MEJORA DE LA PRODUCCIÓN DE ALCOHOLES GRASOS EN CIANOBACTERIAS MEDIANTE INGENIERÍA METABÓLICA

Abstracto

Fondo
Los alcoholes grasos son ampliamente utilizados en productos químicos industriales. Las rutas biosintéticas para
los alcoholes grasos son diversas y ampliamente existentes en la naturaleza. Muestran una gran capacidad para
producir alcoholes grasos mediante la ingeniería metabólica de diferentes huéspedes microbianos. El reciclado
directo del dióxido de carbono a los alcoholes grasos se puede lograr mediante la introducción de una ruta
productora de alcohol graso en las cianobacterias fotosintéticas. De acuerdo con nuestros preciosos informes,
se obtuvo un rendimiento relativamente bajo de alcoholes grasos en la cianobacteria genéticamente
modificada Synechocystis sp. PCC 6803.

Resultados
La producción fotosintética de alcoholes grasos en Synechocystis sp. El PCC 6803 se mejoró mediante la
expresión heteróloga del gen maqu_2220 de acil-Coenzima A (acil-CoA) reductasa graso procedente de la
bacteria marina Marinobacter aquaeoleiVT8. Se ha demostrado que Maqu_2220 cataliza tanto la reducción de
cuatro electrones de acil-CoA graso o acil-Acyl Carrier Protein (acil-ACP) como la reducción de dos electrones
de aldehído graso a alcohol graso. El knockout del gen de oxigenasa aldehído-deformilante ( sll0208 ) bloqueó
eficazmente la acumulación de hidrocarburos y redirigió el flujo de carbono en la ruta de producción de alcohol
graso. Al eliminar tanto sll0208 como sll0209 (que codifica una acil-ACP reductasa), la productividad de los
alcoholes grasos se aumentó aún más a 2,87 mg / g de peso seco.

Conclusiones
El mayor rendimiento de alcoholes grasos se logró en las cianobacterias mediante la expresión de la acil-CoA
reductasa procariota grasa Maqu_2220 y la anulación de los dos genes clave ( sll0208 y sll0209 ) que están
implicados en la vía de biosíntesis de alka (e) ne. Maqu_2220 se demostró como una enzima robusta para
producir alcoholes grasos en cianobacterias.La producción de alcoholes grasos podría aumentar
significativamente al bloquear la ruta de biosíntesis de hidrocarburos.

Palabras clave

Alcohol graso Cianobacteria Grasa acyl-CoA reductasa Marinobacter aquaeolei VT8

Fondo

En cuanto a la escasez de combustible y los problemas ambientales causados por el uso de combustibles a base
de petróleo, el desarrollo de los biocombustibles se ha considerado como una opción prometedora para
reemplazar o complementar los combustibles fósiles tradicionales. Numerosas revisiones se han publicado
centrándose en esta área y varios tipos de biocombustibles, incluidos los biocombustibles a base de ácidos
grasos, se han explorado [ 1 - 6 ].

Las cianobacterias son recursos de materias primas no alimentarias que pueden usar fuentes de agua y tierras
no productivas. Pueden convertir energía solar y CO 2 para la síntesis de coproductos y no conducen a la pérdida
de ecosistemas [ 7 ]. La producción de biocombustibles y bioquímicos en cianobacterias está recibiendo una
atención creciente debido a su capacidad fotosintética y su capacidad de ingeniería genética. La plataforma de
manipulación genética para cianobacterias está bien establecida y más de 126 genomas de cepas de
cianobacterias ya han sido secuenciados [ 8 ]. Se han publicado varias revisiones para ilustrar las ventajas y los
desafíos en la ingeniería de las cianobacterias para producir productos valiosos [ 9 , 10 ]. Hasta ahora, diferentes
tipos de moléculas como el hidrógeno, etanol, isobutiraldehído, isopreno, β-cariofileno, sacarosa, butanol,
alcoholes grasos y ácidos grasos se han producido en las cianobacterias [ 11 - 21 ]. La activación y el reciclaje de
ácidos grasos en cianobacterias también se ha investigado [ 22 , 23 ]. En 2010, se identificó en cianobacterias una
vía de biosíntesis de alcanos que consiste en una proteína reductasa portadora de acil-acilo (AAR) y una
oxigenasa aldehído-deformilante (ADO) [ 24 ]. También se informó una vía lateral responsable de una conversión
de un solo paso de aldehído graso a ácido graso libre por una aldehído deshidrogenasa (Orf0489) en la
cianobacteria Synechococcus elongatus PCC 7942 [ 25 ]. Su ortholog Slr0091 también se identificó en la cepa de
cianobacterias Synechocystis sp. PCC 6803 (en lo sucesivo, Synechocystis ) [ 26 ].

Los alcoholes grasos son productos químicos industriales importantes. También pueden ser buenos aditivos para
biocombustibles debido a sus propiedades de combustible perfectas. En la naturaleza, los alcoholes grasos
existen como alcoholes grasos libres o ceras (ésteres de oxígeno de los alcoholes grasos primarios y ácidos
grasos) en una amplia gama de organismos como bacterias, plantas y mamíferos [ 27 - 33 ]. Generalmente, dos
esquemas de reacción diferentes pueden generar alcoholes grasos primarios en sistemas biológicos
(Figura 1 A). Un esquema es la reducción de cuatro electrones de acil-CoA graso (o acil-ACP) al correspondiente
alcohol graso [ 27 ]. El otro esquema implica dos enzimas distintas: un aldehído graso que forma acil-CoA
reductasa que cataliza una reducción de dos electrones de acil-CoA graso a un aldehído graso intermedio, y una
aldehído reductasa grasa que cataliza la reducción de aldehído graso a alcohol graso [ 27 , 34 ]. Por lo tanto, las
acil-CoA (o acil-ACP) reductasas grasas (FAR) se pueden dividir en dos tipos generales en términos de sus
esquemas de reacción: las FAR de reducción de cuatro electrones y dos electrones.
Archivo adicional 1 : la Tabla S1 enumera las FAR informadas de diferentes organismos, así como sus
especificidades y tipos de sustrato. Las relaciones filogenéticas de estas enzimas se muestran como un árbol sin
raíz generado por el método de unión de vecinos (archivo adicional 2 : figura S1).
Figura 1. Vías de biosíntesis de alcohol graso. (A) Dos esquemas de reacción diferentes de la biosíntesis de
alcohol graso. El alcohol graso podría sintetizarse mediante reacciones de reducción consecutivas de una acil-
CoA reductasa grasa y una aldehído reductasa grasa o mediante una reducción en una etapa de la acil-CoA
reductasa grasa. (B) Vista esquemática de las rutas de biosíntesis de alcohol graso en Synechocystis sp. PCC 6803
( Synechocystis) . Las líneas continuas muestran las rutas de biosíntesis de alka (e) ne y ácido graso libre
en Synechocystis ; las líneas discontinuas muestran las vías de biosíntesis de alcohol graso construidas
en Synechocystiseliminando el gen sll0208 / sll0209 endógeno y expresando heterólogamente la acil-CoA
reductasa grasa ( maqu_2220 ) de Marinobacter aquaeolei VT8.

