UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Unidad Académica de Química Orgánica

GUÍA DEL ESTUDIANTE

Laboratorio de BIOQUÍMICA (QAO-901)
Licenciatura en Química

Coordinador
PROFESOR ARNALDO JOSÉ ARMADO M.
Responsables
PROFESORA MARÍA TAPIZQUENT
PROFESOR LISAMDYS SALAMNACA
Asistente del Laboratorio
LICENCIADA BEATRIZ MOY

Periodo Lectivo II-2016

(Noviembre-Marzo)
 Laboratorio de Bioquímica – Guía del estudiante- Semestre II-2016 Profesor Arnaldo Armado/Licenciada Beatriz Moy

CONTENIDO

Semana Contenido
Elementos teóricos
Tema 1. Ácidos nucleicos (4 h)
Concepto e interés biológico. Clasificación. Bases púricas y pirimidínicas. Nucleósidos y nucleótidos.
Niveles de estructura en los ácidos nucleicos. Estructura de los polinucleótidos. Ácido
desoxirribonucleico (ADN) y su estructura. Desnaturalización de ADN. Ácido ribonucleico (ARN).
1y2 Principales tipos de ARN y sus estructuras.
Introducción a la biosíntesis de ácidos nucleicos. Introducción a la biosíntesis de proteínas. Técnicas de
biotecnología de ácidos nucleicos. Métodos para trabajar con ácidos nucleicos. Herramientas para la
investigación del ADN. Endonucleasas de restricción. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El
ADN recombinante y la clonación. Determinación de la secuencia de bases de ácidos nucleicos.
Tema 2. Técnicas experimentales de análisis de proteínas (2 h)
Técnicas de purificación y caracterización de proteínas. Purificación de proteínas. Centrifugación.
3 Liofilización. Tipos de cromatografía líquida: exclusión molecular, intercambio iónico, afinidad.
Electroforesis. Introducción a la secuenciación de péptidos.
Elementos prácticos
PRÁCTICA Nº 1. ÁCIDOS NUCLEICOS. Extracción de ADN de bacterias del suelo (4 h)
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Extracción de ADN. Efecto hipercrómico. Reconocimiento de Fosfato y desoxi-ribosa en el ADN.
PRÁCTICA Nº 2. CARBOHIDRATOS. Reacciones de reconocimiento de carbohidratos. Aislamiento y
determinación cuantitativa de lactosa en leche. (4 h)
5 Reconocimiento de carbohidratos en una muestra problema. Determinación cuantitativa de
carbohidratos por colorimetría.
PRÁCTICA 3. PROTEÍNAS. Reacciones de reconocimiento de aminoácidos. Aislamiento y
determinación de caseína en leche. Hidrólisis de caseína y determinación cualitativa de sus
6 aminoácidos mediante cromatografía en papel. (4 h)
Solubilidad de proteínas. Métodos de fraccionamiento de proteína. Determinación cuantitativa de
proteínas. Reacciones de reconocimiento de aminoácidos.
PRÁCTICA 4. ENZIMAS. Determinación de peroxidasa de rábano (Raphanus sativus) (4 h)
Reconocimiento y estudios enzimáticos en materiales biológicos. Determinación cuantitativa de una
7 actividad enzimática. Determinación de KM y Vmax. Efecto de temperatura, pH, concentración de
sustrato, entre otros factores que afectan la actividad enzimática.
PRÁCTICA Nº 5. LÍPIDOS. Aislamiento de lípidos totales de la yema de huevo y cuantificación de
colesterol (4 h)
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Extracción de lípidos totales. Identificación de lecitinas y colesterol. Determinación cuantitativa de
lípidos totales y colesterol.
9 y 10 Practica especial. (6 h)

11 PARCIAL (2 h)

12 Recuperación de práctica*. Entrega de notas finales

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 Laboratorio de Bioquímica – Guía del estudiante- Semestre II-2016 Profesor Arnaldo Armado/Licenciada Beatriz Moy

