Masson ' s tinción (Fig. 5 panel
contralateral, el número absoluto de BrdU + F4 / 80 + macrófagos en el fi riñones derecho C y 5 MI). Estos resultados indican que la señalización Notch regulado renal fi fibrosis
fibrótica de RBP-J ratones cko era comparable con la del control (Fig. 4 A y 4 SEGUNDO).
Esto sugiere que la señalización Notch

UN segundo
C ArtNo O rtsb

Ctrl cko Ctrl cko 8

□ Ctrl
10 4
10 4 10 4 10 4

■ cko ns
10
F4 / 80 + células BrdU + (× 10 5 / gramo)

10 10 10
6
3 3 3
3
SSC

10 10 10 10
1.75 30.6
2

1.58 37.2
2 2 2

10 1
10 1 10 1 10 1
4

10 0
10 0 10 0 10 0

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

F4 / 80 2

10 4 10 4
10 4 10 4
0
Contra Obstr
10 3 10 3
10 3 10 3
SSC

10 2 10 2
10 2 10 2

12.4 12.6
10 10 10 10
38.2
1 1

42.7
1 1

10 0 10 0
10 0 10 0

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

BrdU

Figura 4. No signi fi diferencia no puede de la proliferación de macrófagos en el riñón entre RBP-J ratones cko y de control después de la OUU.

(UN) RBP-J ratones cko y de control se sometieron a la OUU y se inyectaron ip con BrdU. Los macrófagos proliferantes marcadas con BrdU fueron determinados por FACS 7 días después

de la OUU. (B) F4 / 80 + BrdU + células en (A) se compararon cuantitativamente. Bares = media ± SD, n = 3. ns, no signi fi hipocresía.

© El autor (s) 2018

 ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

ns
UN re □ Ctrl
Obstr / PL Obstr / CL *** ns ■ cko
ns □ Ctrl 200
Ctrl cko Ctrl cko 8 * *
■ cko
F4 / 80 (CD11b +)

10 10 10 10
**

CD11b + F4 / 80 + CX3CR1 +
4 4 4 4

61.0 50.0 18.8 15.2 150

Las células inflamatorias

células (× 10 6 / gramo)
10 3 10 3 10 3 10 3

10 10 10 10
2 2 2 2
ns
10 1 10 1 10 1 10 1
100
signi fi hipocresía. la señalización de Notch mieloide aumenta renal fi fibrosis 50
10 0 10 0 10 0 10 0 PLs 2 4 6
10 10 10 10 10
0 1 2 3 4 10 10 10 10 10
0 1 2 3 4 10 10 10 10 10
0 1 2 3 4 10 10 10 10 10
0 1 2 3 4
0

CX3CR1 CLs 0
PL CLs
segundo cko □ Ctrl □ Ctrl
LP / rtsb
O s LC / rtsb
O s mi ns
ns ■ ns ■ cko
Ctrl cko Ctrl cko * ns= 3. *, P < 0,05, ns, no
F4 / 80 (CD11b +)

de 10
tinción H & E en (C). (E) 10
Las áreas de colágeno-positivas eran cuanti fi ed 10 50
y se compararon mediante Masson6 ' secciones s de tinción en (C). Bares = media ± SD, n

CD11b + F4 / 80 + CCR2 +
10

células (× 10 6 / gramo)
*
4 4 4 4

43.7 30.0 25.4 16.6 *

10 10 10 10
*

área de colágeno (%)

3 3 3 3

4
10 2 10 2 10 2 10 2
30
40
10 1 10 1 10 1 10 1 5
1
10 0 10 10 0 10 0 20
0

izquierdo)
10 10 y10Masson
10 10 ' s tinción (panel
0 10 10 10derecho)
1 2 10 10
3 4 se realizó
10 utilizando
10 10 10 10 secciones de10
0 1riñón.
10 10 (D)
2 El en fi ltrating en Florida
10 10 3 4 0 células inflamatorias se contaron y se10
0 1 2 3 4 compararon mediante secciones
0 1 2 3 4

CCR2 PLs 3 CL
0

Proteína y de la célula
&E Masson PL CLs
do
Ctrl cko H Ctrl cko

número de CD11b + F4 / 80 + CX3CR1 + macrófagos residentes (A) y CD11b + F4 / 80 + CCR2 + macrófagos derivados-BM (B) se cuanti fi Ed y comparación. (C) tinción H & E (panel
PL

clodronato encapsulado en liposomas (CLS) o liposomas de control (PLS) tres veces antes de la OUU. macrófagos de riñón se analizaron por FACS 7 días después de la OUU, y el
CL

50 micras 50 micras

Figura 5. RBP-J cko atenuada renal inducida por la OUU fi Brosis independiente sobre los macrófagos residentes del riñón. RBP-J cko y ratones de control fueron inyectados IV con

