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Dr.a.

Juliana Lopes Almeida


Médica veterinária
Mestrado em ciências agrárias, reprodução equina (Universidade de Brasília - UNB)
Doutorado em patologia comparativa, reprodução equina (University of California, Davis, EUA, UCDAVIS)
Pós doutorado em Biotecnologia da reprodução (Universidade de Fortaleza, UNIFOR)
Diretora do Hospital Veterinário Metropolitano - HVM
 Biotecnologia da reprodução compreende
todas as técnicas utilizadas como
ferramentas para aumentar a eficiência
reprodutiva dos animais.
 Viabilidade da criação de cavalos = sucesso na
reprodução
 Indústria do cavalo -movimenta cerca de R$ 7,5
bilhões anuais
 3,2 milhões de empregos diretos e indiretos

 Investimento no melhoramento genético


 Caracterização da Reprodução da égua:
 Poliéstricas estacionais:
▪ Foto-período dependentes;
▪ Duração variável (Hafez, 1995, Romano et al. 1998);
 Puberdade - 12 a 18 meses;
 Maturidade sexual - 24 meses:
▪ Variabilidades (McKinnon, 1993);
 Melatonina:
▪ ↑ foto-período = ↓ melatonina;
▪ Manejo visando a atividade ovariana (Hafez, 1995);
MELATONINA -
PINEAL HIPOTÁLAMO

GNRH +

HIPÓFISE

LH/FSH +

INIBINA ESTRÓGENO
FSH - FSH - / LH +

OVÁRIO
AUMENTO
Progesterona PMSG PGF2 alfa Estrógeno

ÚTERO
(Placenta)
 Gestação
 315 360 dias;
 Reconhecimento materno:
▪ Previne regressão do CL (Stanbenfeld & Edqvist, 1996);
 Fixação Embrionária:
▪ 16o dia pós ovulação;
▪ Cálices endometriais a partir de 35 dias:
▪ Gonadotropina Coriônica Eqüina ou PMSG:
 Função:
 Corpos Lúteos Acessórios;
▪ Função;
▪ Geralmente são formados 3 a 5 por ovário;
▪ Formados pela ação da PMSG;
▪ Persistem até 180 dias;
Hormônio Ação Indicação Produtos Dosagem Observação
GNRH Ovulação - Indireta Indução de Ovulação em Deslorelin 1,0 mg IV ou Folículo maior ou igual a 35
36 horas a 1,5 mg IM mm e edema de útero
Luteinização de CL

Ocitocina contratilidade uterina - Limpeza do útero Ocitocina 20UI Im ou IV Pré sensibilizado por
miométrio 10UI/ml estrógenos
Retenção de placenta Expulsão da placenta e 20UI Im ou IV
lóquios
Indução de parto Parto 40 a 100 UI IM

Estrógenos - Indução de cio coleta de sêmen ou cio ECP, 1 a 5 mg Verficar ausência de CL e


Benzoato ou silencioso Sincrodiol, Progesterona
cioponato de Gonadiol,
estradiol estrogin
Relaxamento de cérvice Presença de folículos mas
ou cio sem edema sem edema uterino ou
uterino aberuta de cérvice
Indução de edema Indução de edema em 10 a 15 mg Protocolo de anestro uso com
éguas em anestro divididos em 3 Progesterona
dias ou dose
única

Progesterona Preparo do útero para Éguas em anestro Progestero 1500 mg Protocolo de anestro uso com
receber o embrião na 300 mg Progesterona
IM
semanal,
Altrenoges
t
Complemento de Éguas gestantes com Sinais de edema, Cl
progesterona endógena sinais de pouca hipoecogênico, útero flácido
progesterona endógena ou
receptoras para receber
embrião
Supressão de cio Éguas em prova
Hormônio Ação Indicação Produtos Dosagem Observação
hCG Ovulação - direta Indução de ovulação em Vetecor, 1500UI
36 horas chorulon
Luterinização de CL