INTRODUCCIÓN
El objetivo de esta guía es el de orientar al alumno de la asigantura Laboratorio de Bioquímica
de la Licenciatura en Química de la Facultad de Ciencias y Tecnología de la Universidad de
Carabobo, en la realización de las prácticas. Se ha diseñado para ello un esquema de prácticas
que permitirá al alumno, mediante la revisión de la bibliografía, diseñar procedimientos para
cumplir con los objetivos planteados en cada práctica.
El laboratorio de bioquímica está enfocado hacia el reconocimiento y la determinación
de biomoléculas (carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos) en diferentes muestras
biológicas. Adicionalmente, se plantea una práctica de enzimas, que permite al estudiante de
bioquímica estudiar y entender cómo se realiza un proceso enzimático.
Para cada una de las prácticas se les plantea los objetivos que se deben lograr y se les
proporciona las referencias bibliográficas que deben consultar. En algunos casos se les plantea
diseñar los diferentes procedimientos a emplear, y en otros se les proporciona el procedimiento
completo para que realicen cada experiencia.

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PRÁCTICA Nº 1. ÁCIDOS NUCLEICOS

Extracción de ADN de bacterias del suelo

Los ácidos nucleicos constituyen macromoléculas fundamentales para las células, pues ellas son
las encargadas de la transmisión de la información genética, de generación en generación. El
ADN es la molécula donde se encuentran codificados todos los genes (genoma) que una célula
puede expresar, mientras que el ARN se involucra en los procesos de trascripción y traducción
de la información biológica.
Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, son polinucleótidos formados por monómeros
llamados nucleótidos. Un nucleótido se compone de un azúcar de 5 átomos de carbono (ribosa
en el ARN y desoxiribosa en el ADN), una base nitrogenada y una molécula de fosfato (PO 43-).
Los genomas presentan una organización diferente en células procariotas y eucariotas.
En las procarióticas, el ADN se encuentra como una larga molécula de dos cadenas formando el
cromosoma bacteriano que se condensa para dar origen a una masa visible llamada nucleoide.
En la mayoría de los organismos procarióticos, el ADN es circular y, en general, poseen un
cromosoma único. Por esta razón contienen una sola copia de cada gen, por lo que son
genéticamente haploides. La mayoría de los procariotas contienen también pequeñas
cantidades de ADN extracromosómico, dispuesto habitualmente de modo circular, que
constituyen los plásmidos.
En células eucariotas, a diferencia de las procariotas, los ácidos nucleicos se encuentran
compartamentalizados, el ADN se encuentra básicamente en el núcleo, asociado a histonas,
constituyendo nucleoproteinas que conocemos como cromosomas. El ARN se encuentra
mayoritariamente en el citoplasma, (ARNr) constituyendo partículas ribonucleoproteicas, los
llamados ribosomas. Otros tipos de ARN se encuentran formando ribonucleoproteínas solubles
en el citoplasma (ARNm) o prácticamente desprovistos de proteínas (ARNt).
El contenido de ADN por célula es constante para todas las células del mismo organismo
mientras que el contenido de ARN varía de acuerdo al tejido y a la condición fisiológica de la
célula. Por ejemplo, el contenido de ADN por célula de ratón es de 4,6 pg, equivalente a 3 x 1012
daltons o 4,6 x 109 pares de bases. (B. Lewin, Gene Expresión. Eucaryotic Chromosomes. J.
Wiley and Sons Ltd. 1974. p.7). Se ha reportado ~4.2 fg de DNA/célula bacteriana, basado en
Kubitschek, HE y Friedman, MC (1971) [Chromosome replication and the division cycle of
Escherichia coli B/r. Journal of Bacteriology. 107:95-99.]

