Manual Micro Ambiental 2018

Escuela de Ciencias Geográficas
Carrera de Ingeniería Geográfica y Planificación Territorial
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

AMBIENTAL
AUTORA: Dra. Iliana Alcocer Negrete

DOCENTE: M. Sc. María Fernanda Yauri Bucheli
Nombre del Alumno:

___________________________________
Quito, Abril 2018

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca
Apartado postal 17-01-2184
Telf.: (593) 2 299 17 00 ext. 1685-1687
Quito – Ecuador www.puce.edu.ec
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL ÁREA LABORATORIAL
1. Es obligatorio usar mandil de mangas largas, este nunca puede ser

intercambiado con los compañeros después de ser usado. Debe ser usado
solamente en el interior del laboratorio y en los corredores de áreas técnicas
comunes y deberá ser retirado cuando se salga de este ambiente.
2. Mantener en el laboratorio exclusivamente los materiales necesarios para
los trabajos de análisis. Coloque sus pertenencias personales en la última
mesa del laboratorio.
3. No se debe colocar objetos de uso personal en las mesas de trabajo
(celulares, relojes, etc.)
4. Si tiene alguna herida en las manos, no debe participar de los trabajos de
laboratorio. En caso de necesidad extrema hacer asepsia de las manos,
especialmente en las heridas y utilizar guantes, procediéndose a la
desinfección de las mismas.
5. Lavarse meticulosamente y usar desinfectante en las manos al entrar y antes
de salir del laboratorio.
6. No fumar, comer o ingerir líquidos en el laboratorio.
7. Evitar tocar el cuerpo, especialmente los ojos, la boca y la nariz con las
manos durante el trabajo en el laboratorio. En caso de necesidad proceder
al lavado y asepsia de las manos antes y después de realizada esta acción.
8. No humedecer etiquetas u otros materiales del laboratorio con la lengua.
9. No utilizar pañuelos de uso personal o el mandil para limpiar objetos o
instrumentos de trabajo en el laboratorio.
10. Mantener próximo al lugar de trabajo desinfectante.
11. Cuidado al encender el mechero. Verifique que no existan substancias
inflamables próximas.
12. Asegúrese que las llaves de gas y de agua estén cerradas y los aparatos
eléctricos apagados antes de abandonar el laboratorio.
13. Utilizar solamente calzados cerrados, no es permitido el uso de sandalias.
14. Los cabellos deben estar obligatoriamente recogidos para evitar accidentes,
con la llama del mechero.
15. No utilizar joyas, pulseras o aretes que dificulten el trabajo y favorecen
accidentes y contaminación.
16. Deje el teléfono celular apagado y en la mesa posterior.
17. No transporte, mueva o saque del laboratorio equipos medios o cultivos
microbianos.
18. Usar guantes cuando las actividades desarrolladas exijan el contacto con los
fluidos corporales.
19. Es prohibido la manipulación de chapas, teléfonos, agarraderas de armarios
u otros objetos de uso común por personas usando guantes durante la
ejecución de actividades en las que se utilicen agentes patógenos.
20. El acceso al laboratorio es limitado al personal técnico.

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21. En caso de accidentes (quemadura, corte, derrame de cultivos, rompimiento

de material, etc.), comunicar inmediatamente al profesor.
22. Si se derrama o se cae un cultivo vivo, coloque inmediatamente papel

periódico sobre el material regado, derrame abundante desinfectante sobre
el papel hasta cubrir por completo el área contaminada y luego de 15 minutos
quite y descarte el papel en un recipiente adecuado que será posteriormente
esterilizado.
Normas de trabajo en el laboratorio
1. Prepararse para cada práctica de laboratorio leyendo con anticipación las

instrucciones de cada práctica.
2. Al inicio de cada práctica trazar plano de trabajo considerando el material a
ser utilizado y el tiempo necesario.
3. Trabajar siempre de manera ordenada, tranquila, constante y metódica,
evitando movimientos innecesarios, así como corrientes de aire en el
laboratorio.
4. Limpiar y desinfectar la superficie de las mesas de trabajo antes y después
de cada laboratorio.
5. Identificar las muestras, así como el material a ser utilizado antes de iniciar
el laboratorio. La muestra en general no debe ser descartada hasta que se
obtengan resultados. Para esto utilice un marcador para acetatos o para
vidrio, de punta fina (evite el color rojo, elija los colores negro, azul).
6. Tocar el material a analizar exclusivamente con materiales estériles (nunca
con las manos).
7. En el caso de derramamiento de material proceder inmediatamente a
desinfección y esterilización.
8. Todo el material utilizado en la práctica, como láminas, pipetas, etc., deben
ser colocados en recipientes conteniendo solución desinfectante que se
encontrará en la mesa del profesor.
9. Los cultivos después de la lectura y obtención de resultados deben ser
esterilizados.
10. Al concluir cada laboratorio deje todas las instalaciones y el equipo en forma
ordenada. Comunique sobre cualquier equipo defectuoso que vea. Habrán
recipientes destinados al papel y al material de vidrio contaminados.
11. Antes de guardar su microscopio verifique que los lentes estén limpios, que
se encuentre en el lente de menor aumento y con la platina para abajo, cada
microscopio debe estar cubierto con un protector plástico.