probablemente a través de los macrófagos monocitos-derivados en lugar de los monocitos aumentaron en el BM pero disminuyeron en el bazo de la RBP-J ratones
macrófagos residentes riñón. cko durante renal fi fibrosis (Fig. 6 segundo - MI). Por otra parte, el nivel de mRNA de CCL2
en el fi renal fibrótica de
RBP-J ratones cko también se redujo signi fi cativamente, lo que podría contribuir
Mieloide especí fi c RBP-J de fi ciencia llevó al reclutamiento reducido de
aún más a la reducción del reclutamiento de monocitos CCR2 + en el fi renal
CCR2 + monocitos de BM después de la OUU
fibrótica en el RBP-J ratones cko (Fig. 6 F). Estos resultados sugieren que el
Debido a RBP-J de fi deficiencia resultó en una reducción en Florida macrófago reclutamiento de en Florida monocitos inflamatorios de BM, que está mediada por la
inflamatorio en fi filtración en fi renal fibrótica, el próximo investigó la expresión de quimiotaxis CCL2-CCR2, fue dañado en el RBP-J ratones cko sometidos renal
CCR2, un receptor de quimiocinas críticos implicados en la migración de monocitos inducida por la OUU fi fibrosis, probablemente conducen a una reducción en fi filtración
(Kitagawa et al., 2004 ; Seki et al., 2009 ), En macrófagos de riñón de la RBP-J cko y de en Florida macrófagos inflamatorios.
ratones de control por FACS. Tanto el número de CD11b + F4 / 80 + CCR2 + macrófagos
y la media Florida fluorescencia intensidad (MFI) de CCR2 + macrófagos Para verificar además que los macrófagos de señalización Notch regulado en fi filtración
disminuyeron signi fi cativamente en el fi riñones fibrótica de la RBP-J ratones cko a través CCL2-CCR2 quimiotaxis, se cocultivaron RBP-J de fi cientes o de control de
(Fig. 6 UN). análisis FACS indicó también que el número de CD11b + CCR2 + macrófagos con células HEK293 que sobreexpresan CCL2 utilizando un sistema
transwell. El resultado mostró que signi fi cativamente menos RBP-J

© El autor (s) 2018

 ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Yali Jiang et al.

UN
Contra Obstr 150
□ Ctrl 25
□ Ctrl

CD11b + F4 / 80 +
Ctrl ■ cko
■ cko

células (× 10 5 / gramo)
CD11b + F4 / 80 + CCR2 +
cko 100
De Max (%)

* 15
20

CCR2 IMF
*
50 10
5
0

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
0 0
CCR2 Contra Obstr Contra Obstr

segundo
Ctrl RBP-J cko do F 25
10 □ Ctrl
10 10
55.3 50.2 * ■ cko
4

Ctrl
4

*
Max CD11b (BM)

CCL2 relativa nivel

cko

de ARNm% de
10 10

CD11b + CCR2 +
3

15
20
3

células (× 10 5)
10 2 10 2

4
10
5
68
10 0 200 400 600 800 1K 10
0 1 10 0 200 400 600 800 1K 10
0 1 0 0
10 10 10 10 10
Contra Obstr
0 1 2 3 4

FSC CCR2 Ctrl 2 cko 0

Proteína y de la célula

re mi
Ctrl RBP-J cko 30
10 10 4

10.9
4

5.88 Ctrl
10 cko
CD11b (Spl)

10 3

CD11b + CCR2 + *
3

células (× 10 5)
% De Max

10 2
10 2 20

10

10 0 200 400 600 800 1K 10

0 1
10 0 200 400 600 800 1K 10
0 1 0

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 0
FSC CCR2 Ctrl cko

GRAMO
Ctrl RBP-J cko
250
Los recuentos de células

□ Ctrl
■ cko
150 **
200
100

50

0
5 0 μ metro
CCL2 Vector

H
Ctrl NIC California
Los recuentos de células

400
□ Ctrl
*** ■ NIC California
■
300

200

100

5 0 μ metro 0
CCL2 Vector

Delaware fi macrófagos emigraron hacia cientes CCL2- expresando células en en fi filtración en fi renal fibrótica más probable a través de los quimiotaxis
comparación con el control (Fig. 6 GRAMO). Por el contrario, cuando los macrófagos CCL2CCR2.
derivados de mieloide especí fi do NIC A pesar de la IMF de CCR2 + macrófagos se redujo signi fi cativamente en el fi renal
ratones transgénicos (Zhao et al., 2016 ) ( NIC California, ver a continuación) fueron fibrótica de la RBP-J ratones cko (Fig. 6 A), el nivel de mRNA de CCR2 disminuido
co-cultivadas con el CCL2- expresando células HEK293 utilizando transwell ligeramente en los macrófagos RBP-J cko (Fig. S4C), lo que sugiere que la
sistema, se encontró que más macrófagos con la señalización de Notch activado señalización de Notch podría regular CCR2 expresión en el nivel de transcripción o
migraron hacia CCL2- expresando células en comparación con el control (Fig. 6 H). post-transcripción. Por lo tanto, hemos aislado los monocitos de la BM de la NIC California
Estos datos sugirieron que los macrófagos de señalización Notch regulado ratones, y se realizó una cromatina

