INTRODUCCIÓN

La cromatografía es un método físico de separación basado en la diferencia de distribución de los

componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una móvil y otra estacionaria. Las
moléculas de soluto de la mezcla son retenidas por la fase estacionaria y arrastradas por la fase
móvil, de manera que si los componentes de la mezcla presentan diferentes afinidades por alguna de
las fases, sus velocidades medias de avance a lo largo del sistema serán diferentes. La afinidad
viene determinada por fuerzas de tipo Van der Waals, puentes de hidrógeno o transferencia de
carga. Los componentes que sean fuertemente retenidos por la fase estacionaria se moverán más
lentamente a lo largo de dicha fase que aquellos que se unen débilmente. Como consecuencia de
esta diferencia de movilidad los componentes de la mezcla se separan en bandas discretas, que
pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente mediante el uso de los detectores adecuados.

La cromatografía es una técnica extremadamente

versátil, que permite tanto la separación de
mezclas como la purificación de productos, la
determinación del grado de pureza de un
compuesto, el seguimiento de reacciones o la
detección y caracterización de compuestos. Su
principal ventaja frente a otros métodos de
separación y purificación Fase móvil Fase
estacionaria consiste en que ésta técnica puede
aplicarse a cantidades muy pequeñas de producto
(del orden del µg). En la siguiente tabla se da el
métodos cromatográfico basada en la naturaleza
de la fase móvil:

En la presente práctica se estudiarán el tipo de cromatografía líquida:

 Cromatografía de adsorción en columna (CC)

En esta técnicas la fase móvil está constituida por un líquido, la fase estacionaria por un sólido y el
mecanismo de separación se basa en la diferencia de adsorción de los componentes de la mezcla en
la superficie activa de la fase estacionaria. En la primera (CC) la fase estacionaria se sitúa en un
tubo (columna).
La cromatografía líquida suele emplearse para compuestos de poca volatilidad, tales como
moléculas grandes y altamente polares, a los que no es aplicable la cromatografía de gases.

ANTECEDENTES

La cromatografía en columna es quizás el método más general, utilizado para la separación, a la vez
que para la purificación, de diferentes compuestos orgánicos que se encuentren en estado sólido o
líquido.
En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es decir, el absorbente, se coloca en el
interior de una columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar el paso de sustancias
al exterior de la columna. La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase móvil.
Seguidamente la mezcla orgánica que nos interesa separar la depositamos por la parte superior de la
fase estacionaria, y así la fase móvil podrá ir atravesando el sistema.
Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco a poco saldrán de la columna
cromatográfica, y se recogen en fracciones. Las fracciones menos polares, que son por lo general las
que se retienen poco o nada en el absorbente, serán las primeras en salir de la columna. En cambio,
las sustancias más polares, quedan retenidas por más tiempo en el absorbente, y a menudo es
necesario el uso de diferentes disolventes con la finalidad de incrementar su polaridad para que sean
arrastradas por estos.
El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto por la columna, se conoce con el nombre de
tiempo de retención. Este tiempo varía, siendo característico de cada compuesto en una condiciones
cromatográficas determinadas, que varían según el absorbente usado, el disolvente, la presión, el
diámetro que tenga la columna utilizada, etc.
El absorbente mayormente utilizado para las cromatografías en columna, es el gel de sílice. A
veces, en sustitución del gel de sílice, cuando éste es incompatible con la mezcla a cromatografiar,
se utilizan la alúmina o el florisil (silicato magnésico). La cromatografía en columna puede
realizarse por gravedad o a media presión. Cuando se realiza a media presión, se conecta la cabeza
de la columna a un compresor o a una línea de aire comprimido.La medida de las partículas de gel
de sílice para realizar las cromatografías a media presión debe ser más pequeñas que en el caso de la
cromatografía por gravedad. Si en la cromatografía por gravedad utilizásemos un gel de sílice con
un tamaño de partículas más pequeñas, no se produciría elución, pues se impediría el flujo del
disolvente. Pero en cambio, si aplicamos presión, entonces debido a la fuerza si se produciría la
elución por el disolvente.
A causa de la disminución del tamaño de las partículas del absorbente, se produce una separación
más eficaz. Generalmente la cromatografía a media presión, produce mejores resultados que la
cromatografía por gravedad, y además, al ser más rápida, es la más utilizada.
Cuando vamos a realizar una cromatografía en columna, lo primero que debemos hacer es elegir un
disolvente adaptado para nuestro caso, para así optimizar la separación de los componentes de la
mezcla. Dicha operación se produce a través de cromatografía analítica en capa fina. La variante
más influyente en la eficacia de la separación de la cromatografía a media presión usando gel de
sílice es el diámetro de la columna, así como la cantidad de gel utilizado.

JUSTIFICACIÓN
La cromatografía es probable la mas versátil de las técnicas de separación: es aplicable a cualquier
mezcla soluble o volátil.