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MATERIALES QUE EL ESTUDIANTE DEBE TENER
 Mandil de mangas largas

 Manual de laboratorio
 Un marcador que escriba sobre vidrio de punta fina
 Un marcador que escriba sobre vidrio de punta mediana
 Un lápiz de dibujo
 Lápices de colores
 Un limpión blanco
 Jabón y toalla
 Papel toalla
 Binchas para recogerse el cabello
 Hojas A4
 Hojas de papel periódico
 Una caja de fósforos
DIFERENCIAS ENTRE LOS CONCEPTOS DE ESTERILIZACIÓN,

DESINFECCIÓN Y ASEPSIA
Existen procedimientos básicos y rutinarios en el laboratorio de Microbiología

que permiten el control de los microorganismos para brindar una ambiente de
trabajo seguro para los estudiantes.
Se puede llevar a cabo con diferentes métodos en función del lugar a aplicar y
el grado de erradicación microbiana que se pretende conseguir. Por esto es
conveniente definir algunos conceptos:
Esterilización: proceso físico o químico que destruye toda forma de vida de vida
microbiana, incluidas las esporas.
Desinfección: tiene por objeto la destrucción de microorganismos mediante

agentes de naturaleza química (desinfectantes), con el fin de disminuir el número
de formas vegetativas a niveles mínimos.

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Desinfectante: es la sustancia química que inhibe o destruye microorganismos

al aplicarla sobre material inerte sin alterarlo significativamente.
Asepsia: El objetivo de la asepsia o lavado de manos es reducir la flora residente

(entendiendo por esta la flora cutánea de las manos y antebrazos normal del
individuo y puede estar conformada por microorganismos patógenos como
Staphylococcus aureus) y también remover las bacterias transitorias
(entendiendo por esta los microorganismos que se adquiere por contaminación
con el medio ambiente y está generalmente constituida por organismos no
patógenos).
El número y el tipo de bacterias cutáneas difieren considerablemente, según la

zona del cuerpo o las técnicas empleadas en la toma para el análisis, además
es muy amplia la variación cuantitativa individual. Esta variación depende de
humedad de la piel y del ambiente.

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PRÁCTICA 1
DIVERSIDAD MICROBIANA
1 INTRODUCCIÓN
La Microbiología es el estudio de los microorganismos, un extenso y variado

grupo de organismos microscópicos que existen como células aisladas o
agrupaciones celulares; también incluyen el estudio de los virus, que son
microscópicos pero no celulares. Las células microbianas son distintas de las
células de animales y plantas, que son incapaces de vivir aisladas en la
naturaleza y sólo pueden existir como partes de los organismos pluricelulares.
Una célula microbiana aislada es, en general, capaz de llevar a cabo sus
procesos vitales de crecimiento, generación de energía y reproducción
independientemente de otras células, de la misma o de diferente clase.
2 OBJETIVOS
a) Demostrar la técnica de asepsia de manos, desinfección de mesa

b) Ensayar la clasificación general de los microorganismos estudiados en la
Teoría de Microbiología.
c) Observar al microscopio la morfología, agrupación, tinción Gram de
bacterias y formación de esporas.
d) Observar al microscopio las características morfológicas de hongos y
protozoos
3 MATERIALES
Por grupo de 2 estudiantes:

- Placas preparadas de bacterias, hongos y protozoos selectos
- Microscopio
- Aceite de inmersión

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4 PROCEDIMIENTO
4.1 Desinfección de la mesa:
a) Colocar abundante alcohol 70% en la mesa de trabajo y esparcirlo con

un limpión o papel toalla.
b) Asegurarse que lo haga tanto en la superficie y los bordes de la mesa.
4.2 Asepsia de manos:
a) Retirar pulseras, relojes, anillos y cualquier otro objeto que se encuentre

en sus manos y dificulte el lavado.
b) Humedecer las manos con agua corriente.
c) Colocar el jabón líquido en la palma de la mano y distribuirlo de manera
uniforme.
d) Deslizar los dedos unos entre otros para lavar entre ellos y en toda sus
superficie.
e) Frotar cada uno de los nudillos.
f) Restregar el borde las uñas.
g) Frotar la base del pulgar.
h) Unir las yemas de los dedos de su mano izquierda y hacer circular en la
palma de la mano derecha. Hacer lo mismo con el pulgar y repetir el
procedimiento con la mano derecha.
i) Restregar las muñecas.
j) Enjuagar con los dedos hacia abajo.
k) Secar con papel toalla las manos y muñecas.
l) Cerrar la llave de agua.
m) Depositar el papel en el basurero.
n) Colocar alcohol y esperar secar al aire antes de encender el mechero.
4.3 Observación al microscopio las placas preparadas:

a) Use la magnificación de 40x para eucariotes y 100x para bacterias, en
este caso use aceite de inmersión antes de pasar a la magnificación 100x.
b) Para enfocar las placas siga las instrucciones de los alumnos asistentes.
c) Graficar cada organismo observado, señalar sus partes principales e
identificarlo a nivel de especie, género, clase y dominio.
5 RESULTADOS Y OBSERVACIONES
a) Dibuje los microorganismos observados al microscopio, señale sus
partes principales. Use el esquema de la página siguiente Indique en
bacterias que tinción Gram, su morfología y agrupación.

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6 CONCLUSIONES
7 CUESTIONARIO
1. Señale cinco diferencias entre hongos, bacterias y protozoos

2. ¿Los virus son células? Señale tres características por las que los virus
se diferencian de las células.
3. ¿Qué significa esterilización, asepsia y desinfección?