Prostaglandina Regressão de Cl Indução de cio Lutalyse, dinoprost 7,5 5 dias após ovulação
F 2 alfa Sincrocio, mg
Preloban,
Sincrosin
Sincronização receptoras intervalo de 0 a 2 dias
CL persistente
Aborto ou Absorção Até 60 dias de gestação
Indução de parto

EPE Gonadotropina Superovulação EPE 8 mg IM BID Trata um ciclo pós PGF por 6
dias
Anestro persistente
Ovulação - direta Indução de Ovulação em 6 mg IV
36 horas
 Entende-se por inseminação artificial o
depósito mecânico de sêmen no
aparelho reprodutivo da fêmea
 Vantagens da utilização de um
programa de I.A. na espécie equina.

 Melhor aproveitamento do Garanhão

 Evita doenças transmissíveis através da


cobertura

 Evita ferimentos durante a cobertura do


garanhão e da égua
 Manipulação de glândulas acessórias;
 Farmacológica;
 Vagina artificial;
 Deletérios: centrifugação rápida, mudanças
de temperatura; luz; químicos; água
 Volume de 020 a 100 mL
 Aparência: leitosa, cremosa, opalescente ou aquosa
 Cor: branco opalescente a leitoso
 Odor: “sui-generis”
 Motilidade: proporção de sptz móveis em uma
amostra de semen
 Vigor: velocidade do movimento de sptz com
motilidade progressiva (0-5)
 Concentração espermática;

 Patologia espermática;
 Fresco,

 Refrigerado,

 Congelado.
 Porque é desejável refrigerar o sêmen?

 o metabolismo do sptz a temperatura corporal e


ambiente é máximo.

 produtos do catabolismo do sptz (ác. lático e/ou CO2)


aumentam a acidez do meio causando danos as
células espermáticas.

 peroxidação das membranas lipídicas causam danos


as células espermáticas.
 Limitações

 Choque térmico: alterações no espermatozóides


quando eles são rapidamente resfriados da
temperatura corporal até próximo a 0°C

 Choque osmótico
 SPTZ para cada 15° C de redução, o
metabolismo é reduzido em 45%.
 SPTZ armazenados a 5°C:
requerimentos metabólicos serão
apenas de 10%
 Faixa crítica = 19 a 8°C
 SPTZ são insensíveis a velocidade de
resfriamento até atingir 19°C
 A partir de 19ºC; veloc. 0,05°C/min.
 Diluição 1:1 –Utilização 24-48 h
 Diluidor mais utilizado: diluidor de Kenney (1975)
 Glicose -49g
 Leite desnatado -24g
 Bicarbonato de sódio a 10% -7,5ml
 Gentamicina -200mg
 Água bidestilada -1000ml

 Doses inseminates: 109, 10 a 30 mL


 Refrigeração computadorizada
 Unidades de refrigeração e conservação (contêiner):

 Equitainer I, II e III

 ExpectaFoal

 Equine Express

 Salsbro Box (contêiner sueco)

 Celle container (container alemão)

 Botutainer, Botubox (containers brasileiros)


 Grande vantagem de conservação de sêmen por
tempo indeterminado
 Forma de seguro reprodutivo do animal
 Causa graves lesões ao espermatozóide
 Apenas 24% dos garanhões apresentam boas taxas de
concepção
 Não existe um protocolo ideal
 Diluidores

 Tampão, antibióticos, gema ou leite,


açucares e crioprotetor

 Avanços na composição dos diluidores

▪ Açucares: lactose, rafinose e trealose

▪ AA: glicina

 Lipoproteínas de baixa densidade da


gema, lecitina de soja
 Redução do glicerol em combinação com as amidas nos meios
comerciais

 A centrifugação amortecida:
 Composto iodado não iônico, chamado = iodixanol, é utilizado como
gradiente de densidade ou como amortecedor na centrifugação do
sêmen.
 Ausência de lesões causadas pelo processo de centrifugação.