© El autor (s) 2018

 mieloide aumenta renal fi fibrosis
segundo Figura 6. mieloide RBP-J de fi ciencia condujo a la reducción de reclutamiento
ción de CCR2 + monocitos de BM después de la OUU a través de la quimiotaxis de
CCR2-CCL2. ( UN) RBP-J ratones cko y de control se sometieron a la OUU. La expresión
de CCR2 en CD11b + F4 / 80 + macrófagos de riñones obstruidos y contralateral se
determinó mediante FACS (panel derecho). El significado Florida intensidad de
fluorescencia (MFI) de CCR2 expresión (panel central) y el número de CCR2 + en Florida macrófagos
y el CD11b + células mieloides también aumentaron signi fi cativamente (Fig. S7A).
derivados de monocitos inflamatorios se compararon cuantitativamente (panel izquierdo)
( n = 6). (B y
C) BM de la RBP-J ratones cko y de control se recogieron 2 semanas después de la
OUU, y el CD11b + monocitos se analizaron mediante el uso de FACS para la expresión
de CCR2 ( SEGUNDO). El número de CCR2 + en Florida monocitos inflamatorios se
comparó cuantitativamente (C) ( n = 6). Esplenocitos (D y E) se obtuvieron de la RBP-J cko
y control ratones 2 semanas después de la OUU, y el CD11b + monocitos fueron
analizadas por FACS para la expresión de CCR2 ( RE). El número de CCR2 + en Florida monocitos
inflamatorios se comparó cuantitativamente (E) ( n = 6). (F) El nivel de mRNA de CCL2 se
determinó mediante qRT-PCR en el
fi renal fibrótica de la RBP-J ratones cko y de control después de la OUU ( n = 6). (G) de la
BMDMs RBP-J ratones cko o de control se sembraron en la cámara superior de 24
pocillos transwell cámaras. Las cámaras inferiores se pre-chapado de 24 h con células
HEK293 transfectadas con CCL2- expresando o el plásmido control. La migración celular
se dejó durante 3,5 horas a 37 ° C, y las células migradas se comparó cuantitativamente
( n = 3). (H) BMDMs de la mieloide especí fi do NIC ratones transgénicos o de control se
ensayaron para determinar la quimiotaxis de CCL2 como en (G) ( n = 3). Bares = media ±
SD. *, P <
0,05, **, P < 0,01, ***, P < 0,001. la señalización de Notch
inmunoprecipitación (ChIP) de ensayo con anti-ARN polimerasa (Pol) II o
anticuerpo anti-NIC. El resultado mostró que la unión de la ARN Pol II de la CCR2 promotor
pretende aumentar ligeramente en monocitos Notch activada, pero la ocupación de NIC
sobre el CCR2 promotor no apareció cambió, lo que sugiere que la señalización de
Notch podría activar la transcripción de CCR2 en los macrófagos indirectamente
(Fig. S5) o regular la expresión de CCR2 en el nivel post-transcripción que es
necesario explorar más lejos.
Mieloide especí fi c Notch activación agravado UUOinduced renal fi fibrosis
Hasta ahora, nuestros datos indican que la alteración de la señalización de Notch en los
macrófagos mejorado renal inducida por la OUU fi fibrosis mediante la reducción de los
macrófagos en fi filtración y la activación. a continuación, nos dispusimos a estafar fi rm el
efecto de la señalización de Notch en los macrófagos en renal fi fibrosis utilizando la
mieloide especí fi do NIC ratones transgénicos (Zhao et al., 2016 ) (Fig. S6). los Lyz2-Cre /
STOP Florida buey- NIC (NIC California) y ratones de control ( Lyz2-Cre) Los ratones fueron sometidos
a la OUU. Masson ' s tinción y coloración rojo sirio y tinción H & E mostró que la activación
de la señalización de Notch en los macrófagos renal agravada fi fibrosis después de la
deposición de colágeno, así como acompañado por un aumento en Florida células
inflamatorias en fi filtración en el intersticio del riñón (Fig. 7 UN, 7 segundo
© El autor (s) 2018
ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
y 7 RE). Consistentemente, más α- + Mio SMA fi fibroblastos ocurrieron en Notch
activado macrófagos ratones durante renal
fi brogenesis (Fig. 7 Un panel inferior y 7 DO). Mientras tanto, el análisis FACS
demostró que el en fi filtración de los macrófagos + CD11b + F4 / 80 en el fi riñones
fibrótica de NIC California ratones aumentó en comparación con el control (Fig. 7 e y 7 F),
El número de CD11b + 80 + macrófagos F4 / CCR2 +, CCR2 MFI en los
macrófagos y el nivel de CCL2 todo aumento en el fi renal fibrótica de NIC California ratones,
en comparación con el control (Figs. 7 GRAMO, 7 H, S7B y S7C). Estos resultados
sugieren que, contrariamente a la mieloide especí fi do RBP-J cko ratones, mieloide
especí fi c Notch activación agravado UUOinduced renal fi fibrosis mediante la
promoción de CCR2 + macrófagos contratación.
DISCUSIÓN
Proteína y de la célula
Renal fi fibrosis se caracteriza por deposición excesiva de ECM, que se produce
principalmente por myo fi fibroblastos. A pesar de múltiples orígenes de myo fi fibroblastos
según lo revelado por estudios recientes (Lebleu et al., 2013 ; Falke et al., 2015 ), Los
papeles críticos de los macrófagos en la formación y activación de myo fi fibroblastos
en renal fi brogenesis sido apreciado por consenso (Vernon et al., 2010 ;
Nikolic-Paterson et al.,
2014 ). Recientemente, los macrófagos BM derivados se encuentran a someterse a
la transición a la α- SMA-positivas productoras de colágeno células, myo a saber
activado fi fibroblastos, durante tejido
fi fibrosis, (Wang et al., 2016 ; Meng et al., 2016 ). En nuestro estudio, la expresión de α-
colágeno SMA o I disminuyó notablemente en la fi renal fibrótica de RBP-J ratones
cko tal como se determina mediante la tinción de inmunohistoquímica o qRT-PCR
(Fig. 1 ). Dado que la señalización Notch regula directamente α- SMA y colágeno I
la transcripción (Tang et al., 2008 ; Hu et al., 2014 ), No podríamos excluir
formalmente que RBP-J de fi deficiencia en los macrófagos puede resultar
directamente en la producción disminuida de α- SMA y colágeno I derivada de
macrófagos en fi renal fibrótica. Esta posibilidad está actualmente bajo investigación
en nuestro laboratorio.
Los macrófagos se activan y modulados por restos de células y moléculas que
llevan los patrones moleculares de daño-asociado (amortigua) liberados por las
células dañadas, y por las citoquinas presentes en el especí fi c
inmuno-microambiente durante CKD (Williams et al., 2010 ). Diferencialmente
macrófagos activados ejercen diferentes, incluso contradictorias en Florida influencias
sobre renal
fi brogenesis a través de secretar un amplio espectro de citoquinas, factores de
crecimiento, quimiocinas, y otra en Florida factores inflamatorios (Ginhoux y Guilliams,
2016 ; Wynn y Vannella, 2016 ). la señalización de Notch está involucrado críticamente
en la activación de macrófagos (Monsalve et al., 2009 ; Wang et al., 2010 ; Zhang et al.,
2010 ; Xu et al., 2012 ; Zhao et al., 2016 ). Recientemente hemos demostrado que la
interrupción de la señalización de Notch por myeloidspeci fi do RBP-J hígado
atenuada knockout fi fibrosis por comprometer la activación de los macrófagos a
través de la CYLD-NF κ vía B (He et al., 2015 ). En este estudio, hemos extendido
estos
fi hallazgos a renal inducida por la OUU fi fibrosis, y encontrado que el bloqueo de la
señalización de Notch por mieloide especí fi do RBP-J
 ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Yali Jiang et al.