OBJETIVOS
- Aislar ADN de una fuente bacteriana.
- Evidenciar algunas propiedades físicas de los ácidos nucleicos, tales como viscosidad,
absorción de luz ultravioleta, efecto hipercrómico.
- Evidenciar mediante reacciones químicas los diferentes constituyentes de la molécula de ADN.
- Determinar cuantitativamente el contenido de ADN por gramo de bacteria, basado en su
capacidad de absorber luz en la región ultravioleta del espectro electromagnético.

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PROCEDIMIENTO
I. EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS
Esta práctica se efectuará según el protocolo planteado por:
Sims, Branscum, Kao y Keaveny, J. Chem. Edu., 87(10), 1113, 2010.

II. CARACTERÍSTICAS DE LAS MOLÉCULAS AISLADAS

a. Absorción de luz y efecto hipercrómico
Diluya 1,0 mL de la solución de ADN, con 5 mL de NaCl 0,9%, determine la absorbancia a 260 nm
y ajuste la absorbancia a ~1 Unidad/mL. Debe preparar un volumen mínimo de ~6 mL. Luego,
determine la absorbancia a 280 y 320 nm.
Disponga de 1 tubo de ensayo y adicione 3 mL de la solución de ADN preparada. Caliente por 10
min en agua hirviente el tubo 1. Determine la absorbancia a 260, 280 y 320 nm.
Anote sus valores y calcule el cociente A260/A280. ¿A qué se debe el incremento en absorbancia
después del calentamiento?

b. Determinación cualitativa de desoxiribosa

En un tubo de ensayo dispense 0.5 mL de la solución de ADN concentrada, adicione 2,5 mL. De
reactivo de Bial y caliente sobre una plancha, a 100 ºC por 10 min. Observe la coloración verde
característica de pentosa.

c. Determinación cuantitativa de fosfato en ADN

En un tubo de ensayo adicione 0,5 mL de la solución diluida de ADN y 1,0 mL de H2SO4 30% v/v,
caliente vigorosamente sobre un mechero. Observe el oscurecimiento de la solución, adicione
4-5 gotas de peróxido de hidrógeno y continúe calentando hasta que la solución se torne
incolora.
Disponga 6 tubos de ensayo y adicione las soluciones (V en mL) que a continuación se indican:

Mida la absorbancia a 660 nm a cada muestra, ajustando el espectrofotómetro a cero con el

tubo blanco. En base a los volúmenes, diluciones y patrones usados en esta sección, calcule la
cantidad de fósforo en la muestra de DNA. Haga un duplicado de su muestra de DNA.

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III. CÁLCULOS A EFECTUAR

Tomando en consideración:
a) el peso de su cultivo celular (esta información será suministrada en función de la turbidez del
cultivo)
b) Volumen (mL) de cultivo procesado
c) Las diluciones efectuadas, y
d) las absorbancias determinadas

Calcule:
a) Concentración de ADN (μg/mL)
b) Pureza de ADN
c) Peso de una célula bacteriana.

Notas:
La compañía PROMEGA, informa a sus clientes acerca de lo siguiente:
“DNA concentration can be estimated by measuring the absorbance at 260nm (A260), adjusting
the A260 measurement for turbidity (measured by absorbance at 320nm), multiplying by the
dilution factor, and using the relationship that an A260 of 1.0 = 50 μg/ml pure DNA.
Concentration (μg/ml) = (A260 reading – A320 reading) × dilution factor × 50μg/ml
Total yield is obtained by multiplying the DNA concentration by the final total purified sample
volume.
DNA yield (μg) = DNA concentration × total sample volume (ml)
DNA purity can be estimated from the A260/A280 ratio. An A260/A280 ratio between 1.7 and 2.0
generally represents a high-quality DNA sample. The ratio can be calculated after correcting for
turbidity (absorbance at 320nm).
DNA Purity (A260/A280) = (A260 reading – A320 reading) ÷ (A280 reading – A320 reading)
Note: A spectrophotometer is most accurate when measurements are within the instrument's
linear range (generally 0.1–1.0).”