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No Dibujo Procariote/ Microorga- Morfología Presencia o no

. nismo /Agrupación/ de esporas
Eucariote
Tinción Gram
1

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PRÁCTICA 2
TÉCNICAS BÁSICAS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE COLONIAS
1. INTRODUCCIÓN
Una población microbiana en crecimiento en un medio nutritivo, constituye un

cultivo. En los medios naturales los microorganismos, raramente están
aislados, las especies están en general mezcladas y se desarrollan
conjuntamente, si las condiciones son favorables.
En el laboratorio se crean ambientes favorables para el desarrollo de las

bacterias y se cubren los requerimientos básicos importantes como: (1)
disponibilidad de nutrientes apropiados, (2) necesidad o no de oxígeno, (3)
necesidad de un cierto grado de humedad, (4) mantenimiento de pH
apropiado, (5) temperatura adecuada, (6) el medio de cultivo debe estar estéril
para el uso, (7) utilización de técnicas asépticas para evitar la contaminación
del medio durante la siembra o lectura.
El cultivo de una única especie se llama cultivo puro. Los medios de cultivo
comúnmente utilizados en bacteriología tienen por base la infusión de carne,
la cual contiene proteínas solubles, carbohidratos, sales y cuando son
enriquecidos por la adición de peptonas y clorato de sodio, constituyen lo que
se denomina “caldo simple” (líquido) que por la adición de agar-agar se le
conoce como “agar simple” (sólido). El agar, químicamente, es un galactán,
polímero de galactosa, y no pude ser utilizado por las bacterias. El agar
puede cambiar a estado líquido a una temperatura de 92 a 100º C y se
solidifica a 42 a 47º C.
Una colonia es el producto de la reproducción asexual por fisión binaria de

una célula bacteriana aislada en la superficie un medio sólido cuya progenie
se va acumulando en forma de una masa de células hasta ser visible. Una
colonia bacteriana puede ser del tamaño de una cabeza de alfiler, en 24 horas
contiene varios millones de microorganismos. Es, pues, obvio que una
cantidad pequeña de material que se adhiere al asa es más que suficiente
para efectuar una transferencia exitosa.
Los tipos de siembras se resumen de la siguiente manera:
Estrías en tubos o placas:
 Continuas, en tubos o placas
 Discontinuas, en placas

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 Zig=zag en tubos o placas

 “pour plate” o siembra en profundidad en placas
En tubo:
 Picada profunda
 Estría superficial
 Por dilución en medios líquidos
2. OBJETIVOS
a) Aprender las técnicas básicas de cultivo microbiano.

b) Realizar siembras bacterianas en medios líquidos y sólidos.
c) Aislar colonias en agar nutriente y Eosina Azul de Metileno (EMB)
3. MATERIALES
Por estudiante:
 1 tubo con agar nutriente inclinado
 1 tubo con agar Sulfuro Indol Motilidad (SIM) semisólido no inclinado
 1 tubo con caldo nutritivo
 1 caja Petri con agar nutriente
 1 caja Petri con agar Eosina azul de Metileno (EMB)
 1 asa bacteriológica
 1 aguja bacteriológica
 1 gradilla
 1 mechero
Por grupo:
 Tubos vacíos
 Placas de Petri vacías
 3 tubos de agar SIM con crecimiento de Escherichia coli,
 3 tubos de agar SIM con crecimiento de Klebsiella oxytoca,
 3 tubos de agar SIM con crecimiento de Proteus sp.
 3 tubos de agar SIM con crecimiento de Citrobacter freundii
 12 tubos de caldo nutritivo con crecimiento de mezcla de bacterias
entéricas Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundii y
Proteus sp.
 12 cajas Petri de agar nutritivo con crecimiento de Escherichia coli 24h
 12 cajas dividas en cuatro con crecimiento de la mezcla de bacterias
entéricas en EMB
 1 recipiente con desinfectante

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4. PROCEDIMIENTO
4.1 Transferencia de caldos
a) Colocar frente a Ud. el mechero Bunsen y poner todos los tubos y demás
equipo en la posición adecuada para que se puedan alcanzar sin ninguna
dificultad, y sin peligro de quemarse. Para los diestros en el lado izquierdo y
para los zurdos en el lado derecho.
b) Es conveniente no manipular más de dos tubos a la vez.
c) Identificar su material rotulándolo con su número de grupo, nombre de los
integrantes o iniciales y nombre del microorganismo que va a manipular.
d) Esterilizar el asa en la llama hasta que se ponga al rojo vivo.
e) Sostener el tubo de cultivo bacteriano con la mano izquierda y con la derecha
el asa de inoculación.
f) Incline el tubo y remueva el tapón con el dedo meñique de la mano derecha
hasta que sea tiempo de volver a tapar el tubo. Nunca deje el tapón sobre
la mesa porque se puede contaminar.
g) Flamear el borde del tubo por la llama dos veces para destruir cualquier
microorganismo que este adherido al vidrio.
h) Introduzca el asa en el tubo y enfríela en el vidrio, remueva una pequeña
cantidad de inóculo con el asa estéril.
i) Sacar el asa y flamear el borde del tubo nuevamente y taparlo.
j) Tome cuidado con el asa pues ahora tiene millones de bacterias, no toque
en este momento ninguna superficie y mucho menos sus manos. No aleje el
asa más de 15cm de la circunferencia alrededor del mechero.
k) Pase el tubo por la llama y tápelo con el tapón.
l) Coloque el tubo en la gradilla.
m) Coja el tubo con caldo estéril con una mano, quite el tapón y flamee el borde
del tubo.
n) Introducir el asa con el inóculo dentro del tubo del medio estéril, inocular por
dilución inclinando el tubo ligeramente y dispersando los microorganismos
con el asa en el borde inferior de la superficie del tubo.
o) Retirar el asa, tocar con ella la superficie interna del tubo para eliminar
cualquier exceso de inóculo y no tocar la boca del tubo.
p) Pase la boca del tubo nuevamente por la llama, tápelo y déjelo en la gradilla.
q) Flamear nuevamente el asa hasta que se ponga al rojo vivo, antes de
colocarla en la válvula, nunca encima de la manguera, puede perforarse y
causar un grave accidente.