Obstr
UN 50
segundo do 80 □ Ctrl
Ctrl NIC California *
■
■ NIC California

60
*

área de colágeno (%)

30
40

a-SMA + área (%)

Masson

40

20
20
10

□ Ctrl
0 0
Ctrl NIC California 200 ■ NIC California
■
Ctrl NIC California
rojo Sirio

Obstr *
μ m 5 0 μ metro
150
Ctrl NIC California

Las células inflamatorias

re

100
a-SMA

ÉL
50
50μm50
5 0 μ metro
0
Ctrl NIC California
Proteína y de la célula

C ArtNo O rtsb
F
Ctrl NIC California Ctrl NIC California
10 4 10 10 10 6
□ Ctrl
4 4 4

células (× 10 6 / gramo)
10 3 10 3 10 3 10 3 ■ NIC California

CD11b + F4 / 80 +
4
4.87 4.51 25.9 37.4
CD11b

10 2 10 2 10 2 10 2

10 1 10 1 10 1 10 1
2

10 0 10 0 10 0 10 0

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 0

F4 / 80 Contra Obstr

GE H
C ArtNo O rtsb
2.5 *
Ctrl NIC California Ctrl NIC California □ Ctrl
20 20 200
2.0
células (× 10 6 / gramo)
CCR2 + F4 / 80 + CD11b +

120
■ NIC California
15
15 90
150
1.5
De Max (%)

1.0
10 10 100
60
5 5
30 50 0.5

0 0
0 0 0.0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Contra Obstr
CCR2

Figura 7. mieloide - especí fi renal activación de c Notch agravado fi fibrosis después de la OUU. Mieloide especí fi do NIC transgénicos ( NIC California) y los ratones de control se sometieron a

la OUU durante 2 semanas. (UN - C) Masson (paneles superiores) y Sirius tinción con rojo (panel medio) y α- tinción SMA (paneles inferiores) en fi se realizó secciones de riñón fibrótica

(A). Las áreas de colágeno-positiva (B) y α- áreas SMA + (C) se contaron y se compararon. tinción de secciones de riñón (D) H & E se llevaron a cabo 2 semanas después de la OUU y

de en Florida células inflamatorias en el intersticial renal (C) eran cuanti fi ed. suspensiones de células individuales (E y F) se prepararon forma la fi riñones fibrótica. CD11b + F4 / 80 +

macrófagos fueron determinados por FACS (E). El número de CD11b + F4 / 80 + macrófagos en (E) fue cuantitativamente compararon (F). (G y H) CCR2 + en Florida macrófagos

inflamatorios en (E) se determinaron mediante FACS (G), y el número de CD11b + F4 80 + + macrófagos / CCR2 se comparó cuantitativamente (H). Bares = media ± SD, n = 6. *, P < 0,05,

ns, no signi fi hipocresía.

knockout renal notablemente mejorado fi fibrosis. En contraste, renal fi fibrosis se ve agravado adultos se mantiene principalmente por en el lugar tejido residente proliferación de
por el uso de la mieloide especí fi c Notch modelo de ratón de activación. Por lo tanto, macrófagos y monocitos en Florida UX desde BM, así como la muerte celular
llegamos a la conclusión de que la activación de Notch es probable que sea necesario para la programada implica la apoptosis y / o necroptosis (Hashimoto et al., 2013 ;
activación de los macrófagos en el tejido fi brogenesis. Para inhibir la activación de Notch en Yamasaki et al., 2014 ; Zigmond et al., 2014 ; Stamatiades et al., 2016 ). así lo
los macrófagos puede ser una nueva estrategia para fi terapia de fibrosis, por lo menos para el comentamos el mecanismo (s) celular por el que la señalización de Notch regulado
hígado y el riñón fi fibrosis. el repertorio de macrófagos durante renal fi fibrosis. Nuestro experimento
incorporación de BrdU se indica que la proliferación de macrófagos local no
macrófagos tisulares contienen sub-poblaciones con diferentes ontogenias contribuido a la Notch regulación de señalización mediada por macrófagos en renal fi
(Ginhoux y Guilliams, 2016 ; Wynn y Vannella, 2016 ). La homeostasis de repertorio brogenesis.
macrófagos en