 Centrifugação com solução de partículas de sílica silanizada

 Utilização de um filtro específico feito de membrana hidrofílica sintética


 Onde congelar

 Pallhetas de 0,5 mL

 Palhetas de 0,25 mL

 Macrotubos
 Máquinas para congelamento-TK3000® -TK

 Máquina Sousa (Patente) -tecnologia em


congelação
 Descongelamento

 Rápido x lento ?

▪ 37º C / 30 seg.

▪ 46ºC / 20 seg.

▪ 75°C / 7 seg.

▪ 98ºC/ 4 seg.
 Preparo para I.A.
 24 hs antes da ovulação
 Folículo pré-ovulatório (35
mm ou maior)
 Uso de 2500 a 3300 UI de
hCG
 Ovulação em 24-48 h
 Dose ideal: 500 milhões de espermatozóides
viáveis.

 Pipetas flexíveis.
 800 x 106 até 6 horas depois da indução de ovulação

 400 x 106 24h e 48h após ovulação


 Inseminação histeroscópica
 o sêmen depositado próximo ao oviduto, sobre a junção
útero-tubárica (papila), através de um aparelho de
endoscopia via lumen uterino
 Fibroendoscópio

 Redução da quantidade de espermatozóides:


5 a 40 x 106

 Deposição ipsilateral da ovulação

 Sêmen sexado
 Definição: recuperação de embrião de uma
doadora e transferência para uma receptora;
 Éguas em competição;
 Éguas novas (2 anos);
 Éguas com méritos genéticos;
 Vários potros ou éguas;
 Éguas com problemas reprodutivos;
 Éguas com problemas não-reprodutivos;
 Pesquisa
 Espécies em extinção
 Éguas jovens, reprodutivamente saudáveis
 3-10 anos de idade, 1-2 potros
 Ciclo estral normal, livre de fluido uterino
 Qualidade do endométrio

 Boa mãe
 Tamanho da égua
 capacidade lactante
 bom temperamento

 Três tipos de receptoras:


 Éguas intactas (mais comum)
 Ovariectomizadas, éguas tratadas com progesterona
 Não cíclicas, éguas tratadas com progesterona
ovulação da
doadora

ovulação da receptora
 Quando:
 D6: vitrificação, criopreservação, bissecção;
 D7-8: maioria das lavagens;
 D9: maior índice de recuperação, embrião
facilmente degenerado;
Dia 6 58%

Dia 7 61%

Dia 8 65%

Dia 9 71%
 70% éguas jovens, éguas férteis, sêmen
fresco;

 30-50% éguas velhas, sêmen congelado


 Contenção;

 Cateter inserido na sonda e preenchido com


ar (selamento de os interno);

 Lavagem (1 a 2 L por égua);

 Fluido passado por filtro de 75μm;



 Repetir 2 a 3 vezes.
 Volume de efluente:
 >90% recuperação
 Ocitocina
 Massagem transretal

 Qualidade do efluente
 Turvo: endometrite
 Hemorrágico: massagem muito vigorosa e
manipulação de cateter
Égua:
 Idade
 > 14 anos: redução RE
 Patologia de oviduto, útero
 Morte embrionária precoce

 Número de ovulações
 ovulações múltiplas

 Histórico reprodutivo
 Aborto, Morte embrionária precoce,
 subfertilidade
Garanhão:

 Qualidade do sêmen;

 Tipo de sêmen (fresco,


resfriado, congelado);

 Momento da inseminação.
 Manejo

 Exercício: reduzida taxa de recuperação


embrionária

 Dia da tentativa de recuperação


▪ embrião entra no útero D 5.5-6
▪ As taxas de recuperação D6 menor
▪ Falha de entrar no útero
 Procura:
 Lupa (7 a 15 x magn);
 Embriões maiores visíveis a
olho nu;

 manipulação:
 Lavagem:
 Passagem por 3 gotas de
solução de manutenção

 Avaliação:
 Tamanho
 Qualidade
 Estágio de desenvolvimento
(mórula, blastocisto inicial,
blastocisto expandido)
 Maior índice de recuperados
( grau 1 e 2)
grau categoria aparência caracteristicas