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4.2 Transferencia de una colonia desde una caja de Petri a un tubo de agar
inclinado
a) A partir de un cultivo microbiano en medio sólido (caja de Petri), escoja una

colonia aislada marcando su posición con un círculo por el lado inferior de la
caja de Petri.
b) Esterilice el asa.
c) Abrir la caja como se le indicó, obtener el inóculo, tocando con el asa
bacteriológica estéril una colonia, cerrar la caja y déjela en la mesa de trabajo.
d) Coja el tubo con agar inclinado estéril haciendo que la superficie del agar
quede hacia arriba de modo que pueda verla con claridad.
e) Efectuar los pasos asépticos preliminares de flameado y remoción de
tapones como se describió anteriormente.
f) Introducir el asa estéril sobre la superficie del agar inclinado, hasta el fondo
del tubo de ensayo. Deslizar el asa sobre la superficie inclinada, de lado a
lado, conforme se va avanzado para extraerla del tubo sin romper la
superficie del agar.
g) Sembrar el inóculo en la superficie del agar inclinado por estrías continuas.
h) Flamear los bordes de los tubos y taparlos.
i) Flamear el asa y deposite el tubo en su gradilla.
4.3 Transferencia de una colonia desde un tubo a un tubo de agar no

inclinado
a) Tome el inóculo del tubo una persona del grupo de Escherichia coli y la otra
de Proteus sp.. En el otro grupo Klebsiella oxytoca y la otra de Citrobacter
freundii.
b) Coja el tubo de agar no inclinado y con la aguja con inóculo perfore
verticalmente el tubo que contiene medio semisólido, sin hacer movimientos
laterales.
c) Procure que la entrada y salida de la aguja sean por el mismo lugar del
inóculo.

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4.4 Aislamiento de colonias por estrías
a) A partir de un cultivo microbiano en medio líquido, y con el auxilio del asa

realizar estrías continuas en una placa de agar nutriente y estrías
discontinuas en placa de Petri con EMB. Como se muestran en las imágenes
A y B respectivamente.
A) Estría Discontinua B) Estría Continua

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5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
PRÁCTICA 2: MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE CULTIVO

BACTERIANO
Nombre del Alumno___________________________________________
Procedimiento Resultado Observaciones

4.1. Transferencia de
caldos
4.2 Transferencia de
una colonia desde
una caja de Petri a un
tubo de agar inclinado
4.3 Transferencia de
una colonia desde un
tubo a un tubo de
agar no inclinado

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4.4 Aislamiento de
colonias por estrías
continuas
4.4 Aislamiento de
colonias por estrías
discontinuas
6. CONCLUSIONES
(Detalle y correlaciones con los objetivos)
7. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la función del agar en el medio de cultivo?

2. ¿Cuál es la importancia de aislar colonias en una placa de Petri?
3. ¿Por qué E. coli es verde brillante en la placa de EMB?

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PRÁCTICA 3
TINCIONES
1 INTRODUCCIÓN
1.1 PREPARO DE FROTIS BACTERIANO
Los frotis de microorganismos se hacen dispersando una pequeña

cantidad del cultivo bacteriano en la superficie de un portaobjetos limpio, la
capa delgada resultante se seca al aire y luego se lo pasa por la llama de un
mechero. Este último procedimiento no solo mata sino que coagula las
substancias proteicas de las células, fijando así los organismos al
portaobjetos. La preparación queda, entonces lista para la aplicación de la
tinción.
1.2 TINCIONES
Las bacterias y células vivas y la mayoría de microorganismos son casi

transparentes y no presentan suficiente contraste con el agua o con el medio
en el cual están suspendidas como para ser visibles. A través del proceso de
tinción se hace que las bacterias contrasten en color con el medio que las
rodea pudiendo ser observadas perfectamente. Los colorantes utilizados en
Microbiología son derivados sintéticos de las animales. Se conocen las
siguientes técnicas de tinción:
Tinción simple: con tintes ácidos y básicos
Tinción diferencial: tinción Gram, tinción Siehl Nielsen, entre otras, y tinciones
estructurales, como tinción Feulgen y tinciones específicas para endosporas
y cápsulas.
2 OBJETIVOS
a) Entrenar la técnica de tinción Gram en frotis bacteriano.
b) Diferenciar bacterias y observar su morfología y agrupación.
c) Diferencias grupos bacterianos de acuerdo a sus reacciones de
tinción Gram.

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3 MATERIALES
Por estudiante:
 Portaobjetos
 Asa bacteriológica
 Mechero
 Agua destilada
 Set de tinción Gram
 Aceite de inmersión
 Papel filtro
 Microscopio - aceite de inmersión
Por grupo:
 Cajas de cultivo de Bacillus subtilis en agar nutriente
 Cajas de cultivo de Escherichia coli en agar nutriente.
 Cajas de cultivo de Staphylococcus epidermidis en agar nutriente.
 Cajas de cultivo de Streptococcus agar nutriente.
 Cajas de cultivo de Proteus
 Tioglicolato con cultivo de Neisseria
4 PROCEDIMIENTO
4.1 PREPARO DEL FROTIS BACTERIANO

a) Esterilizar el asa bacteriológica
b) En la mitad del portaobjetos, colocar una pequeña gota de agua
c) Coger una pequeña cantidad de muestra y mezclarla con el agua,
extenderla bien de manera que se forme una película delgada
sobre la superficie disponible. Si se toma la muestra de cultivo
líquido no es necesario poner la gota de agua antes en el
portaobjetos.
d) Secar la preparación al aire con movimientos horizontales suaves.
e) Fijar la preparación pasando brevemente el portaobjeto (con la
muestra hacia arriba) cuatro veces por la llama.
f) Proceder a la tinción.