© El autor (s) 2018

la señalización de Notch mieloide aumenta renal fi fibrosis
Además, el agotamiento de CD11b + F4 / 80 + CX3CR1 + macrófagos renales
residentes ejercida no obvia en Florida influencia en UUOinduced renal fi fibrosis en
cualquiera de control o mieloide especí fi do
RBP-J ratones knockout, lo que sugiere que mieloide especí fi la señalización de c
Notch podría no regular renal fi Brosis a través de los macrófagos residentes riñón.
Estos resultados nos recuerda que la señalización Notch podría regular derivadas de
monocitos macrófagos de reclutamiento para renal fi brogenesis. De hecho, mieloide
especí fi do
RBP-J knockout disminuyó mientras NIC sobre-expresión aumentado el número de
CCR2 + macrófagos en fi renal fibrótica, en consonancia con renal atenuado o
agravado fi fibrosis en estos ratones, respectivamente. Esto también es coherente
con el
fi Nding por Lin et al., quienes mostraron que el agotamiento de Ly6C Lo
macrófagos residentes renales no afectaron fi fibrosis mientras que el agotamiento
de monocitos circulantes y reclutado Ly6C Hola
renal macrófagos mejorado fi fibrosis (Böttinger 2007 ; Lin et al., 2009 ). Sin embargo,
un estudio reciente de Bettie et al han sugerido que circulan macrófagos
monocitos-derivados y macrófagos residentes hígado comparten muchas
características comunes y pueden tener funciones similares, independientemente
de su origen (Beattie et al., 2016 ). Otras investigaciones que emplean linaje más
precisa rastreo y ratones de genes de orientación, tales como CCR2 - / - ( Yona et al., 2013 monocitos mediada por CCR2 y la activación de los macrófagos local (Fig. S8). Estas fi hallazgos
) y CX3CR1 GFP transgénicos (Seki et al., 2009 ) En la muesca de fi ciente o de fondo
activada, están obligados a elucidar el mecanismo celular (s) para la señalización
Notch para regular los macrófagos en renal fi fibrosis.
En Florida monocitos inflamatorios liberados de BM son reclutados en el Florida sitios
amación y luego se diferencian en macrófagos, seguido por la activación polarizada
sobre immunomicroenvironment local (Yona et al., 2013 ). la señalización de Notch
ha sido bien demostrado participar en la diferenciación terminal, la activación y la
polarización de los macrófagos en diversos modelos de enfermedad (Wang et al., 2010
; Williams et al., 2010 ; Zhang et al., 2010 ; Xu et al., 2012 ; Franklin et al., 2014 ; Zhao
et al., 2016 ). En el renal inducida por la OUU fi fibrosis, aunque se ha descrito que los
macrófagos polarizados, especialmente macrófagos M1 y M2, regulan el desarrollo
de insuficiencia renal fi fibrosis por diferentes mecanismos (Vernon et al., 2010 ), En
nuestro estudio, parecía que ambos tipos M1 y M2 de activación de los macrófagos
se vieron comprometidas por el bloqueo de Notch en macrófagos tras la OUU, lo
que sugiere que la activación de los macrófagos de señalización Notch regulada,
independientemente de M1 o M2 macrófagos durante renal fi brogenesis. Este
fenómeno es coherente con nuestra anterior fi hallazgos sobre la regulación de la
señalización de Notch de la activación de macrófagos en el hígado
fi fibrosis (He et al., 2015 ). Recientemente, en el hígado murino fi fibrosis,
Ranmachandran et al informa de que una clase de nuevos subconjuntos de
macrófagos son identificados fi ed basado en la expresión Ly6c, que son distintos
desde el paradigma M1 / ​M2, lo que sugiere que clasificación más funcional fi cación
de macrófagos subconjuntos se debe utilizar para representar mejor su biología
(Ramachandran et al., 2012 ). De hecho, Lin et al ha encontrado que Ly6 Hola y Ly6c Lo
macrófagos en riñón poseen función diferente durante renal fi brogenesis (Lin et al., 2009 experimentos con animales fueron aprobados por el experimento con animales Comité de
). Por lo tanto, podría ser posible que la señalización de Notch regula fenotipo
macrófago fuera del M1 / ​M2 clasificación fi cación en
© El autor (s) 2018
ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
riñón y el hígado fi fibrosis. Funcionalmente, RBP-J de fi macrófagos cientes mostraron
reducción de la capacidad de inducir EMT de las células epiteliales tubulares, debido a
la menor pro- fi el factor TGF-fibrótica β
la secreción en el fi fibrótica de riñón y riñón macrófagos. Además de inducir la
EMT, TGF β se informa a un máximo de regular la expresión de CCL2 en los
macrófagos y luego promover el reclutamiento de monocitos y la acumulación de
macrófagos (Border y Noble, 1994 ; Qi et al., 2006 ). Por lo tanto, es razonable
especular que la menor reclutamiento de monocitos y macrófagos en fi filtración en RBP-J
cko fi renal fibrótica puede provenir de la reducción de TGF β la secreción a través
de la baja regulación de CCL2 expresión en macrófagos. Por otra parte, Franklin ha
informado de que en Florida monocitos inflamatorios no son capaces de
diferenciarse en macrófagos asociados a tumores en ausencia de RBP-J mediante