Tabla S1 Las reductasas de acil-CoA (o acil-ACP) grasas informadas en diferentes organismos

Especificidad del Número de
sustrato primario acceso de
Gene name Cofactor # GenBank References
Organismo huésped

AaTFAR1a Artemisia annua U U GU733320 [1]

Acinetobacter C14:0, C16:0,

acr1b NADPH U77680 [2]
calcoaceticus C18:0

C14:0, C16:0,
AdFAR1 a Anser anser domesticus NADPH JN638548 [3]
C18:0

C18:0, C20:0,
AmFAR1 a Apis mellifera NADPH HM483391 [4]
C22:0

C24:0, C26:0,
AtCER4 a U AY070065 [5]
C28:0, C30:0

AtFAR1 a U C22:0 EU280149 [6]

AtFAR4 a U C20:0 AK227396 [6]

Arabidopsis thaliana
AtFAR5 a U C18:0 AK228404 [6]

AtFAR6 a NADPH C16:0 EU280151 [7]

AtFAR8 a U U EU280153 [8]

NADPH /
AtMS2 a C16:0 EU280150 [9]
NADH

BbFAR b Botryococcus braunii NADH U None [10]

C15:0, C16:0,
BmFAR a Bombyx mori NADPH AB104896 [11]
C16:1, C16:2

C18:0, C20:0,
CfFAR1 a NADPH C22:0, C24:0, JN243755 [12]
C26:0
Calanus finmarchicus
CfFAR2 a NADPH C24:0, C26:0 JN243756 [12]

C16:0, C18:0,
CfFAR3 a NADPH JN243757 [12]
C18:1, C20:1

EgFAR a Euglena gracilis NADH C14:0, C16:0 GU733919 [13]

GgFAR1 a Gallus gallus NADPH C16:0, C18:0 NM_001031179 [14]

GgFAR2 a NADPH C18:0 XM_417235 [3]

HsFAR1 a Homo sapiens U U AY600449 [15]

HsFAR2 a U U BC022267 [15]

C14:0, C16:0,
MaFAR a NADPH C16:1, C18:0, YP_959769 [16]
Marinobacter
C18:1, C20:4
aquaeolei VT8
C14:0, C16:0,
Maqu_2220 a NADPH C18:0, C18:1, ABM19299 [17]
C20:0

C16:0, C18:0,
MmFAR1 a Mus musculus NADPH BC007178 [15]
C18:1, C18:2

MmFAR2 a NADPH C16:0, C18:0 BC055759 [15]

OnpgFAR-E a U U FJ807735 [18]

Ostrinia nubilalis
OnpgFAR-Z a U U FJ807736 [18]
orf1594 b Synechococcus NADPH U YP_400611 [19]
elongatus PCC 7942
OsFAR a Oryza sativa NADPH C16:0, C16:1 AK121254 [20]

OsFARXIII a Ostrinia scapulalis U C14:1 EU817405 [21]

Pp-luxC b Photobacterium NADPH U L21989 [22]

phosphoreum
NADPH /
PsFAR1 a U None [23]
NADH
Pisum sativum
b NADPH /
PsFAR2 U None [23]
NADH

C20:1, C22:1,
ScFAR a Simmondsia chinensis NADPH AF149917 [24]
C24:1

sll0209 b Synechocystis sp. U U NP_442146 [19]

PCC6803
TaFAR1 a NADPH C14:0, C16:0 JN638549 [14]
Tyto alba
TaFAR2 a NADPH C18:0 JN638550 [3]