1 excelente esférico embrião ideal, células


uniformes, cor e
textura uniforme

2 bom Imperfeições Poucos blastômeros


pequenas extrusados, forma
irregular, separação de
trofoblasto

3 razoável Problemas visíveis Blastômeros


extrusados, células
degeneradas,
blastocele degenerada
4 ruim Problemas severos, Blastocele colapsada,
irregular muitos balstômeros
extrusados, células
degeneradas, com
 Cirúrgica:
 Linha ventral;
 Laparotomia de flanco;

 Não cirúrgica:
 Transcervical
 Espéculo
 Pipeta de inseminação
 Bainha e inovulador

 Injeção intra-uterina guiada


por ultra-som
 Historicamente, técnica
cirúrgica resultava em maiores
índices
 70-75% (Squires et al.)
 >90% (Wilsher et al.)

 Recentemente, semelhantes
ou melhores resultados com
técnica nao-cirúrgica
 81% (Losinno et al.)
 85% (Wilsher et al.)
 Embrião
 Idade das doadoras
 Qualidade
 Maturidade

 Receptoras
 Tônus do utero e cervix antes da transferência
 Idade da receptora

 Manejo
 técnicas de transferência
 sincronização
 Vantagens:
 Sem necessidade de manejo de receptoras
 Transporte a longas distâncias
 criopreservação de embriões

 Meios
 Ham’s F-10
 Vitrocell
 Botuembryo
 Dispositivo de refrigeração passiva para
armazenar embriões em 5° C por até 24
horas;
 Taxas de prenhez similares a embriões
'frescos’;

 Não houve diferenças significativas em


viabilidade entre embriões D7 e D8
 Maiores embriões D7 mais resistentes
do que o menores embriões D7
 Porque?
 Preservar material genético
 Importação/exportação
 Receptoras não disponíveis
 Armazenamento até a doadora
provar seu valor em competicões

 Como?
 técnicas convencionais de
congelamento
 índices de gestação: 50-60%
 embriões < 250 μm
vitrificação criopreservação

Altas conc de crioprotetores Baixa conc de crioprotetores

< 15 min para terminar 1.5 horas para completar

Sem material especial Material especial

Descongelamento: transferência direta Descongelamento: diluição antes de


transferência
< 300 μm < 250 - 300 μm

índices de gestação: 60% índices de gestação: 50 - 60%


 Razões para o fracasso da
superovulação:
 Anatomia do ovário
 Insensibilidade do receptor de FSH
equino
 Indisponibilidade de produtos
confiáves que induzam múltipla
ovulações;

 Benefícios:
 Aumentar a eficiência TRA
 Aumento a progênie
 Avanço da primeira ovulação
 eCG, GnRH, pFSH, Hormônio de crescimento
 Não eficiente

 Imunização contra inibina


 Efeitos colaterais

 EPE (extrato de pituitaria equina)


 índices de ovulação (2-4 ovulações por ciclo)
 recuperação embrionária: 2 (50%)

 eFSH
 semelhante a EPE

 ReFSH
 eFSH (BID) quando o maior folículo for 20-23
mm
 PGF2α segundo dia
 Parar quando folículo atingir 33-35 mm
 Aguardar 24-36 hrs
 hCG
 Inseminação
 Indicações:

 Fêmeas acometidas por afecções ovarianas, uterinas e cervicais;

 Éguas que não apresentam bons resultados na Monta Natural (MN),


Inseminação Artificial (IA) e/ou Transferência de Embriões (TE), sem
causa definida ; ou

 Animais com anormalidades adquiridas durante a vida reprodutiva:


oclusões de oviduto, Infecções uterinas e lacerações cervicais

 Coleta de ovócito:
 Éguas eutanaziadas
 Aspiração transvaginal
• Aspiração e lavagem dos folículos via
transvaginal, guiada por
ultrassonografia (TVA)