Para justificar esta metodología tenemos que emplear conceptos cromatógrafos como: polaridad,
Fase móvil, fase estacionaria, factor de retención,etc. Y el aprendizaje de la técnica de
cromatografía de adsorción.

JUSTIFICACION ACADEMICA:
El material corresponde a la necesidad de estudiar más a fondo un trabajo de investigación que
justifique los conocimientos adquiridos en cromatografía.

Para cumplir este cometido se pretende elaborar un proyecto de factibilidad para la obtención de
colorantes por el método de cromatografía clásica en columna que permita estar mas relacionados
con las características, proceso, visualización y empleo del método de cromatografia.

JUSTIFICACION TECNICA:
Este trabajo de investigación es de gran interés ya que tiene un fin determinado, el de hacer uso de
las características de procesos cromatógraficos, es importante estudiar la cromatografía en columna
ya que ayuda a tener un mejor entendimiento dentro de lo que es el análisis químico utilizado para
separar sustancias puras de mezclas complejas.

MARCO TEORICO

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN EN COLUMNA (CC)

En la figura 1 se muestra esquemáticamente una columna cromatográfica. La fase estacionaria

consiste en un sólido adsorbente
empaquetado en una columna de
vidrio. La mezcla a separar (muestra)
se deposita sobre la superficie
superior de la fase estacionaria
quedando adsorbida en ella. A
continuación, se vierte la fase móvil
(eluyente) en la parte superior de la
columna y se permite su paso a través
de la fase estacionaria. Durante el
proceso cromatográfico los
componentes de la muestra son
arrastrados por la fase móvil a
distintas velocidades efectuándose la
separación. La velocidad de arrastre
de cada componente depende de su
grado de adsorción en la fase
estacionaria y de su afinidad por la fase móvil.
Para que la separación de los componentes de la mezcla sea efectiva, su velocidad de migración a lo
largo de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud de la columna adecuada.
Algunos adsorbentes comúnmente utilizados son: gel de sílice, alúmina, sacarosa y almidón. La fase
móvil consiste en un disolvente o mezcla de disolventes, seleccionado en base a su polaridad con el
fin de optimizar la separación de los componentes de la muestra en la columna. De forma
orientativa se puede establecer el siguiente orden de polaridades para los disolventes usados con
mayor asiduidad:

Éter de petróleo < tetracloruro de carbono < ciclohexano < éter etílico < acetona < benceno <
acetato de etilo < cloroformo < etanol < metanol < agua < piridina < ácido acético Fase Móvil
(eluyente) Muestra Fase Estacionaria (relleno) Placa de vidrio poroso FUNDAMENTOS DE
QUÍMICA-PRÁCTICA 10 4 La fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria debido a la
fuerza de la gravedad.

Preparación de la columna

Se llena la columna hasta un tercio de su altura con eluyente. A continuación se prepara una
suspensión del adsorbente (fase estacionaria) en el eluyente (fase móvil) y se vierte lentamente
(para evitar la formación de burbujas) en el interior de la columna. Esta operación se puede realizar
en varias adiciones, añadiendo más eluyente a la suspensión a medida que sea necesario. Con el fin
de favorecer una distribución más uniforme del adsorbente en la columna, así como eliminar las
pequeñas burbujas que se puedan haber formado, se puede golpear suavemente la pared externa de
la columna con un tubo de goma. La columna se llena hasta aproximadamente la mitad de su altura,
reservándose la parte superior para la fase móvil. Se abre la llave de la columna y se deja fluir el
eluyente hasta que la altura de éste en la columna quede aproximadamente un milímetro por encima
del adsorbente. La superficie de la fase estacionaria debe presentar un aspecto uniforme, liso y
perpendicular al eje longitudinal de la columna.

NOTA: a lo largo del proceso cromatográfico la columna nunca debe “secarse”, esto es, la fase
estacionaria debe encontrarse en todo momento cubierta por la fase móvil, ya que de lo contrario la
fase estacionaria se contraería y agrietaría.

Siembra de la muestra

La muestra se deposita (“siembra”) en la superficie superior del adsorbente contenido en la

columna con la ayuda de una pipeta. Si la muestra es líquida se puede sembrar directamente, si es
sólida se siembra una solución concentrada de la misma en un disolvente adecuado (de baja
polaridad). Para evitar que se deforme la superficie del adsorbente durante la adición, se puede
depositar la muestra en la pared interior de la columna permitiendo que resbale hasta la superficie
del adsorbente. Finalizada la adición de la muestra se abre la llave de la columna y se eluye hasta
que la muestra sea adsorbida y el nivel del líquido quede aproximadamente 1 mm por encima de la
superficie del adsorbente. Se lavan las paredes internas de la columna (por las que se ha dejado
resbalar la muestra) con un poco de eluyente y se eluye de nuevo hasta que el nivel del líquido
vuelva a quedar 1 mm por encima de la superficie del adsorbente.
Desarrollo/Elución de la columna

Una vez sembrada la muestra, se llena la parte superior libre de la columna con el eluyente y se abre
la llave de la columna estableciendo un flujo continuo de la fase móvil. Se van tomando fracciones
consecutivas del eluyente que serán examinadas posteriormente para determinar su composición. A
medida que sea necesario se va adicionando más eluyente a la parte superior de la columna, hasta
que el análisis de las fracciones confirme que la elución de los componentes de la mezcla se ha
completado.