C18:1, C20:1,
a
TaTAA1a Triticum aestivum U C22:1, C24:0, AJ459249 [25]
C26:0

Yponomeuta C14:0, C14:1,

YepgFA a R U GQ907232 [26]
evonymellus C16:0, C16:1

C14:0, C14:1,
YppgFAR a Yponomeuta padellus U GQ907235 [26]
C16:0, C16:1

C14:0, C14:1,
YrpgFAR a Yponomeuta rorrellus U GQ907234 [26]
C16:0, C16:1
* Tipo A, reducción de acil-CoA reductasa grasa de cuatro electrones que genera alcohol graso. Tipo B, reducción de dos electrones de acil-CoA reductasa grasa que
genera aldehído graso. # Las especificidades de sustrato de FAR se obtuvieron de estudios in vitro de enzimas FAR o se dedujeron de la expresión de FAR en sistemas
nativos o heterólogos
 68 Anser anser domesticus AdFAR1a
99 Gallus gallus GgFAR1a
99 Tyto alba TaFAR1a
Homo sapiens HsFAR1a
99 99 Mus musculus MmFAR1a
99 Gallus gallus GgFAR2a
78 Tyto alba TaFAR2a
73 Homo sapiens HsFAR2a
99 Mus musculus MmFAR2 a
Marinobacter aquaeolei VT8 MaFARa
99 Apis mellifera AmFAR1a
Calanus finmarchicus CfFAR3a
Acinetobacter calcoaceticus Acr1b
Euglena gracilis EgFARa
Calanus finmarchicus CfFAR1a
83 Yponomeuta evonymellus YepgFARa
99 Yponomeuta padellus YppgFARa
94 Yponomeuta rorrellus YrpgFARa
Arabidopsis thaliana AtMS2a
Marinobacter aquaeolei VT8 Maqu 2220a
85 Arabidopsis thaliana AtFAR6a
99 Synechocystis sp. PCC6803 Sll0209b
Synechococcus elongatus PCC7942 Orf1594b
85 Oryza sativa OsFARa
a
99 Ostrinia nubilalis OnpgFAR-E a
Ostrinia scapulalis OsFARXIII
83 Ostrinia nubilalis OnpgFAR-Za
Arabidopsis thaliana AtCER4a
99 Triticum aestivum TaTAA1aa
Photobacterium phosphoreum Pp-luxCb
99 Artemisia annua AaTFAR1a
Simmondsia chinensis ScFARa
99 Bombyx mori BmFARa
53 Calanus finmarchicus CfFAR2a
99 Arabidopsis thaliana AtFAR1a
66
Arabidopsis thaliana AtFAR4a
99 Arabidopsis thaliana AtFAR5a
99 Arabidopsis thaliana AtFAR8a

0.2

Figura S1 Relaciones filogenéticas de las acil-CoA (o acil-ACP) reductasas grasas informadas. Los árboles fueron
construidos por el método de unión vecino. Los números en cada punto de ramificación son los valores de
arranque para los porcentajes de 1000 árboles replicados; solo se muestran valores> 50%. Marinobacter
aquaeolei VT8 Maqu_2220 y Synechocystis Sll0209 son de diferentes colores. Entre todas las acil-CoA (o acil-
ACP) reductasas grasas (FAR) informadas, Maqu_2220 es la FAR procariótica que reveló una estrecha relación
con las FAR cianobacterianas. a. Las FAR de tipo A que catalizan reducciones de 4 electrones; segundo. Las FAR
de tipo B que catalizan reducciones de 2 electrones.

Wahlen et al . [ 35 ] caracterizaron una enzima (Maqu_2220) que realiza la reducción de aldehídos grasos a
alcoholes grasos de Marinobacter aquaeolei VT8 (en lo sucesivo, M. aquaeolei VT8). Ellos designaron Maqu_2220
una aldehído reductasa grasa (FALDR) ya que podría convertir los aldehídos grasos en alcoholes grasos a través
de un experimento in vitro [ 35 ]. Más tarde, Hofvander et al . realizó otro ensayo in vitro e informó
contradictoriamente que Maqu_2220 podría no solo catalizar la conversión de aldehídos grasos en alcoholes
grasos, sino también catalizar la reducción directa de acil-CoA grasos (o acil-ACP) a alcoholes grasos [ 36 ]. In
vivo , sin embargo, todavía no está claro qué esquema es el principal contribuyente para la síntesis de alcohol
graso por Maqu_2220. El gen maqu_2220 se expresó en Escherichia coli (E. coli) y se produjo un notable nivel de
alcoholes grasos (1.725 g / l) en una cepa mutante optimizada de E. coli en condiciones de fermentación [ 37 ]. En
un documento reciente, Saccharomyces cerevisiae también se diseñó para producir alcoholes grasos (casi 100
mg / l en 168 horas) al sobreexpresar la acil-CoA reductasa grasa de ratón (mFAR1) [ 38 ].

Las cianobacterias no tienen vías nativas de síntesis de alcohol graso. La producción de alcoholes grasos en
cianobacterias se investigó en nuestro estudio anterior mediante la expresión heteróloga de la acil-CoA
reductasa grasa (FAR) de ratón, jojoba ( Simmondsia chinensis ) y Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ). Hasta 9.73
± 2.73 μg OD 730 -1 L -1 de alcohol graso se obtuvo en la cepa Synechocystis que expresa el gen jojoba FAR [ 15 ]. El
rendimiento de alcohol graso en cianobacterias se incrementó a aproximadamente 761 ug / g de masa seca
mediante el bloqueo de la síntesis de glucógeno y la síntesis de poli-3-hidroxibutirato (PHB), así como mediante
la sobreexpresión de los genes FAR [ 39 ]. Sin embargo, en comparación con E. coliy levadura, la construcción de
la ruta biosintética del alcohol graso en cianobacterias todavía está en su infancia. Por lo tanto, se necesita más
trabajo de ingeniería genética para mejorar la producción de alcohol graso de cianobacterias, como la
introducción de los nuevos genes FAR en hospedadores de cianobacterias o la interrupción de la vía competitiva.

En este estudio, el gen maqu_2220 se expresó heterólogamente en Synechocystis para la producción de

alcoholes grasos. Con el fin de mejorar la síntesis de alcohol graso, la acil-ACP reductasa (codificada por sll0209 )
y aldehído-deformilante oxigenasa (codificada por sll0208 ) en la ruta de biosíntesis de alcanos grasos se
eliminaron en la cepa Synechocystis que expresa maqu_2220 (Figura 1 B). Estos enfoques dieron como resultado
un aumento significativo de la producción de alcohol graso de cianobacterias, que alcanzó hasta 2,87 mg / g de
peso seco.

Resultados y discusión

Producción de alcoholes grasos mediante la expresión heteróloga del gen maqu_2220 en Synechocystis
El gen maqu_2220 de M. aquaeolei VT8 se expresó bajo el control del promotor P petE (secuencias de nucleótidos
enumeradas en el archivo adicional 3 ); el cassette Omega [ 40 ] que alberga un gen de resistencia a la
espectinomicina se usó como un marcador de selección (Figura 2 A). La cepa mutante Syn-FQ52 se obtuvo por
transformación de Synechocystis con el plásmido pFQ52. El casete de expresión se integró en el locus slr0168 del
genoma mediante recombinación doble homóloga.
La integración del cassette de expresión y la segregación completa de la cepa mutante se confirmaron mediante
análisis de PCR (ver archivo adicional 4 : figura S2).

A B C D E
bp 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2
7000 8000
6000
5000
4000
3000
2000

1000

Figura S2 Análisis de PCR de las cepas mutantes.