• Punções pelo flanco

• Laparotomia com exposição dos


ovários e aspiração dos folículos
Ovocito maduro em estágio de Metafase-II

Unidade de reprodução assistida


Hospital Quiron de Barcelona
Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia
On-line version ISSN 1806-9339
Rev. Bras. Ginecol. Obstet. vol.30 no.7 Rio de Janeiro July 2008
 GIFT clássica caracteriza-se pela deposição de
ovócitos maduros e espermatozóides
capacitados diretamente no oviduto
 Índices de coleta: 70-80% (24 h após hCG ou
GnRH)
 Transferência imediata
 MIV por 12 h a 16 h
 Transferência cirúrgica de ovócito de
doadora ao oviduto de receptoras
 Receptoras inseminadas normalmente
 Sptz colocado no oviduto no mesmo
momento do ovócito

 índices de gestação: 32-40% (éguas


velhas)
 índices de gestação: 20-92% (éguas
jovens)
 A qualidade e o tipo de conservação do
sêmen interferem nos resultados,
 Pouco sucesso
 2 embriões produzidos de FIV (ambos os casos
os ovócitos foram coletados de folículos pré-
ovulatórios conseqüentemente maturados in
vivo)
 Maiores obstáculos: a capacitação in vitro e
pouco conhecimento sobre sistema de
maturação e cultivo embrionário in vitro
Efluxo de cholesterol não foi obtido!!!
 Tx prenhez de 60% (Choi et al., 2002)
 Ovócitos são obtidos, maturados, desnudos e em seguida
aqueles com o primeiro corpúsculo polar aparente são
utilizados
 Amostra de sêmen fresco ou descongelado é lavada e
colocada em meio com polivinilpirrolidona.
 A cauda do espermatozóide é seccionada e a cabeça
injetada dentro do oócito, sendo este ativado ou não
quimicamente e cultivado in vitro ou transferido para o
oviduto de uma receptora (Squires et al., 1996)
 Precisa capacitação espermática

 Qualidade do sêmen é insuficiente

 Garanhões subférteis

 Requer um oócito maduro

 Cultivo in vitro de embriões (para o estágio de


blastocisto)
No Brasil, a empresa In Vitro Clonagem, por meio da Dra. Perla Fleury, noticiou o primeiro nascimento de um equino (fêmea)
por esta técnica no ano de 2012. Os ovócitos foram obtidos do ovário de uma égua quarto de milha, após sua morte
 Porque?
 Um sexo mais desejado
 Expansão genética mais rápida
 Superovulação
 ICSI

 Como?
 índices de separação 40% (20%
de em X e 20% emY)
 Sucesso:80-90%
 O primeiro potro produzido a partir de sêmen
sexado originou-se da inseminação cirúrgica
diretamente no oviduto de 150.000
espermatozoides (LINDSEY et al., 2001).
 60 a 70 dias (tubérculo genital)

 110 a 120 dias (gônadas)

 PCR (polimerase chain reaction)


 Inicialmente, foram encontradas grandes
dificuldades no desenvolvimento da técnica
de transferência nuclear tanto na taxa de
fusão entre oócitos e células dos doadores,
quanto na taxa de clivagem, que eram
menores que 15% (Hinrichs, 2006)

 0.7% a 2.7% de embriões reconstruídos


resultam em nascimento
 A partir de 2006 houve o nascimento de vários potros clonados.
 A empresa líder mundial na produção de clones equinos é a ViaGen, com sede no
estado do Texas, e com um laboratório em Alberta, no Canadá.
 No Brasil, os primeiros clones equinos nasceram em 2012, e são da raça Mangalarga.
Foram desenvolvidos pela empresa In Vitro Clonagem Animal, de Mogi Mirim, SP.
Um dos clones é do lendário reprodutor Turbante JO, que renasce aos 43 anos.
 Banco de células
 Os potros nascidos não
apresentaram os
problemas relatados nas
demais espécies
domésticas
 O potro clonado não será
a cópia idêntica do cavalo
original
 Vários fatores causam
diferentes fenótipos e
comportamentos
 Avanços;

 Vários aspectos ainda necessitam de


esclarecimento;