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4.2 TINCIÓN DIFERENCIAL
Los microorganismos difieren unos de otros química y físicamente; lo que

hace que reaccionen, de forma distinta, al procedimiento de tinción. De esta
manera, se pueden distinguir tipos bacterianos y tipos de estructuras
celulares. La tinción diferencial es un proceso que implica varios tratamientos
y varios colorantes aplicados en secuencia.
TINCIÓN DE GRAM
La coloración de Gram es la tinción diferencial más importante en el estudio

de bacterias. Este método, se basa en el hecho de que ciertas bacterias al ser
coloradas con violeta de genciana y después tratadas con yodo se forma un
compuesto de coloración oscuro entre el yodo y el colorante el cual es
fuertemente retenido por un grupo de bacterias y no puede ser removido por
el tratamiento con alcohol (que actúa como decolorante) estas bacterias se
conocen como Gram-positivas o que toman el Gram. Otras bacterias llamadas
Gram-negativas se decoloran fácilmente por el alcohol. Por otro lado, sí
después del alcohol, se efectúa una segunda coloración, usando safranina
(colorante de color rojo), las bacterias Gram-negativas aparecerán de color
rojo, y las Gram-positivas se presentarán moradas, esto es conservarán el
color violeta del primer colorante usado. En las bacterias Gram-positivas la
pared es constituía esencialmente por un componente mucopeptídico y el
tratamiento con el alcohol resulta en una deshidratación y consecuentemente
disminución de permeabilidad que impide, o dificulta, la dilución del complejo
yodo-colorante. Esto no sucede con las bacterias Gram-negativas, en las
cuales el solvente orgánico actúa en sentido contrario, determinando un
aumento de la permeabilidad celular. La coloración de Gram es de elevada
importancia para la sistemática en Bacteriología pues divide a las bacterias
en dos grande grupos: Gram-positivas y Gram-negativas, que reaccionan
diferentemente frente a muchos agentes físico y químicos. Para no presentar
una lista de las bacterias Gram positivas y Gram negativas, podemos formular
dos reglas generales como ejemplo de interés en la patología humana.
Primera regla: Los cocos son generalmente GRAM-POSITIVOS, con
excepción de los pertenecientes al género Neisseria.
Segunda regla: Los bacilos son generalmente GRAM-NEGATIVOS, con
excepción de aquellos pertenecientes a los géneros Corynebacterium (bacilo
de la difteria) Bacillus (bacilo del carbunco), Clostridium (bacilo del tétano,
botulismo), Mycobacterium (bacilos de la tuberculosis) y Listeria (bacilo de la
listeriosis)

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PROCEDIMIENTO
TINCIÓN DE GRAM
a) Prepare un frotis y cubra cada uno con cristal violeta o violeta de
genciana, por 1 minuto
b) Deseche el colorante
c) Lave con agua corriente
d) Coloque la solución yodada de Gram (lugol) por 1 minuto, lave
delicadamente con agua de la llave o agua destilada
e) Incline la placa tomándola por un extremo y deje caer la solución
alcohol-acetona.
f) Lave con agua cuidadosamente
g) Aplique la safranina por 1 minuto
h) Lave cuidadosamente y deje secar
i) Coloque el cubre objeto
j) Observe al microscopio con lente de 5, 10, 40 y luego con el de 100x
usando para este último el aceite de inmersión
5 RESULTADOS Y OBSERVACIONES
a) Grafique lo observado a colores
b) Señale si es Gram-positiva o Gram-negativa, que morfología tiene, que
agrupación presenta o si son individuales.
6 CONCLUSIONES
7 CUESTIONARIO
1. Elaborare un cuadro de información de lo que ocurre en de cada paso de
la tinción Gram tanto para bacterias Gram-positivas como para Gram-
negativas.
2. ¿Por qué puede ser afectada la tinción Gram con la edad del cultivo?
3. Indicar dos problemas que tuvo al realizar la tinción Gram.
4. Indique porque tuvo éxito en su tinción Gram (en caso de serlo).

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GRUPO No. __________________________________
Alumno 1: ___________________________________
No Dibujo Procariote/ Microorganismo / Tinción

. Gram
Eucariote Morfología
/Agrupación
1 Microorganismo:
Bacillus subtilis
Morfología:
Agrupación:
2 Microorganismo:
Staphylococcus
aureus
Morfología:
Agrupación:
3 Microorganismo:
Streptococcus sp.
Morfología:
Agrupación:

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4 Microorganismo:
Escherichia coli
Morfología:
Agrupación:
5 Microorganismo:
Proteus vulgaris
Morfología:
Agrupación:
6 Microorganismo:
Neisseria sp.
Morfología:
Agrupación:

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PRÁCTICA 4
MICROORGANISMOS DE AMBIENTE
1 INTRODUCCIÓN
Bacterias y otros microorganismos están presentes en todo el medio

ambiente, se encuentran en agua, aire, suelo, alimentos, plantas, animales y el
hombre. Por esta razón con la finalidad de evitar contaminación pesada, es
necesario trabajar en asepsia cuando se manejan cultivos.
Muchas bacterias son transportadas por el aire sobre partículas de polvo

o sobre residuos secos de gotitas de saliva; por esta razón se toman medidas
de control. Además de las esporas de hongos dispersas en forma natural, se
encuentran microorganismos patógenos en el aire asociados a dos tipos de
partículas, los residuos de gotas evaporadas de la exhalación y las muchos más
frecuentes partículas de polvo. Una serie de enfermedades respiratorias graves,
se deben a la inhalación de hongos que se han dispersado como esporas o como
contaminantes de partículas de polvo aerotransportadas.
El problema de mantener condiciones estériles es central en el laboratorio