A, PpetE-t y faldr-2 se usaron como par de cebadores para comprobar si las construcciones de ADN se habían
introducido o no. B, faldr-1 y 0168-2 se usaron como par de cebadores para comprobar si las construcciones de
ADN se introdujeron en el locus slr0168. C, 0168-1 y 0168-2 se usaron como par de cebadores para probar la
segregación completa de la cepa mutante. D, D0208-F y D0208-R se usaron como par de cebadores para probar
la interrupción completa de sll0208. E, Dsll0209-1 y D0809-R se usaron como par de cebadores para probar la
interrupción completa de sll0208 y sll0209. Carril 1-3 (en A, B y C): PCR que usa ADN genómico de Synechocystis
tipo salvaje (control negativo), Syn-FQ52 y Syn-FQ52D08 como plantillas respectivamente. Carril 1-3 (en D): PCR
que usa ADN genómico de Synechocystis tipo silvestre (control negativo), Syn-D08 y Syn-FQ52D08 como
plantillas respectivamente. Carril 1-2 (en E): PCR que usa ADN genómico de Synechocystis de tipo salvaje (control
negativo) y Syn-FQ52D0809 como plantillas respectivamente.

Los alcoholes grasos más abundantes en Syn-FQ52 son hexadecanol y octadecanol, que son los mismos que en
la cepa que expresa la jojoba FAR [ 15 ]. Syn-FQ52 fue capaz de producir alcoholes grasos con un rendimiento
de 0,21 ± 0,03 mg / g de peso seco (DW), 0,29 ± 0,04 mg / g DW y 0,39 ± 0,06 mg / g DW en total después del
cultivo para 140, 274, y 384 horas, respectivamente. No se detectó alcohol graso en la cepa Synechocystis de tipo
salvaje (Figuras 3 y 4 B).

Figura 2 Expresión del gen maqu_2220 e interrupción del gen sll0208 / sll0209 en Synechocystis.
(A) Representación esquemática de la recombinación para integrar el casete de expresión del
gen maqu_2220 en el locus slr0208 . slr0168 -5 '(o slr0168 -3'), el extremo 5 '(o 3') de slr0168 que se
usó para integrar el casete de expresión en el locus slr0168 mediante recombinación doble
homóloga. Omega, gen de resistencia a la espectinomicina. (B) Interrupción
de sll0208 en Synechocystis. sll0208 -5 '(o sll0208 -3'), el extremo 5 '(o 3') del gen sll0208 utilizado para
integrar el gen de resistencia a la kanamicina en el locus sll0208 mediante recombinación doble
 homóloga. C.K2, el casete génico que contiene un gen de resistencia a kanamicina. (C) Interrupción
de sll0208 y sll0209 en Synechocystis. El extremo 5 'de sll0208 y el extremo 3' de sll0209 ( sll0209 -3 ') se
usaron para integrar el gen de resistencia a kanamicina en el locus sll0208 y sll0209 mediante
recombinación doble homóloga. C.K2, el casete génico que contiene un gen de resistencia a
kanamicina. P petE , el promotor del gen petE .

figura 3 Análisis GC-MS de alcanos, alcoholes grasos y ácidos grasos libres en Synechocystis de tipo
natural y Syn-FQ52D08. Picos: (1) ácido palmítico; (2) ácido palmitoleico; (3) ácido heptadecanoico; (4) ácido
esteárico; (5) ácido oleico; (6) ácido linoleico; (7) ácido linolénico. El eicosane, el pentadecanol y el ácido
heptadecanoico se usaron como estándares internos para el análisis de alcanos, alcoholes grasos y ácidos grasos
libres, respectivamente. 6803WT: la cepa salvaje de Synechocystis ; Syn-FQ52D08: la cepa con eliminación
de sll0208 y expresión de maqu_2220 .
Figura 4 Contenido y composición de
derivados de ácidos grasos en el
mutante y el Synechocystis de tipo
silvestre . (A) Curvas de crecimiento de
WT, Syn-D08, Syn-FQ52, Syn-FQ52D08 y
Syn-FQ52D0809; (B) producción de
alcohol graso en las cepas
mutantes Synechocystis ; (C) Producción
total de ácidos grasos libres
en Synechocystis WT y cepas mutantes. Las
barras de error indican la desviación
estándar (n = 3). WT: la cepa salvaje
de Synechocystis ; Syn-D08: la tensión con
eliminación de sll0208 ; Syn-FQ52: la cepa
con expresión de maqu_2220 ; Syn-
FQ52D08: la cepa con eliminación
de sll0208 y la expresión
de maqu_2220 ; Syn-FQ52D0809: la cepa
con expresión de maqu_2220 y doble
knockout de sll0208 y sll0209 .
Se demostró que FAR Maqu_2220 bacteriano tiene una amplia actividad de sustrato hacia acil-CoA grasos y
aldehídos grasos con diferentes longitudes de cadena de carbonos e insaturación [ 35 , 36 ]. Sin embargo, no se
detectaron alcoholes grasos insaturados en nuestras cepas de Synechocystis que expresan maqu_2220 . Sugiere
que el perfil de alcoholes grasos no solo depende de la especificidad del sustrato de FAR, sino que también
puede estar fuertemente influenciado por el organismo huésped.

La eliminación del gen de oxigenasa aldehído-deformilante de la vía de biosíntesis de hidrocarburos

afectó a la producción de alka (e) ne y ácidos grasos
El gen ADO sll0208 tanto en Synechocystis de tipo salvaje como en Syn-FQ52 se inactivó insertando un gen de
resistencia a la kanamicina en el medio del gen sll0208 (Figura 2 B), generando Syn-D08 y Syn-FQ52D08,
respectivamente. El reemplazo del gen fue confirmado por ensayo de PCR. Solo se amplificó una única banda de
3,3 kb del ADN genómico de la cepa mutante sll0208 . El tamaño de la banda no es el mismo que en el control
de tipo salvaje (ver archivo adicional 4 : figura S2). Esto indica que el mutante sll0208 estaba completamente
segregado y el gen sll0208 estaba completamente alterado.