el uso CD11c Cre RBP-J f / f ratones PYMT (Franklin et al., 2014 ), Este resultado
también se puede explicar en parte nuestra fi hallazgos por qué menos macrófagos
se acumulan en fi renal fibrótica en Lyz Cre RBP-J f / f ratones.
Proteína y de la célula
En resumen, nuestros datos se han dado a conocer que la señalización Notch
regula en macrófagos renal fi fibrosis en dos niveles, a saber, el reclutamiento de
son de la significación potencial fi cado para el establecimiento de nuevas estrategias
terapéuticas para renal fi fibrosis en la ERC. Sin embargo, se debe ser cauteloso
teniendo en cuenta el espacio-temporal y especí fi c funciones de la señalización de
Notch en renal fi fibrosis. la señalización de Notch regula EMT directamente en varios
tipos de células epiteliales (Li et al.,
2013 ). la señalización de Notch también es un regulador crítico de pericitos, que se
han puesto de relieve como una importante fuente de myo fi fibroblastos durante renal fi fibrosis
por estudios recientes (Duf-
fi vejez, 2014 ; Tattersall et al., 2016 ). Incluso en el compartimiento de los
macrófagos, las subpoblaciones de macrófagos con diferentes orígenes y vías de
activación probable exhiben diferentes funciones en renal fi fibrosis de las diferentes
etapas (Kitagawa et al.,
2004 ; Nishida et al., 2005 ; Wang et al., 2007 ; Henderson et al., 2008 ). especí fi terapias
dirigidas Notch-camente en los macrófagos pueden ser una herramienta útil para
superar estos obstáculos para renal fi tratamiento fibrosis.
MATERIALES Y MÉTODOS
animales
Los ratones se mantienen en la especificación fi c libre (SPF) condición en el fondo C57BL / 6
patógeno. Los ratones que llevan Lyz2-Cre transgén (Clausen et al., 1999 ) (Stock # 019096,
The Jackson Laboratory) se cruzaron con RBP-J- Florida oxed (RBP-J f) ( Han et al., 2002 )
Ratones o la ROSA-Stop Florida oxed-NIC (STOP F- NIC, un regalo de HL Li) para obtener
Lyz2-Cre / RBP-J + / f ( Labores de control) y Lyz2-Cre / RBP-J f / f ( RBP-J CKO) ratones (He et al., 2015 ), O Lyz-Cre
( Labores de control) y Lyz2-Cre / Stop F- NIC (NIC California)
ratones (Zhao et al., 2016 ). Los ratones fueron genotipados mediante el uso de PCR con el ADN de la
cola del ratón como una plantilla. Todos los cebadores se enumeran en la Tabla S1. Todos los
Administración de la Cuarta Universidad Médica Militar. Todas las directrices institucionales y
nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio fueron seguidos.
 ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
El modelo de ratón de la OUU
El modelo de ratón de la OUU se estableció como se describe (Vielhauer et al., 2001 ; Chevalier
et al., 2009 ). queso Brie Florida y, los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico (40
mg / kg) inyectado por vía intraperitoneal (ip). UN Florida ank incisión fue hecha y el uréter
izquierdo se ligó con sutura de seda 4-0 en dos puntos y se corta entre las ligaduras con el fin
de prevenir la infección del tracto urinario retrógrada. Tanto de los riñones obstruidos (Obstr) y
contralateral (Contra) se recogieron el día 7 o 14 después de la ligadura ureteral para otros
análisis. Al menos 6 pares de ratones fueron analizados para cada ensayo.
Aislamiento de leucocitos de riñón de ratón y las células epiteliales tubulares
suspensiones de células de riñón se prepararon como se ha descrito previamente (Kitamoto et
al., 2009 ). Los riñones fueron disecados y se disocian en Hank ' la solución de sal equilibrada
(HBSS) que contiene 2,0 mg / ml de colagenasa IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y 200 μ g / ml
de DNasa I (Sigma) durante 30 min a 37 ° C con agitación intermitente. suspensiones de
células individuales se lavaron dos veces en HBSS. Después de la lisis de eritrocitos, las
células se lavaron dos veces otra vez antes de nuevos análisis.
Proteína y de la célula
Para el aislamiento de las células epiteliales de los túbulos del riñón, se anestesiaron ratones
C57BL / 6 (4 semanas de edad) y sacri fi Sección de la economía. Los riñones se retiraron
inmediatamente y se colocaron en HBSS enfriada con hielo. Las cortezas renales fueron disecados
visualmente y cortados en piezas de 1 mm de ancho, y se transfirieron a 10 ml de HBSS que
contiene colagenasa IV para cada riñón. Los tejidos se incubaron a 37 ° C con rotación a 70 rpm
durante 30 min. Después de eso, Dulbeccoo ' s modi fi ed de Eagle ' se añadió s medio (DMEM) que
contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) para inactivar las enzimas. Las suspensiones de células
túbulo se pasaron luego a través de un tamiz de malla 200 para eliminar los restos de tejido,
seguido por centrifugación a 1.200 rpm durante 5 min, y se resuspendieron en 10 ml de DMEM /
F-12 de medios de cultivo que contiene 0,01 mg de factor de crecimiento / ml recombinante
epidérmico humano (EGFhr) y 10% de FBS y antibióticos. Las células se cultivaron en placas de 6