de Microbiología. Cada superficie, cada gota de líquido, cada centímetro cúbico
de aire está densamente poblado por microorganismos. Es necesario que se
asimile la idea de que todo está cubierto de microorganismos para poder
comprender la importancia de la técnica aséptica.
Las bacterias del género Staphylococcus son cocos Gram-positivos,

pertenecientes a la familia Micrococcaceae al microscopio se puede ver la
agrupación en forma de racimo característico de este género. Son bacterias
anaerobias facultativas, con mayor crecimiento en condiciones aerobias donde
producen catalasa.
Este microorganismo está ampliamente diseminado en el ambiente, siendo

el hombre y los animales el principal huésped; está presente en la mucosa nasal,
garganta, cabellos y piel de más del 50% de la población humana. Este
microorganismo es agente de una serie de infecciones, que varían desde lesiones
localizadas de la piel hasta infecciones generalizadas y sistémicas.
S. aureus está presente en los alimentos, particularmente en aquellos

sometidos a manipulación, sobre condiciones precarias de higiene. Se ha aislado
S. aureus en alimentos como embutidos, carne molida, productos cárnicos,
quesos, dulces cremosos, tallarines y harina.
El proceso patológico provocado por S. aureus es típicamente de una

intoxicación, ocurriendo apenas cuando hay una intensa proliferación de la
bacteria, llegando a poblaciones de 105 a 106 UFC/g; en estas condiciones,
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cantidades suficientes de toxinas serán producidas y liberadas en los alimentos,

que al ser ingeridos causan intoxicaciones. El período de incubación es usualmente
de 2 a 4 horas, siendo la sintomatología caracterizada por náuseas, vómito, diarrea
y dolores abdominales, aunque en otros casos se presentan síntomas de sudación,
salivación intensa y deshidratación. Los síntomas no persisten por más de 24 horas
y es raramente mortal.
2 OBJETIVOS
a) Demostrar la presencia microbiana en varios componentes de nuestro

ambiente.
b) Identificar las bacterias aisladas de muestra de garganta y piel.
c) Aislar colonias de Staphylococcus spp. en medio sólido, manitol
salado.
3 MATERIAL
Por estudiante:
Primer día
 2 cajas Petri con agar nutriente
 1 tubos con caldo nutritivo
 1 cajas Petri con agar sangre
 torundas de algodón estériles
Segundo día
 Peróxido de hidrógeno
 Porta objetos
 Asa bacteriológica
4 PROCEDIMIENTO
Primer día
Obtención de muestras de ambiente
a) Exponga una caja Petri al ambiente por todo el período de esta práctica,
poniéndola en un sitio del laboratorio o fuera de él, a su gusto.
b) Humedezca la torunda estéril en el caldo nutritivo
c) Con un torunda estéril obtenga una muestra de polvo de sus zapatos o su
ropa o de otras fuentes; en alternativa puede utilizar un cabello o
impregnar sus dedos en una caja con agar nutriente.
d) Con una muestra parecida inocule un tubo con caldo dejando la torunda
dentro del tubo, corte el exceso del palito.
e) Con una torunda coja una muestra de la garganta de su compañero e
inocule una caja con agar sangre.

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f) Con una torunda coja una muestra de la nariz de su compañero e inocule

una caja con agar sangre.
g) Incube todas las cajas preparadas y los tubos a 37ºC; en el siguiente
laboratorio observe, discuta y anote conclusiones.

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Segundo día
Análisis del material
a) Analizar la hemólisis en placas de agar sangre, ausencia de halo 

hemólisis, presencia de halo transparente  hemólisis, y presencia de halo
verdoso  hemólisis.
b) De las colonias típicas de S. aureus y S. epidermidis en agar sangre
realizar aislamiento en agar manitol salado por estrías continuas para
obtener colonias aisladas (use la mitad de la placa y la segunda placa con
los controles positivos).
c) Realizar conteo de unidades formadoras de colonia para determinar el
ambiente más contaminado.
d) Observar una prueba de coagulasa positiva.
Tercer día
a) Si existen colonias sospechosas de S. aureus en el agar manitol salado
hacer la prueba de coagulasa.
b) Concluir con el conteo y observar las características de las colonias,
ayudándose de la hoja anexa
6 RESULTADOS Y CONCLUSIONES
7 CUESTIONARIO
1) ¿Por qué son tan comunes las infecciones respiratorias?

2) ¿Qué microorganismos fueron más comunes en el ambiente y por qué?
3) ¿Es más probable que los patógenos crezcan en la piel o en la garganta?
¿Por qué?
MICROORGANISMOS DE AMBIENTE
Observe el crecimiento y anote las características de las colonias, ayudándose

con la hoja anexa:
Tabla 1. Observación y crecimiento de las colonias de la placa de ambiente.
Colonia Pigmentación Forma colonial Caracterís Propiedades Alguna

número -ticas del de elevación característica
borde adicional

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Tabla 2. Unidades formadoras de colonia (UFC) placa de ambiente
Grupo Lugar 24 horas 1 semana