Syn-FQ52 mostró similar grasa alka (e) ne y las acumulaciones de ácidos grasos libres como el tipo
silvestre Synechocystis(archivo adicional 5 : Figura S3 y la Figura 4 C). Alka grasa (e) nes tomó una gran
proporción de todos los derivados de ácidos grasos en Synechocystis (archivo adicional 5 : Figura S3C y
D). Heptadecano y heptadeceno fueron los hidrocarburos más abundantes en la Synechocystis de tipo
salvaje. Por el contrario, no se detectaron hidrocarburos en Syn-D08 y Syn-FQ52D08, lo que indica que la ruta
de la biosíntesis de alka (e) ne se inactivó completamente por la disrupción de sll0208 .

A
2.4
Production of Hydrocarbons (mg/g DW)

2.2 Heptadecane
2.0 Heptadecene
1.8 Total
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
WT D0
8 52 08 809 WT D0
8 52 08 809 WT D0
8 52 08 809
FQ 52D D0 FQ 52D D0 FQ 52D D0
FQ FQ52 FQ FQ52 FQ FQ52

140 hours 274 hours 384hours

 C16:0
B 25 C16:1
C18:0
20 C18:1
C18:2
140 hours
Production of Free Fatty Acids (mg/g DW)

15 C18:3
Total
10
5
0
WT D08 FQ52 FQ52D08 FQ52D0809
25
20
15 274 hours
10
5
0
WT D08 FQ52 FQ52D08 FQ52D0809
25
20
15 384 hours
10
5
0
WT D08 FQ52 FQ52D08 FQ52D0809

C Total free fatty acids

Total hydrocarbons
22
Total fatty alcohols
20
Total fatty acid derivatives (mg/g DW)

18
16
14
12

10
8
6
4
2
0
WT 8 2 8 9 WT 8 2 8 9 WT 8 2 8 9
D0 FQ5 52D0 D080 D0 FQ5 52D0 D080 D0 FQ5 52D0 D080
FQ FQ52 FQ FQ52 FQ FQ52
140 hours 274 hours 384hours
 D Total free fatty acids
Total hydrocarbons
80 Total fatty alcohols
Total fatty acid derivatives (μmol/g DW)

70

60

50

40

30

20

10

0
WT D0
8 52 08 09 WT D0
8 52 08 09 WT D0
8 52 08 09
FQ Q52D 2D08 FQ Q52D 2D08 FQ Q52D 2D08
F 5 F 5 F 5
FQ FQ FQ
140 hours 274 hours 384hours

Figura S3 Contenido y composición de derivados de ácidos grasos en el mutante y el Synechocystis de

tipo silvestre. A, Contenido y composición de hidrocarburos en el mutante y el tipo silvestre Synechocystis
cultivadas durante 140, 274 y 384 horas, respectivamente. B, Contenido y composición de ácidos grasos
libres en el mutante y Synechocystis de tipo silvestre cultivados durante 140, 274 y 384 horas,
respectivamente. C, Contenido y composiciones de derivados totales de ácidos grasos en diferentes cepas
Synechocystis. D, La composición y la cantidad total de cadenas de acilo graso (alcohol graso,
hidrocarburo y ácido graso libre) en estas cepas Synechocystis.

Como se bloqueó la síntesis de hidrocarburos, se suponía que se acumularía una gran cantidad de aldehídos
grasos en las cepas de deleción sll0208 . Sin embargo, no se detectó ningún aldehído graso (archivo adicional 6 :
figura S4) en Syn-D08 y Syn-FQ52D08 basado en el método de extracción y cromatografía de gases-
espectrometría de masas (GC-MS) en este estudio.Como controles, los aldehídos grasos puros demostraron ser
bastante estables bajo los mismos procedimientos de extracción y análisis (archivo adicional 7 : figura S5).

Figura S4 Detección de aldehído graso en las cepas mutantes usando GC-MS.

Los extractos de las cepas mutantes se analizaron usando GC-MS. El hexadecanal y el octadecanal fueron
elegidos como los estándares de aldehídos grasos externos y pasaron por el mismo programa GC-MS. El
resultado muestra que no se detectó hexadecanal u octadecanal en el tipo salvaje ni en las cepas mutantes de
Synechocystis.
 25.5 26.0 26.5 27.0 27.5 28.0 28.5
7
1.0x10 Syn-FQ52D0809
6
5.0x10

0.0
7
1.0x10 Syn-FQ52D08
6
5.0x10

0.0
7
1.0x10 Syn-FQ52
Intensities

6
5.0x10

0.0
7
1.0x10 6803WT
6
5.0x10

0.0
7
1.0x10 Syn-D08
6
5.0x10

0.07
2x10
Fatty aldehyde standards
7
1x10 Hexadecanal
Octadecanal
0
25.5 26.0 26.5 27.0 27.5 28.0 28.5

Rentention time (min)

Figura S4 Detección de aldehído graso en las cepas mutantes usando GC-MS.

Los extractos de las cepas mutantes se analizaron usando GC-MS. El hexadecanal y el octadecanal fueron
elegidos como los estándares de aldehídos grasos externos y pasaron por el mismo programa GC-MS. El
resultado muestra que no se detectó hexadecanal u octadecanal en el tipo salvaje ni en las cepas mutantes de
Synechocystis.
 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
6
2x10
FFA standards C16:0 FFA C18:0 FFA
6
1x10

0
Water extraction
6
2.0x10

0.0
-1
200 g L extraction
Intensities

6
2.0x10 Hexadecanal Octadecanal

0.0
-1
6
50 g L extraction
2.0x10 Hexadecanal Octadecanal

0.0
10-hour air exposition
6
5.0x10 Hexadecanal
Octadecanal
0.0
2-hour air exposition
6
5.0x10 Hexadecanal
Octadecanal
0.0
1-hour air exposition
6
5.0x10 Hexadecanal
Octadecanal
0.0
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Rentention Time (min)