Refrencias
1. Von Hippel, P. H.; Wong, K. Y. J. Biol. Chem. 1965, 240, 3909-3923.
2. Rex, J. H. Focus 2000, 22, 26-27.
3. Boyer, R. Biochemistry Laboratory: Modern Theory and Techniques, 1st ed.;
Benjamin Cummings: San Francisco, 2006; p 297.
4. Blattner, F. R.; et al. Science 1997, 277, 1453 1474.
5. Güssow, D.; Clackson, T. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 4000.
6. Sandhu, G. S., Precup, J. W., and Kline, B. C. BioTechniques 1989, 7, 689-670.

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 Laboratorio de Bioquímica – Guía del estudiante- Semestre II-2016 Profesor Arnaldo Armado/Licenciada Beatriz Moy

PRÁCTICA Nº 2. CARBOHIDRATOS
Reacciones de Reconocimiento de carbohidratos.
Aislamiento y determinación cuantitativa de lactosa en leche.
Objetivos
1. Identificar el carbohidrato presente en una muestra problema mediante diferentes
reacciones de identificación.
2. Aislar lactosa de la leche.
3. Determinar el contenido de lactosa en leche usando el método de la antrona.

EXPERIMENTO 1. Reacciones de reconocimiento para carbohidratos

REACCIÓN DE MOLISH
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 1 mL de la sustancia que se indica y 2 o 3
gotas del reactivo de Molish, agite los tubos. Seguidamente, por las paredes de cada tubo,
agregue 1 mL de ácido sulfúrico concentrado. Observe que ocurre. Anote sus observaciones.
TUBO 1 2 3 4 5 6
SUSTANCIA ALMIDÓN GLUCOSA SACAROSA LACTOSA AGUA PROBLEMA
REACCIÓN DE BENEDICT
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 1 mL de la sustancia que se indica y 1 mL
del reactivo de Benedict, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de agua
hirviente. Observe que ocurre. Anote sus observaciones.
TUBO 1 2 3 4 5 6
SUSTANCIA ALMIDÓN GLUCOSA SACAROSA LACTOSA AGUA PROBLEMA
REACCIÓN DE BARFOED
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 1 mL de la sustancia que se indica y 2 mL
del reactivo de Barfoed, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de agua
hirviente y controle el tiempo de aparición de un precipitado. Anote sus observaciones.
TUBO 1 2 3 4 5 6
SUSTANCIA GLUCOSA SACAROSA FRUCTOSA LACTOSA AGUA PROBLEMA
REACCIÓN DE SELIWANOFF
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 0,5 mL de la sustancia que se indica y 1 mL
del reactivo de Seliwanoff, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de agua
hirviente. Anote sus observaciones.
TUBO 1 2 3 4 5 6
SUSTANCIA GLUCOSA SACAROSA FRUCTOSA LACTOSA AGUA PROBLEMA
REACCIÓN DE BIAL
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 1 mL de la sustancia que se indica y 2 mL
del reactivo de Bial, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de agua
hirviente. Anote sus observaciones.
TUBO 1 2 3 4 5 6
SUSTANCIA GLUCOSA RIBOSA FRUCTOSA LACTOSA AGUA PROBLEMA
REACCIÓN DEL ÁCIDO MÚCICO

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Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno aproximadamente 300 mg de los