Bacterias Hongos, Bacterias Hongos,
Levaduras levaduras
1

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Tabla 3. Análisis del agar sangre
Alumno:
__________________________________________________________
Dibujo Conteo Tamaño/ Hemólisis Prueba de

color catalasa
UFC
Muestra
de
garganta
Muestra
de
nariz

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PRÁCTICA 5
MICROFLORA DEL SUELO
1. INTRODUCCIÓN
Existe una gran diversidad de microorganismos que viven en el suelo. El

número y tipo de microorganismos presentes en el suelo dependen de diversos
factores ambientales como son los nutrientes, humedad, aireación, temperatura,
pH, prácticas agrícolas, etc. Existen varios miles de millones de bacterias por
gramo de suelo. La mayor parte son heterótrofos, siendo comunes los bacilos
esporulados, los actinomicetos que son los responsables del olor a tierra mojada,
y en la rizosfera (región donde el suelo y las raíces de las plantas entran en
contacto) especies de los géneros Rhizobium y Pseudomonas.
Una porción de tierra puede poseer una amplia variedad de microorganismos,

y presentar así varias condiciones donde es posible encontrar una microflora
dominante, completamente diferente, de muestras tomadas de sitios vecinos.
El cambio de microflora varía según el ambiente. Así tenemos por ejemplo

que los terrenos ricos en desechos de frutos son aptos para levaduras, que
fermentan al cual se añaden luego poblaciones de Acetobater, que utilizan el
alcohol producido por las levaduras oxidándolo. En otros, como en campos de
cultivo donde se utiliza estiércol animal para enriquecer la tierra, favorece el
desarrollo de Azotobacter, que en general no crece en suelos de pH cercano a
6. Así la modificación ambiental por lo tanto influye en la difusión de la especies
microbianas, ya sea fermentante, aerobia o anaerobia. También tenemos que la
temperatura, puede variar en un mismo día o en el año favoreciendo
alternativamente grupos diversos de microorganismos. El viento ayuda en el
trasporte de esporas principalmente de hongos. También podemos encontrar
protozoos y microorganismos simbiontes fijadores de nitrógeno. Células que
descomponen la celulosa y otros. De tal forma que variando las condiciones
ambientales se pueden modificar la presencia de diferentes microorganismos, y
hacer que se sobreponga un microorganismo sobre otro.
2. OBJETIVO
 Analizar muestras de suelo para constatar la gran diversidad de

microorganismos que existen en este medio.

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3. MATERIALES
Por estudiante:
 Traer dos tipos de suelos, una muestra de tierra fértil de jardín o del campo
 placa agar saburaud o papa
 1 caldo nutritivo
 Set de tinción de Gram
 6 tubos de TSA
 Azul de lacto fenol
4. PROCEDIMIENTO
a) Pese 1g de terreno y mezcle con 9mL de agua peptonada de dilución; déjelo
reposar de 10 a 15 minutos y luego agítelo bien.
b) Preparar diluciones 10-4, 10-5, 10-6 usando TSB. Si usted piensa que su suelo
tiene muchos microorganismos prepare una dilución 10-7.
c) Para la técnica “pour-plate” colocar 1mL de cada dilución preparada en cajas
de Petri (100 x 20 mm) esterilizada e identificada, haciendo cada dilución en
duplicada. Adicionar a cada caja 15 a 20mL de agar esterilizado y enfriado a
44 – 46ºC y acidificado con solución de ácido tartárico al 10% (esta solución
deberá ser esterilizada separadamente y luego, una cantidad preestablecida
será adicionada al medio base, para llevar el pH a 3.5).
d) Homogenizar con movimientos suaves en superficie plana, en forma de ocho
(cerca de 10 veces) y dejar a temperatura ambiente hasta que se solidifique.
Esta mezcla debe ser hecha inmediatamente después de adicionado el
medio para que no se solidifique el agar del medio.
e) Incubar las cajas en posición invertida a 22-25ºC durante 5 días.
f) Transcurrido el período de incubación, considerar, para el conteo, solamente
las cajas de la misma dilución, que presenten de 30 a 300 colonias. Después
del conteo, multiplicar el promedio de las dos placas por el factor de dilución
correspondiente, expresando el resultado en unidades formadoras de
colonias de mohos y levaduras/g o mL de alimento analizado (escribir el
nombre).
g) Observar el crecimiento de los hongos, su forma, color y obtener una muestra
con cinta adhesiva y colocar sobre un porta objetos conteniendo una gota de
azul de lacto fenol.
h) Observar al microscopio y definir sus estructuras (hifa, esporas, cuerpos
fructíferos).
i) Las levaduras se presentan como colonias pequeñas, convexas, lisas y de
color blanco. Los hongos filamentosos se presentan como colonias regulares,
muchas veces coloreadas, pudiendo ser afelpadas y semejantes al algodón.

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Reporte sus resultados en un cuadro como el que se muestra a seguir:
Muestra Dilución N. de Colonias UFC/g de suelo

Tierra fértil de
jardín
Tierra de terreno
arenoso
Detalle sus resultados analizando su hoja de resultados. Compare sus
resultados con los de su compañero y si amerita con los resultados de los
compañeros de otros grupos.
6. CONCLUSIONES
(Detalle y correlacione con los objetivos)
7. CUESTIONARIO
1. ¿Puede Bacillus subtilis ser usado como controlador biológico, si es así
contra que microorganismos?
2. ¿Qué microorganismos benéficos se encuentran en el suelo y cuál es el
beneficio que ofrecen?