Figura S5 Confirmación experimental de la estabilidad del procedimiento de extracción de aldehídos grasos al

aire y lípidos. Para probar la oxidación del aldehído graso durante las condiciones experimentales, se analizó la
estabilidad del aldehído graso al aire libre y los procedimientos de extracción de grasa usando GC. Una solución
de aldehído graso puro de hexadecanal y octadecanal se expuso al aire libre durante 1, 2 o 10 horas antes del
análisis. El resultado muestra que hexadecanal y octadecanal fueron bastante estables y no se oxidaron en ácidos
grasos en 10 horas. Para evaluar la influencia del proceso de extracción de lípidos, se prepararon dos
concentraciones de solución hexadecanal y octadecanal (50 g L-1 y 200 g L-1) y se trataron con el método de
extracción de cloroformo y metanol; un control (extracción de agua) para la extracción de lípidos que también
utiliza agua en lugar de cultivo celular. En las dos muestras, la abundancia de aldehído graso disminuyó después
del proceso de extracción, sin embargo, el proceso de extracción de lípidos no condujo a la acumulación de
ácidos grasos en comparación con el control. FFA: ácidos grasos libres; C16: 0 FFA: ácido hexadecanoico; C18: 0
FFA: ácido octadecanoico; Exposición de aire durante 1 hora: solución de aldehído graso expuesta al aire libre
durante 1 hora

Una posibilidad es que los aldehídos grasos generados fueron oxidados por el aldehído deshidrogenasa
recientemente descubierto en cianobacterias [ 26 , 41 ]. Kaiser et al. detectó aldehído graso en S. elongatus PCC
7942 con sobreexpresión de la acil-ACP reductasa grasa (codificada por orf1594 ) y la deleción de la aldehído
deshidrogenasa (codificada por orf0489 ) [ 41]. El ortólogo de Orf0489 en Synechocystis , Slr0091, también se ha
demostrado que posee la actividad de convertir el aldehído graso en ácidos grasos [ 26 ]. Por lo tanto, existe la
posibilidad de que los aldehídos deshidrogenasa hayan convertido eficientemente los ácidos grasos en aldehídos
grasos acumulados en Syn-D08 y Syn-FQ52D08. De acuerdo con esto, el total de ácidos grasos libres en Syn-
D08 y Syn-FQ52D08 aumentó dramáticamente en comparación con la cepa WT (Figura 4 C).Además, como
intermediario de la ruta del ácido graso, los aldehídos grasos son probablemente tóxicos para las cianobacterias,
por lo que las cianobacterias pueden poseer únicamente un bajo nivel de grupos de aldehídos grasos
intracelulares.

La producción mejorada de alcoholes grasos en Synechocystis mediante la eliminación del gen sll0208
Por inactivación del gen sll0208 , no se detectó hidrocarbono y el flujo metabólico se redirigió a la síntesis de
alcoholes grasos.La Figura 4 B muestra el rendimiento de alcohol graso en las cepas mutantes y de tipo silvestre
de cultivo de Synechocystisdurante 140, 274 y 384 horas. El rendimiento de alcoholes grasos en Syn-FQ52D08
mostró un aumento significativo (2.8, 3.6 y 2.3 veces mayor en Syn-FQ52 a 140, 274 y 384 horas,
respectivamente), alcanzando hasta 0.6 ± 0.06, 1.03 ± 0.21 y 0.91 ± 0.05 mg / g DW (Figura 4 B). La productividad
de alcohol graso informó aquí tuvo una mejora significativa en comparación con la de Syn-XT14 (9,73 ± 2,73 μg
OD 730 -1 L -1 ) como previamente publicado por nuestro laboratorio [ 15 ].

El contenido de ácidos grasos libres (FFA) también se incrementó en Syn-FQ52D08 (Figura 4 C), que fue
aproximadamente 3,4 veces, 4 veces y 7 veces mayor en comparación con la de Syn-FQ52, respectivamente. Por
el contrario, el contenido de FFA en Syn-D08 solo aumentó ligeramente en comparación con el de Synechocystis
de tipo salvaje (Figura 4 C). Más obviamente, las cadenas totales de acilo graso (alcohol graso, hidrocarburo y
ácido graso libre) en Syn-FQ52D08 fueron mucho más que eso en Syn-FQ52 y Syn-D08 (archivo adicional 5 :
Figura S3D). Sugiere que se podría generar más flujo de carbono en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos
mediante la expresión de Maqu_2220 y la alteración del gen sll0208 en Syn-FQ52D08.

Un aumento adicional en la producción de alcohol graso por doble knock-out de sll0208 y sll0209
Aunque se ha demostrado que Maqu_2220 de M. aquaeolei VT8 cataliza tanto la reducción de acil-CoA graso (o
acil-ACP) a alcoholes grasos como la reducción de aldehídos grasos a alcoholes grasos [ 35 , 36 ], no estaba claro
qué vía (Figura 1 B) contribuye al aumento de alcoholes grasos en la cepa mutante Syn-FQ52D08. La cepa
mutante Syn-FQ52D0809 se construyó con la desactivación del gen sll0208 y sll0209 en Syn-FQ52 (Figura 2 C).

La Figura 4 A comparó el crecimiento de las cepas mutantes y de tipo salvaje de Synechocystis . Se puede
encontrar que Syn-D08 y Syn-FQ52 mostraron una tendencia de crecimiento similar a la de tipo salvaje, mientras
que los mutantes Syn-FQ52D08 y Syn-FQ52D0809 exhibieron la tasa de crecimiento ligeramente menor. La
Figura 4B mostró un aumento adicional en la producción de alcohol graso mediante la eliminación tanto del gen
sll0208 como del sll020 9. El rendimiento de alcohol graso en Syn-FQ52D0809 fue de 2.87 ± 0.29, 1.96 ± 0.28 y
1.76 ± 0.27 mg / g DW después de 140, 274 y 384 horas de cultivo, respectivamente (5, 1.9 y 1.93 veces el
rendimiento de alcohol graso en Syn-FQ52D08, respectivamente). Excepto por la inactivación de la síntesis
de ácido graso (e) ne, la eliminación de sll0209 bloquearía la síntesis de aldehídos grasos así como su síntesis de
ácidos grasos aguas abajo que es catalizada por la aldehído deshidrogenasa grasa. La producción mejorada de
alcoholes grasos podría atribuirse al aumento del grupo acilo-CoA graso (o acil-ACP) en Synechocystis por la
inactivación de sll0208 y sll0209 .