compuestos que se indican; luego añada 0,2 mL de agua y 1 mL ácido nítrico concentrado,
agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de agua hirviente. Despues de 1-2
horas observe al microscopio. Anote sus observaciones.
TUBO 1 2 3 4 5 6
SUSTANCIA GLUCOSA GALACTOSA FRUCTOSA LACTOSA AGUA PROBLEMA
(Usted solo realizará la reacción del ácido múcico con su muestra problema y un patrón)
REACCIÓN DE LUGOL
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 0,5 mL de la sustancia que se indica y 1-2
gotas del reactivo de lugol, agite los tubos. Observe lo que ocurre. Anote sus observaciones.
TUBO 1 2 3 4 5 6
SUSTANCIA ALMIDÓN GLUCOSA SACAROSA LACTOSA AGUA PROBLEMA
Diseñe un cuadro donde señale (para cada carbohidrato utilizado y su muestra problema) con
positivo (+) ó negativo (-) los resultados de cada reacción o prueba realizada. Identifique la
muestra problema y discuta los resultados.
EXPERIMENTO 2. AISLAMIENTO Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LACTOSA EN LECHE
Se realizará el aislamiento de lactosa de la leche y se determinará cuantitativamente usando el
método de la Antrona. Deben investigar el procedimiento a emplear utilizando la bibliografía
que se señala.
El aislamiento de caseína se realiza paralelamente al aislamiento de la lactosa. La caseína aislada
debe guardarla hasta la siguiente semana para realizar la práctica 2.
Debe reportar el porcentaje de lactosa obtenido en la leche y discutir los resultados.

PRÁCTICA 3. PROTEÍNAS
Reacciones de reconocimiento de aminoácidos.
Aislamiento y determinación de caseína en leche.
Hidrólisis de caseína y determinación cualitativa de sus aminoácidos mediante
cromatografía en papel.
Investigue sobre:
 Solubilidad y precipitación de las proteínas.
 Clasificación de proteínas por el criterio de solubilidad.
 Reacciones características de los aminoácidos.
 Método de determinación de proteínas.

Objetivos
1. Aislar caseína de la leche.
2. Determinar el contenido de caseína en leche.
3. Determinar cualitativamente los aminoácidos presentes en la caseína de la leche.
4. Realizar algunas reacciones específicas de identificación de aminoácidos.

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PRÁCTICA 4. ENZIMAS
Determinación de peroxidasa de rábano (Raphanus sativus)
Investigue sobre:
 Catalizadores biológicos.
 Cinética de la catálisis enzimática.
 Efecto de temperatura, pH, cantidad de enzima, sustrato entre otros factores, sobre la
actividad enzimática.
Objetivos
1. Evaluar la actividad enzimática de peroxidasa en un extracto de rábano (Raphanus sativus).
2. Comprobar los efectos de la concentración de sustrato, pH, temperatura y tiempo de
incubación sobre la actividad enzimática.
3. Estimar los parámetros cinéticos (KM, VMÁX, CAT) de la peroxidasa para el sustrato utilizado.

Procedimiento
Basándose en la metodología planteada por Armado (2002) realice lo siguiente:
 Prepare el extracto de rábano y determine el contenido de proteínas presente en el
extracto, mediante el método que utilizó en la práctica anterior.
 Determine la actividad del extracto vegetal usando como sustrato el compuesto orgánico
que se le asigne, en presencia de H2O2. Varíe la cantidad de extracto desde 0 hasta 2 mL,
y determine donde se obtiene mayor actividad.
 Usando la cantidad de extracto donde se observe mayor actividad según el experimento
anterior, diseñe sendos experimentos donde varíe la concentración de fenol
manteniendo constante la concentración de H2O2, por un lado y otro donde
manteniendo fija la concentración de fenol, varíe la concentración de H2O2.
 Realice la determinación de la actividad enzimática utilizando soluciones amortiguadoras
a diferentes pH (entre 4 y 9), tomando la cantidad de extracto, concentración de
sustrato y H2O2 donde se obtiene mayor actividad.
 Determine con los parámetros anteriormente determinados, la actividad enzimática a
diferentes temperaturas.
NOTA: Para detener la reacción agregue a cada sistema 2 mL de H2SO4 al 20%, en todos los
experimentos.

Resultados
 Determine la velocidad de reacción y actividad específica en base a las absorbancias
obtenidas, el tiempo de reacción y la concentración de proteína.
 Construya una gráfica para cada parámetro evaluado en función de la actividad
enzimática. Discuta el efecto de cada parámetro sobre la actividad enzimática.
 Obtenga las gráficas de: V vs [S], 1/V vs 1/[S] y V/[S] vs V.
 Estime los parámetros cinéticos KM, VMÁX, CAT mediante los tres gráficos anteriores, y
discuta acerca de las posibles diferencias en los valores obtenidos.

