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Engenharia Gené ca:

Elemento Gené co Móvel


Thiago Maniglia
Engenharia Gené ca
Ramo da Biotecnologia
• Biotecnologia: Usar seres vivos para a produção de substâncias
serviços a favor dos seres humanos
• Engenharia Gené ca: Manipulação do DNA
• Tecnologia do DNA Recombinante: Conjunto de técnicas
permitem o isolamento, a amplificação e modificação de sequên
de DNA
Elementos gené cos móveis

• Transposons ou Elementos de Transposiçã


• Plasmídeos
• Bacteriófagos
Elemento Gené co Móvel
• Propriedades:
• Tem a habilidade de se mover como uma unidade discreta d
posição do genoma para outra – TRANSPOSIÇÃO
• Presente pra camente em todos os organismos vivos (Proca
eucarioto)
• Quando são inseridos dentro de um gene pode ina va-lo, in
no operon.
• Quando são inseridos antes de um gene pode alterar o contr
expressão desse gene
Transposons
1) Apresenta uma sequencia terminal inver da
• Sem ela o transposon não funciona

Sequência IS
Transposons
2) São Capazes de codificar uma proteína especial de ligação ao DNA
chamada TRANSPOSASE
• Ela reconhece a sequencia terminal inver da
• Ela determina o local alvo onde será inserido no DNA – ponto quen
de inserção
Transposon
3) Após inserido na sequencia alvo, sempre aparece uma curta repe
direta flanqueando o transposon
Exemplo da inserção de um transposon
ina vando um gene
Transposons Complexos
• São duas IS simples flanqueando um gene
• Fenó po detectável – Gene de resistência ou virulência
• Ex: Tn9 – Cloranfenicol; Tn10 – Tetraciclina; Tn1681 - enterotoxina
Processo de Transposição
• Transposição Conserva va: A transposase reconhece a seq
terminal inver da do transposon, corta-o e insere no DNA alv
• Transposição Replica va: Ocorre a replicação do transposon
cópia permanece no local de origem e a outra é inserida n
alvo
Controle da Frequência de Transposiç
É importante para a célula que a transposição seja
limitada!!!

• LIMITAR A PRODUÇÃO DE TRANSPOSASE – transcrição e tradução.


Ex: Tn10 – menos de 1 molécula por célula por geração

• LIMITAR O PERÍODO DE AÇÃO DA TRANSPOSASE – logo após a replica


DNA – enquanto o DNA ainda não está me lado
Elementos de Transposição em Eucariotos

• Descoberto em genes de milhos – Barbara MacClintock –


Prêmio Nobel de Medicina em 1983
• Depois evidenciado em diversos organismos: Drosófila, humanos, ...
• Ocupa grande parte do genoma
• Ex: mais de 70% em algumas plantas e an bios; Humanos 45%
• Transposons Autônomo: Capazes de se moverem sozinhos
• Transposons Não Autônomo: Incapazes de se moverem pela dele
gene da transposase
• Só consegue se mover se u lizar a transposase produzida por outro transposo
Retrovírus
• São vírus eucariontes com RNA como material gené co
• No hospedeiro o RNA produz DNA bifilamentar que pode se integra
genoma do hospedeiro – Provírus
• O DNA viral integrado ao genoma do hospedeiro pode sinte zar mR
que pela ação da transcriptase reversa, pode produzir mais DNA viral e
inserido novamente no genoma do hospedeiro – RETROTRANSPOSO
pode chegar a 40% genoma humano
Plasmídeos
• Material gené co extra-cromossômico de replicação autônoma
• Presente na maioria das bactérias, mas também já foi encontrado em
leveduras, protozoários e plantas
• DNA circular bifilamentar (alguns lineares)
• Capacidade de se transmi r de uma bactéria para outra. Inclusive entr
(Conversão horizontal)
• Tamanho: 5 a 500 Kb
• Existem em números caracterís co por cels.
Importância dos plasmídeos para as Bactérias
Compe ção, habilidade, produção de toxinas, resistência..
Plasmídeo Colicina – mata bactérias sem esse plasmídeo
Plasmídeo Enterotoxina – Permite crescer no intes no delgado
Plasmídeo pUC 18
Vetor de Clonagem apropriado
• Origem de Replicação
• Gene repórter – ampR
• Gene repórter de transformação - LacZ
• Polylinker para enzima de restrição
Transferência de Plasmídeo
Conjugação
• Os plasmídeos conjuga vos levam um grande bloco de mais de 20 g
transferência (operon tra) responsáveis pelas estruturas c
especializadas e enzimas necessárias para mover fisicamente o
plasmidial de uma célula doadora para uma receptora
• Ex: E. coli – Plasmídeo F
Conjugação Plasmídeo F
autônomo
Conjugação de plasmídeo F integrado
O plasmídeo é integrado ao genoma
central da bactéria
Durante a conjugação ocorre a
transferência de genes bacterianos
junto com o plasmídeo
Células Hfr (alta frequência de
recombinação - High frequency
recombina on)
Conjugação por Fator F integrado
Hfr (alta frequência de recombinação)
Os genes bacterianos que estão logo
após a região oriT são os primeiros a
passarem para a célula hospedeira
A célula receptora não recebe todo o plasmídeo F, portanto não se torna doadora
Velocidade de transferência – 50 Kb/min.
100 min. para transferir todo o genoma

Quando o fragmento entra na célula


receptora ele faz recombinação com o
DNA da bactéria, transferindo a
informação gené ca de uma bactéria
para outra
Plasmídeo F’ (F primo)
• É resultado de um plasmídeo F integrado que se desligou do genom
Bacteriano.
• Pode levar genes bacterianos junto
• Se não perdeu genes de transferência pode fazer conjugação e leva
genes de uma bactéria para outra
• Após conjugação não precisa ocorrer recombinação, pois os genes
estão no plasmídeo e pode ser expresso normalmente
Bacteriófago
• É um vírus parasita bacteriano
• Pode transferir DNA da bactéria hospedeira para a próxima
hospedeira
Ciclo de Vida do
Bacteriófago
Ciclo Lí co
Fago Transdutor
• Ciclo Lisogênico – Excisão aberrante de um profago durante a induç
• Ciclo Lí co – Embalagem de fragmentos de DNA bacteriano
Ciclo Lisogênico – Excisão
aberrante de um profago
durante a indução
Aplicações Biotecnológicas
• Transposons – formação de organismos modelos com genes exôge
• Plasmídeos – Vetores de Clonagem
• Bacteriófagos – bibliotecas de DNA