pocillos a 37 ° C en 95% de aire 5% de CO 2.
Citometría de flujo
Las células se resuspendieron en tampón FACS (PBS que contiene 2% de FCS y 0,05% NaN 2) y
pre-incubadas con anti-rata Fc receptor (CD16 /
32) durante 10 min. Y a continuación, las células se tiñeron con Alexa Fluor 488 anti-ratón F4 /
80, APC anti-ratón CD11b, PE anti-ratón CCR2, APC anti-ratón CX3CR1, APC anti-ratón Ly6C,
biotina y avidina Ly6G PE. La información detallada de cada anticuerpo se enumera en la Tabla
S2. análisis FACS se realizó utilizando un FACSCalibur TM
Florida ow citómetro (BD Immunocytometry Systems, Franklin Lakes, NJ). Los datos se
analizaron con el software Flowjo vX.06 (Flowjo, LLC, Ashland, Oregón). clasificación de
células se realizó utilizando un CytoFLEX Florida ow citómetro (Beckman Coulter Life Sciences,
IN). Las células muertas se excluyeron por tinción con yoduro de propidio (PI).
El agotamiento de los macrófagos residentes tejido con clodronato encapsulado en liposomas
El clodronato (Sigma-Aldrich) fue encapsulado en liposomas (CLS) como se describe (Van
Rooijen y Sanders, 1994 ). Los liposomas-encapsulan PBS (PLS) se utilizó como control. Los
ratones fueron inyectados por vía intravenosa (iv) con 200 μ L de CLs o PLs en 2 días
consecutivos, seguido por una inyección más de 48 h después de la segunda, y luego
Yali Jiang et al.
sometido a la OUU acuerdo con el protocolo de agotamiento de macrófagos (Kitamoto et al., 2009
).
En vivo el marcaje con bromodesoxiuridina (BrdU)
Los ratones fueron sometidos a la OUU, y se inyectaron ip con BrdU (1,2 mg / 25 g de peso
corporal) 2 h después de la operación. La misma inyección de BrdU se repitió cada dos días hasta
que los ratones eran sacri fi ced en el día 7. Se aislaron y se tiñeron para la incorporación de BrdU
en los macrófagos con APC anti-ratón de BrdU (Biolegend) y Alexa Fluor 488 anti-ratón de F4 / 80
para el ensayo adicionales FACS Los leucocitos de riñón.
Cultivo de células y transfección
macrófagos derivados-BM (BMDMs) se aislaron y cultivaron como se ha descrito previamente
(Wang et al., 2010 ). En algún caso, los macrófagos renales fueron ordenados desde el fi renal
fibrótica de RBP-J cko y los ratones de control por FACS, y luego los macrófagos ordenados se
contaron e igual número de macrófagos (1 × 10 5) desde el rbpj ratones cko y de control se
cultivaron en placa de 48 pocillos durante 12 h, seguido por la recogida de los sobrenadantes
como medio condicional derivada de macrófagos (CM) para su posterior estudio.
La región de codificación de la murino CCL2 cDNA fue ampli fi ed por PCR usando
cebadores (adelante: GCGAATTCAATGCAGGTCCCTGT CATGCTTCT, reverse:
GCGTCGACCTAGTTCACTGTCACACTG GTCA) con una biblioteca de ADNc de ratón como
molde. los CCL2 gen se insertó en pCMV1-Bandera para construir pCMV1-Flag-CCL2.
células HEK293 (ATCC) se cultivaron en DMEM (Invitrogen) suplementado con FBS al 10%, 2
mmol / L de L-glutamina, penicilina 100 U / ml y 100 mg / ml de estreptomicina. Para la
transfección, las células se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron con pCMV1-Flag-CCL2
o pCMV1Flag usando Lipofectamina 2000 TM ( Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el fabricante ' protocolo
s. Las células se utilizaron para experimentos adicionales 24 h después de la transfección.
ensayo de migración celular
BMDMs (1,5 × 10 5) se sembraron en la cámara superior de las cámaras Transwell con un
policarbonato 8 micras fi filtro (Millipore, Darmstadt, Alemania) en DMEM con 10% de FBS.
células HEK293 (1,5 × 10 6) transfectadas con pCMV1-Flag-CCL2 o pCMV1-Bandera se
sembraron en la cámara inferior. La migración celular se dejó durante 3,5 h de incubación a 37
° C, y macrófagos migran a la cámara inferior se contaron bajo un microscopio. Cinco
seleccionados al azar fi campos se contaron como migrar el número de células de cada
inserción si no especí fi ed. Cada experimento se repitió al menos tres veces con triplicados.
Histología
Tinción H & E y Masson ' s tricromo y rojo sirio y α- tinción SMA se llevaron a cabo siguiendo
protocolos estándar (He et al.,
2015 ). El área de fi fibrosis después de Masson ' s tinción y coloración rojo sirio, y α- SMA + zona
fueron analizados utilizando el software de procesamiento de imágenes WinROOF (Olympus,
Tokio, Japón). Al menos 10 imágenes digitalizadas de la corteza renal se analizaron para cada
muestra, y el área de porcentaje de tinción positiva por fi Se evaluó ELD. Las imágenes fueron
tomadas con un microscopio (BX51, Olympus) con una cámara CCD (DP70, Olympus).
© El autor (s) 2018
la señalización de Notch mieloide aumenta renal fi fibrosis ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Por inmuno Florida fluorescencia, las secciones de tejido (2 - 3 m secciones de criostato) se los graduados del Centro de Innovación de la Cuarta Universidad Médica Militar.