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PRÁCTICA 5. LÍPIDOS
Aislamiento de lípidos totales de la yema de huevo y cuantificación de colesterol

NOTA: DEBE TRAER 1 HUEVO Y HIELO PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA

Objetivos
1. Aislar los lípidos presentes en la yema de huevo.
2. Determinar el contenido de lípidos totales en la yema de huevo.
3. Separar mediante cromatografía de capa fina los lípidos presentes en la yema de huevo.
4. Realizar el fraccionamiento de lípidos en esteroles y lecitinas.
5. Realizar reacciones de reconocimiento de esteroles y lecitinas.

Experimento 1. Aislamiento de lípidos totales de la yema de huevo.

Siga el procedimiento sugerido por Barreto, J. Chem. Edu. Vol. 82 No. 1, 2005, pg. 103.

Experimento 2. Determinación de lípidos totales en yema de huevo.

Tome una alícuota de 4 mL del extracto clorofórmico y colóquelo en un vaso de precipitados
previamente pesado. Evapore cuidadosamente hasta sequedad (en una plancha de
calentamiento o estufa). Luego de dejar enfriar a temperatura ambiente en un desecador, pese
nuevamente. Determine la cantidad de lípidos en base a 100 g de yema de huevo.

Experimento 3. Fraccionamiento de lípidos

Realice el fraccionamiento de lípidos de la yema de huevo, para obtener así las fracciones de
lecitinas y esteroles.
Coloque 2 mL del extracto clorofórmico en dos tubos de centrífuga
↓
Añada 4 mL de acetona fría (a cada tubo)
Deje en frío por 10 minutos
↓
Centrifugue durante 5 minutos a 2000 rpm
↓ ↓
Sólido Sobrenadante
↓ ↓
Lecitinas (Fracción L) Esteroles (Fracción E)

Experimento 4. Cuantificación de colesterol

Evapore hasta sequedad la fracción E obtenida en el experimento anterior. Pese la fracción.
Deje enfriar y disuelva el residuo en ~2 mL de cloroformo.
A continuación, emplee algún método de cuantificación de colesterol. Consulte con el asistente,
previo al experimento para conocer la existencia de los reactivos químicos necesarios.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS GENERALES

Alemany, M. y Font, S. (1982) Prácticas de Bioquímica. Editorial Alhambra, S.A. Madrid, España.
Primera edición.

Arzola, C. y Holguín, C. (2006) Manual de Prácticas de Bioquímica. Universidad Autónoma de

Chihuahua. Facultad de Zootecnia.

GUÍA PRÁCTICAS “BIOQUÍMICA”. 1º Licenciado en Química, Curso 2006/07. Universidad de

Huelva, FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES. Departamento de Química y Ciencia de los
Materiales. Área de Bioquímica y Biología Molecular.

Pavia, D. (1976) Química Orgánica Experimental. Primera edición. EUNIBAR, Barcelona España.
Páginas 77-83, 369-420.

Rendina, G. (1974) Técnicas de Bioquímica aplicada. Editorial Interamericana, S. A. México.

Primera edición.

Shriner, R. L.; Fuson, R. C. y Curtin, D. Y. (2001) Identificación sistemática de compuestos

orgánicos. Editorial Limusa, S. A. México.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ESPECÍFICAS

Armado, A. (2002) Metodología para la determinación de fenoles y otros compuestos

aromáticos utilizando extractos vegetales. Trabajo de ascenso. FACYT. Universidad de Carabobo.

Barreto, J. (2005) Lipid Extraction and Cholesterol Quantification: A Simple Protocol. Chem. Edu.
82 (1): 103-104.

Sims, Branscum, Kao y Keaveny (2010) J. Chem. Edu., 87(10), 1113.

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