Syn-FQ52, Syn-FQ52D08 y Syn-FQ52D0809 mostraron diferentes tendencias de la productividad de alcohol

graso en los tres puntos temporales. El rendimiento de alcoholes grasos de Syn-FQ52 mostró un aumento
continuo durante los 16 días de cultivo, mientras que la productividad de alcohol graso en Syn-FQ52D0809
disminuyó a medida que aumentaba el crecimiento celular. Syn-FQ52D08 mostró una tendencia diferente en la
productividad de alcohol graso. Fue de 0.6 ± 0.06 mg / g DW a las 140 horas y posteriormente alcanzó un
máximo a las 274 horas (1.03 ± 0.21 mg / g DW), seguido de un ligero descenso a las 384 horas (0.91 ± 0.05 mg
/ g DW). Esto indica que la síntesis de alcohol graso está relacionada con el genotipo de las cepas y sus fases de
crecimiento. Además, también encontramos que las cepas recientemente transformadas proporcionaron una
mejor producción de alcohol graso. Estos resultados indican que pueden existir mecanismos desconocidos para
la regulación de la síntesis heteróloga de alcohol graso en cianobacterias.

La proporción de ácidos grasos, alcanos grasos y alcoholes grasos en todas las cepas se compararon en el archivo
adicional 5 : Figura S3. En la cepa Syn-FQ52D0809, los alcoholes grasos comprendían aproximadamente el 40%
de las cadenas de acilo graso (archivo adicional 5 : figura S3C). En otro aspecto, sin embargo, se encontró que la
eliminación de sll0208 puede elevar dramáticamente el porcentaje de ácidos grasos. Por ejemplo, Syn-D08
produjo principalmente aproximadamente 99% de ácidos grasos, mientras que Syn-FQ52D08 produjo
aproximadamente 95% de ácidos grasos y 5% de alcoholes grasos. Estas cepas pueden desempeñar un papel
importante en la producción de biocombustibles a base de ácidos grasos en las cianobacterias en el futuro.

En comparación con las bacterias heterótrofas tales como E. coli y levadura, la productividad actual del alcohol
graso por las cianobacterias es todavía demasiado baja. Se pueden aplicar varios enfoques adicionales para
mejorar la eficiencia de ingeniería de Synechocystis . En primer lugar, la expresión del gen heterólogo puede
mejorarse optimizando el uso de codones sinónimos para que coincida mejor con el huésped cianobacteriano
[ 42 ]. En segundo lugar, la biosíntesis del alcohol graso se puede mejorar mediante la introducción de más flujo
metabólico. El bloqueo de la vía competitiva de la síntesis de PHB y la síntesis de glucógeno puede conducir el
flujo metabólico hacia la síntesis de alcohol graso [ 39 ]. Atsumi et al. mostró sobreexpresión de ribulosa 1,5-
bisfosfato carboxilasa / oxigenasa (RuBisCO) mejora cianobacteriana isobutiraldehído y alcohol isobutanol
biosíntesis [ 43 ]. También sería beneficioso para la síntesis de alcoholes grasos de cadena larga. En tercer lugar,
la condición de cultivo también se puede mejorar mediante el uso de una mayor intensidad de luz (en la última
fase de crecimiento) y una mayor concentración de CO 2 [ 15 , 43 ]. En un cultivo a gran escala y con mayor
densidad celular, la luz y el CO 2 pueden ser factores limitantes para la biosíntesis de cianobacterias. De este
modo, las condiciones mixotróficas pueden ser una solución alternativa. Por ejemplo, Synechocystis puede
absorber acetato para la síntesis de acetil-CoA [ 44 ] y mejorar el rendimiento del producto, por lo que se puede
emplear un sustrato de carbono barato para la biorefinería fotográfica.

Conclusiones

En este estudio, la biosíntesis de alcoholes grasos se logró mediante la expresión de un gen graso acyl-CoA
reductasa maqu_2220 de M. aquaeolei VT8. El doble knockout de los nativos sll0208 y sll0209 implicados en la
vía de biosíntesis de alcanos en Synechocystis mejoró la producción de alcoholes grasos. Los resultados indican
que la eliminación de las rutas competitivas para la biosíntesis de alcohol graso podría mejorar significativamente
el rendimiento del producto.

Las diversas grasas acyl-CoA (graso acyl-ACP) reductasas (archivo adicional 3 : Tabla S1, archivo adicional 1 :
figura S1) muestran un gran potencial para modular molecularmente el producto de alcohol graso con la longitud
deseada de la cadena y el grado de saturación, y proporciona viabilidad para lograr la producción deseada de
biocombustibles y bioquímicos a base de alcohol graso. Aún se necesitan modificaciones adicionales de la red
metabólica hacia la biosíntesis de ácidos grasos para la mejora significativa y la aplicación de la producción de
alcohol graso fotosintético en cianobacterias.

Métodos

Plásmido y cepa de construcción

El gen procariota graso acyl-CoA reductasa maqu_2220 de M. aquaeolei VT8 (DSM 11845, comprado en
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) se amplificó por PCR usando el par de cebadores
faldr-1 y faldr-2 (archivo adicional 8: tabla S2) . Se subclonó en el vector de clonación pMD18-T (Takara Co., Ltd,
Kyoto, Japón) dando como resultado pXT71. El fragmento maqu_2220 en pXT71 se digirió con Nde I / Xho I
(Takara Co., Ltd, Kyoto, Japón) y se ligó al mismo sitio de pXT37b [ 15 ] generando el vector de expresión
pFQ52. Entonces pFQ52 se transformó en la cepa salvaje de Synechocystis .Transformación de Synechocystis se
realizó como se describe anteriormente [ 15 ].