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PRÁCTICA 6
IDENTIFICACIÓN DE HONGOS
1. INTRODUCCIÓN
Los mohos son hongos filamentosos multicelulares, que obtienen su

alimentación de la materia orgánica inanimada o se nutren, como parásitos, de
huéspedes. Algunos hongos son beneficiosos al hombre, auxiliando en la
industria alimenticia, así como en la industria farmacéutica. Otros son
perjudiciales, causando enfermedades vegetales, humanas y animales y dentro
de este grupo hay aquellos productores de micotoxinas como aflatoxinas.
Como en los hongos filamentosos, ciertas levaduras son benéficas, y se las
utiliza en la producción de cerveza, vino y bebidas alcohólicas en general; en la
síntesis de ciertas vitaminas, y/o en otros productos; entretanto, existen aquellas
que deterioran alimentos o provocan enfermedades a los animales y a los
vegetales.
Mohos y levaduras, muchas veces, tienen la capacidad de producir
metabólitos tóxicos conocidos como micotoxinas. Muchas micotoxinas son
compuestos estables y no son destruidos durante el procesamiento o cocimiento
de los alimentos. Algunos hongos y levaduras pueden originar reacciones
alérgicas o infecciones en personas debilitadas. Además de eso, levaduras y
hongos causan deterioro y descomposición de alimentos.
La presencia de hongos y levaduras en los alimentos ofrecen parámetros de
condiciones de higiene deficiente de equipamientos y o ambiente, fallas de
procesamiento, almacenamiento, así como puede denunciar el uso de materia
prima con contaminación excesiva.
2. OBJETIVOS
A) IDENTIFICAR HONGOS A NIVEL DE PLACAS PREPARADAS Y DE
ALIMENTOS DEJADOS A LA INTEMPERIE.
b) Reconocer las estructuras básicas al microscopio de hongos típicos de
ambiente y reconocer los grupos más importantes y sus características
principales.
3. MATERIALES
Por estudiante:
 Uvas, naranjas, limones, brócoli, tomate riñón y pan con crecimiento de
hongos

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4. PROCEDIMEINTO
a) Dejar uvas, naranjas, limones, brócoli, tomate riñón y pan en recipientes
transparentes, limpios y secos por una semana en contacto con el aire.
b) Observar el desarrollo de los hongos a diario.
c) Traer el material el día del laboratorio.
d) Tomar una porción del crecimiento en un trozo de cinta adhesiva.
e) Colocarlos en un portaobjetos y observar las estructuras teñidas al
microscopio.
f) Observar las esporas, su disposición, forma de hifa y presencia de
tabiques.
g) Consultar el pH de cada alimento expuesto.
PRACTICA 12: IDENTIFICACIÓN DE HONGOS
Graficar lo observado en placa, en alimentos y al microscopio
# de Macroscópica Microscópica Observa- Identificación

muestra ciones

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Detalle sus resultados analizando su hoja de resultados. Compare sus
resultados con los de su compañero y si amerita con los resultados de los
compañeros de otros grupos. Rotule las características principales de cada
hongo.
6. CONCLUSIONES
(Detalle y correlaciones con los objetivos)
7. CUESTIONARIO
1. Señale cinco diferencias entre hongos y bacterias

2. Indique porque los hongos crecen fácilmente en los alimentos
expuestos
3. Indique 4 usos industriales de las levaduras

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Escuela de Ciencias Geográficas

Carrera de Ingeniería Geográfica y Planificación Territorial

MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

AUTORA: Dra. Iliana Alcocer Negrete

Nombre del Alumno:

Quito, Abril 2018

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL ÁREA LABORATORIAL

1. Es obligatorio usar mandil de mangas largas, este nunca puede ser

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

21. En caso de accidentes (quemadura, corte, derrame de cultivos, rompimiento

22. Si se derrama o se cae un cultivo vivo, coloque inmediatamente papel

Normas de trabajo en el laboratorio

1. Prepararse para cada práctica de laboratorio leyendo con anticipación las

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

MATERIALES QUE EL ESTUDIANTE DEBE TENER

 Mandil de mangas largas

DIFERENCIAS ENTRE LOS CONCEPTOS DE ESTERILIZACIÓN,

Existen procedimientos básicos y rutinarios en el laboratorio de Microbiología

Desinfección: tiene por objeto la destrucción de microorganismos mediante

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

Desinfectante: es la sustancia química que inhibe o destruye microorganismos

Asepsia: El objetivo de la asepsia o lavado de manos es reducir la flora residente

El número y el tipo de bacterias cutáneas difieren considerablemente, según la

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

La Microbiología es el estudio de los microorganismos, un extenso y variado

a) Demostrar la técnica de asepsia de manos, desinfección de mesa

Por grupo de 2 estudiantes:

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

4.1 Desinfección de la mesa:

a) Colocar abundante alcohol 70% en la mesa de trabajo y esparcirlo con

4.2 Asepsia de manos:

a) Retirar pulseras, relojes, anillos y cualquier otro objeto que se encuentre

4.3 Observación al microscopio las placas preparadas:

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

1. Señale cinco diferencias entre hongos, bacterias y protozoos

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

No Dibujo Procariote/ Microorga- Morfología Presencia o no

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

TÉCNICAS BÁSICAS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE COLONIAS

Una población microbiana en crecimiento en un medio nutritivo, constituye un

En el laboratorio se crean ambientes favorables para el desarrollo de las

Una colonia es el producto de la reproducción asexual por fisión binaria de

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

 Zig=zag en tubos o placas

a) Aprender las técnicas básicas de cultivo microbiano.

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

4.1 Transferencia de caldos

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

a) A partir de un cultivo microbiano en medio sólido (caja de Petri), escoja una

4.3 Transferencia de una colonia desde un tubo a un tubo de agar no

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

4.4 Aislamiento de colonias por estrías

a) A partir de un cultivo microbiano en medio líquido, y con el auxilio del asa

A) Estría Discontinua B) Estría Continua

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

PRÁCTICA 2: MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE CULTIVO

Nombre del Alumno___________________________________________

Procedimiento Resultado Observaciones

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

1. ¿Cuál es la función del agar en el medio de cultivo?

Av. 12 de Octubre 1076 y Ramón Roca

1.1 PREPARO DE FROTIS BACTERIANO

Los frotis de microorganismos se hacen dispersando una pequeña