Parámetros que afectan a la separación

1- Fase estacionaria.

Se debe tener en cuenta:

 Actividad o poder adsorbente: la actividad máxima está dada por un mínimo contenido de
moléculas de agua sobre la superficie del adsorbente (idealmente 0 %, aunque en general
se tiene un 5 %). A medida que aumenta el % disminuye la actividad del adsorbente ya que
numerosos sitios activos de su superficie están bloqueados por moléculas de agua.
 Inercia química: el adsorbente no debe reaccionar con las sustancias a separar. Pueden
haber reacciones indeseables de hidrólisis de ésteres, condensaciones aldólicas (con
alúmina), lactonizaciones (con sílice), formación de sales (entre alúmina básica con
componentes ácidos, o entre sílica que posee características ácidas con componentes
básicos), deshidrataciones de grupos funcionales lábiles o catálisis de descomposición,
transposición o isomerización.
 Solubilidad del adsorbente: debe ser totalmente insoluble en el solvente de desarrollo.
 Color: deberá ser incolora.
 Composición: uniforme.
 Tamaño del gránulo: mientras más fina sea la división del adsorbente, mayor es la
superficie de contacto y mayor la adsorción. El tamaño del gránulo debe ser entre 60 y 200
micrones. Menos no es conveniente porque el empacado se hace muy denso y el pasaje
de solvente lento.
 Empaquetamiento: debe ser homogéneo, de lo contrario habría un descenso rápido de las
bandas en zonas menos densas de relleno y el frente de elución sería desparejo, saliendo
los componentes mezclados. Tampoco deben quedar canales, ya que por ellos correrían
más rápidamente las bandas ocasionando el mismo error.
2- Soluto.

La absorbabilidad del soluto depende de su polarizabilidad y su capacidad para formar uniones

puente hidrógeno. Los grupos más polares son los adsorbidos más fuertemente. Orden creciente:
ácidos y bases, alcoholes y tioles, aldehídos y cetonas, halogenuros de alquilo y ésteres,
hidrocarburos insaturados e hidrocarburos saturados. En general el poder de adsorción aumenta
con el incremento de grupos funcionales unidos a la misma molécula, pero existen casos en los
cuales dos grupos funcionales presentes pueden formar uniones puente de hidrógeno y de esta
forma adsorberse menos.

3- Solventes.

Por lo general se comienza la elución con un solvente no polar para remover compuestos
relativamente poco polares de la columna, y luego, gradualmente, aumentar la polaridad del
solvente para forzar a los compuestos de mayor polaridad a descender de la columna, es decir a
eluir. Cuando la polaridad del solvente debe ser cambiada, este paso debe ser gradual, agregando
pequeños porcentajes del nuevo solvente, hasta que el porcentaje alcance el valor deseado. Si no
se procede así, se pueden formar canales o quiebras en la columna.

Es fundamental el uso de solventes anhidros y miscibles. Polaridad creciente de los solventes más
comunes utilizados:

o ETER DE PETROLEO
o CICLOHEXANO TETRACLORURO DE CARBONO
o BENCENO
o CLORURO DE METILENO
o CLOROFORMO
o ETER ETILICO
o ACETATO DE ETILO
o ACETONA
o PIRIDINA
o ETANOL
o METANOL
 o AGUA
4-Velocidad de elución.

Debe ser lo suficientemente lenta para permitir alcanzar el equilibrio adsorción – desadsorción,
pero no al extremo, pues si la muestra difunde más rápidamente que la velocidad a la cual se
escurre hacia abajo en la columna, las bandas se ensanchan. La velocidad ideal es de 2 ml/min.

5- Tamaño de la columna.

La relación altura/diámetro debe ser del órden de 8:1.

6- Cantidad de adsorbente.

Debe ser de 25 a 30 veces en peso respecto de la cantidad del material a separar.

7- Temperatura.

Afecta la volatilidad y la solubilidad de los solventes, por lo tanto debe mantenerse constante a lo
largo de la operación y debe ser homogénea en toda la columna.

APLICACIONES. Se la prefiere para escala preparativa. Se pueden separar los componentes de

extractos de plantas; productos de reacción de trabajos de síntesis. También permite el estudio de
cada fracción obtenida. Algunas ventajas: 1- Cambio secuencial de la polaridad del solvente de
elución. 2- Desplazamiento ilimitado del frente de solvente