prepararon de acuerdo con procedimientos estándar. Los anticuerpos primarios incluyeron

anti-ratón de F4 / 80. Los anticuerpos secundarios incluyen biotina de cabra anti-IgG de rata (H

+ L) y Alexa 594 anti-IgG de rata. DyLight 488 estreptavidina se usó para su posterior tinción ABREVIATURAS
con anticuerpos biotinilados. La información anticuerpo detallada se enumeran en la Tabla S2.
α- SMA, α- actina de músculo liso; BM, médula ósea; CKD, enfermedades crónicas del riñón;
Los núcleos se contra-tiñeron con Hoechst 33258 (Sigma). Las imágenes fueron tomadas bajo
Cls, clodronato-liposomas; CM, medio condicionado; CYLD, cilindromatosis; Amortigua,
una Florida fluorescencia microscopio (BX51, Olympus) o un microscopio de barrido láser
patrones moleculares de daño-asociado; ECM, matriz extracelular; EMT, la transición
confocal (FV1000, Olympus).
epitelial-tomesenchymal; IMF, significa Florida fluorescencia intensidad; NIC, Notch dominio

intracelular; PTEpiC, las células epiteliales tubulares proximales; RBP-J, la señal de

recombinación de unión proteína-J κ; SPF, especi fi c libres de patógenos; OUU, obstrucción

ureteral unilateral.
Extracción de RNA y QRT-PCR

El ARN total se preparó usando el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el fabricante ' instrucciones

s. Después de la transcripción inversa, PCR en tiempo real se realizó utilizando el kit SYBR

Premix EX TaqTM II (Takara, Dalian, China) y el 7500 sistema de PCR en tiempo real ABI
PRISM, con β- actina como un control interno. Los cebadores para cada gen se enumeran en la
Tabla S1.
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
Yali Jiang y Yuanyuan Wang llevaron a cabo los experimentos principales y contribuyeron
igualmente a este trabajo; Pengfei Ma y Dongjie Un realizaron experimentos morfológicas;

Junlong Zhao ayudó plásmidos de construcción; Shiqian Liang mantiene de ratones y

Proteína y de la célula
genotipificación; Yuchen de Ye hizo cultivo celular primario; Yingying Lu estableció el modo
El análisis de transferencia Western
OUU ratón y proporcionó asistencia técnica para FACS; Peng Zhang realizó tinción H & E; Liu

Western Blot se realizó de forma rutinaria, con anticuerpos primarios contra E-cadherina, Xiaowei, Hua Qin Han y Hongyan diseñado los experimentos y escribió el documento.

N-cadherina, vimentina y β- actina. Peroxidasa de rábano picante (HRP) de cabra conjugado

con IgG anti-conejo y de cabra anti-ratón IgG se utilizaron como los anticuerpos secundarios.

La información detallada de cada anticuerpo se enumera en la Tabla 2.

SEGUIMIENTO DE LAS NORMAS ÉTICAS

Ligado a enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA) Este artículo no contiene ningún estudio con sujetos humanos llevadas a cabo por cualquiera

de los autores. Todas institucional y nacional

Los niveles séricos de TNF α y TGF β se determinaron con kits ELISA comerciales (eBioscience)
directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio fueron seguidos. Yali Jiang, Wang
siguiendo los protocolos recomendados.
Yuanyuan, Pengfei Ma, Dongjie Un, Junlong Zhao, Shiqian Liang, Yuchen Ye, Yingying Lu,

Peng Zhang, Liu Xiaowei, Hua Qin Han y Hongyan declaran que no tienen ni aire Florida ictos de

interés.
Cromatina immunoprecipiation (ChIP) de ensayo

El chip de ensayo se realizó usando un kit (Merck Millipore, Billerica, MA) de acuerdo con el

fabricante ' instrucciones s con monocitos de BM ratón. Las células recién aisladas se trataron ACCESO ABIERTO
siguiendo el protocolo estándar, y las preparaciones de la cromatina fragmentados se
En este artículo se distribuye bajo los términos de la licencia Creative Commons Atribución 4.0
inmunoprecipitaron con anti-ARN Pol II, anti-NIC o anticuerpo de control de isotipo. ADN
Licencia Internacional ( http://creativecommons.org/ licencias / por / 4.0 / ), Que permite el uso
genómico fue extraído de los complejos inmunes recogidos y analizados mediante PCR con los
ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que se dé crédito apropiado
cebadores de orientación
al autor (s) original y la fuente, proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons, e

indicar si se han realizado cambios.

CCR2 fragmentos de promotor (Tabla S1).

Análisis estadístico

Las imágenes fueron procesados ​con el software Pro Imagen Plus 5.1 (Media Cybernetics Inc, Referencias
Bethesda, MA). Los datos se analizaron con el software Graph Pad Prism 5, versión 5.0. Student
Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lago RJ (1999) Notch de señalización:
para datos independientes ' s t prueba o emparejado t- Se utilizó la prueba para el análisis
el control del destino celular y la integración de la señal en el desarrollo. Science 284: 770 - 776
estadístico. El nivel de significación fi cado se fijó en P < 0.05.

Beattie L, Sawtell A, Mann J, TC marco, Teal B, de Labastida Rivera

F, Brown N, Walwyn-Brown K, Moore JW, MacDonald S, Lim EK, Dalton JE, Engwerda CR,
EXPRESIONES DE GRATITUD
Macdonald KP, Kaye PM (2016) derivadas de médula ósea y los macrófagos del hígado
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China residente muestran firmas transcriptomic único, pero las funciones biológicas similares. J
(Grant Nos. 81530018, 31371474, Hepatol 65 (64): 758 - 768
81370811, 31570878 y 81300315). Este estudio se realizó en

© El autor (s) 2018

 ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Yali Jiang et al.

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la señalización de Notch mieloide aumenta renal fi fibrosis ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Seki E, de Minicis S, S Inokuchi, Taura K, K Miyai, van Rooijen N, M1 M2 frente a la polarización de los macrófagos en las respuestas inmunitarias

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