El plásmido pD0208 se construyó para romper el gen sll0208 mediante recombinación homóloga
en Synechocystis. Un fragmento de ADN de 2,4 kb, que incluye el marco de lectura abierto (ORF) y las regiones
flanqueantes cadena arriba y cadenaabajo de sll0208 , se amplificó por PCR a partir del ADN genómico
de Synechocystis usando los cebadores D0208-F y D0208-R. Este fragmento se clonó en el vector pGEM-T easy
(Promega, EE. UU.) Generando pGEMT-D0208. El plásmido pGEMT-D0208 se digirió con Hind III (Takara Co., Ltd,
Kyoto, Japón), se hizo romo por la ADN polimerasa T4 (Thermo Scientific, EE. UU.) Y se ligó con el casete de gen
de resistencia a kanamicina C.K2 [ 45 ], que amplificado a partir del plásmido pRL446 [ 45 ] utilizando los
cebadores C.K2-NF y C.K2-NR (archivo adicional 8 : Tabla S2), generando el plásmido pD0208. El plásmido pLY76
se construyó para alterar tanto el gen sll0208 como el sll0209 en Synechocystis . Dos fragmentos de ADN de 1,1
kb que incluyeron la región flanqueante corriente arriba de sll0208 y la región flanqueante corriente abajo
de sll0209 se amplificaron usando pares de cebadores D0809-1 / D0809-2 y D0809-3 / D0809-4 (Archivo
adicional 8 : Tabla S2), respectivamente . Los dos fragmentos de ADN que contienen una región de solapamiento
de 33 pb se usaron como plantillas para amplificar un fragmento de ADN de 2,3 kb. El fragmento fusionado se
subclona en pMD18-T que genera pLY75. El casete de C.K2 del plásmido pRL446 [ 45 ] se subclonó en el sitio
BamHI romo de pLY75 para generar el plásmido pLY76. El plásmido pD0208 y pLY76 se transformaron
en Synechocystis para la integración homóloga. El solo knockout del gen sll0208 y el doble knockout
de sll0208 y sll0209 se verificaron mediante PCR.

Condiciones de cultivo Synechocystis

Todas las cepas de Synechocystis se cultivaron a 30 ° C en matraces de 500 ml que contenían 450 ml de medio
BG11 burbujeado con aire bajo luz fluorescente constante a una intensidad de 30 a 50 μE m -2 s -1 . Las células se
cultivaron durante 16 días en total y se tomaron muestras a las 140, 274 y 384 horas para la medición de alcoholes
grasos. Se añadió espectinomicina (20 μg mL -1 ) y / o kanamicina (20 μg mL -1 ) (Solarbio, Beijing, China) al medio
cuando fue necesario. La correlación entre el peso seco de la celda (DW) y la densidad óptica (DO) de las
células Synechocystis se confirmó midiendo el OD 730 y el peso seco de la celda (ver archivo adicional 9 : figura
S6 y archivo adicional 10 : tabla S3).
 0.20
Cell Dry Weight (gL OD730 )
-1

0.15
-1

0.10

6803WT
Syn-D08
Syn-FQ52
0.05
Syn-FQ52D08
Syn-FQ52D0809

0.00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

OD730

Figura S6 La correlación entre el peso de la celda seca (DCW) y la densidad óptica de las células Synechocystis.

Para calcular los pesos de las células secas de las cinco cepas Synechocystis mostradas en la figura anterior, se
prepararon 20 ml de cultivo celular de cada cepa en cinco puntos de tiempo. Todas las muestras se recogieron
por triplicado en cada punto de tiempo. Cada punto de tiempo es el peso promedio de células secas de los
triplicados. Las barras de error representan el error estándar de la media. OD730: la densidad óptica del cultivo
de Synechocystis a 730 nm

Tabla S3 Factores de conversión de peso de células secas de las cinco cepas en este estudio.

Syn-
Strains 6803WT Syn-D08 Syn-FQ52 Syn-FQ52D08 FQ52D080
9
peso seco de la
célula 187.76 194.49 189.76 167.68 173.31
(mg OD730-1L-1)
6803WT: la cepa salvaje de Synechocystis; Syn-D08: la tensión con eliminación de sll0208; Syn-FQ52: la cepa con
expresión de maqu_2220; Syn-FQ52D08: la cepa con eliminación de sll0208 y la expresión de maqu_2220; Syn-
FQ52D0809: la tensión con la eliminación de sll0208 y sll0209, y la expresión de maqu_2220.
Extracción de lípidos y análisis GC-MS
Se recogieron células de Synechocystis de 150 ml de cultivo por centrifugación, se resuspendieron en 10 ml de
tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y luego se sometieron a lisis por sonicación. El lisado se extrajo
durante 30 minutos a temperatura ambiente con 10 ml de cloroformo-metanol (v / v, 2: 1). Antes de la extracción,
se añadieron 30 μg de 1-pentadecanol, 50 μg de eicosano y 100 μg de ácido heptadecanoico (Sigma Aldrich, EE.
UU.) En el lisado celular como patrones internos (Figura 4 ). La fase orgánica se separó por centrifugación y se
evaporó a sequedad bajo nitrógeno a 55 ° C. La sequedad se disolvió en 1 ml de n-hexano y se analizó una
alícuota de 1-μL mediante GC-MS usando un sistema Agilent 7890A equipado con HP-INNOWax (30 mx 250 μm
x 0.25 μm, Agilent, EE. UU.). Se usó helio (flujo constante 1 ml min -1 ) como gas portador. La temperatura del
inyector era de 250 ° C. Se aplicó el siguiente programa de temperatura: 100 ° C durante 1 minuto, aumento de
5 ° C min -1 a 150 ° C y luego 10 ° C min -1 a 250 ° C, mantener a 250 ° C durante 15 minutos. Los estándares
internos se usaron para determinar el rendimiento del producto, que fue la media de tres experimentos
independientes [ 15 ].

Abreviaciones

AAR: acil-ACP reductasa

ACP: Proteína transportadora de acilo
ALHARACA: Aldehído-deformilante oxigenasa
DW: peso en seco
LEJOS: Acyl-CoA reductasa grasa
FFA: Ácido graso libre
GC-MS: Cromatografía de gases-espectrometría de masas. OD, densidad óptica
PHB: poli-3-hidroxibutirato.