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Sumario
La sinapsis de las células ciliadas internas (IHC) de la cinta (auditiva) operan con una precisión
temporal excepcional y mantiene un alto nivel de liberación de neurotransmisores.
De cualquier modo, el mecanismo molecular bajo la exocitosis de la sinapsis en las células ciliadas
internas (IHC) son muy desconocidos. Nosotros estudiamos la Otoferlina, una predicha proteína
transmembrana de dominio C2, la cual es defectuosa en una forma recesiva de sordera humana.
Mostramos que la expresión de la otoferlina en las células ciliadas se correlacionan con la
sinaptogénesis aferente y encontramos que la otoferlina se ubica en las vesículas sinápticas
asociadas a la cinta auditiva.
La otoferlina une calcio y muestra una interacción dependiente de calcio con las proteínas SNARE
syntaxin1 y SNAP25.
Los ratones deficientes de Otoferlina (Otof-/-) son profundamente sordos. La exocitosis en las IHCs
Otof -/- están casi completamente abolidas, a pesar de la morfogénesis normal de la cinta auditiva
y la corriente de Calcio.
Así la otoferlina es esencial para un paso tardío en la exocitosis de vesículas sinápticas y puede
actuar como el mayor sensor de activación en la fusión de membrana en las IHC de la sinapsis de
cinta.
Introducción
El órgano de la audición de los mamíferos, la cóclea, decodifica sonidos en amplios intervalos de
frecuencia e intensidad. Este proceso envuelve dos tipos de células mecanosensoriales, las células
ciliadas internas y las externas (IHCs y OHCs) las que transducen la estimulación de sonido hacia
potenciales de receptor. Las OHCs dotadas con electromotilidad, confieren a la cóclea su alta
sensitividad y selectividad de su respuesta a frecuencias de sonido; mientras que las IHCs son las
células sensoriales genuinas transmitiendo información en la estructura temporal y la intensidad
de sonido al sistema nervioso central. La sinapsis de las IHCs funciona como un sistema análogo
con pérdida mínima de información sensorial. En efecto, la liberación de neurotransmisores de la
sinapsis de las IHCs maduras es activada por variaciones gradadas del potencial de membrana,
aumentando con la intensidad del sonido. La respuesta sináptica a las frecuencias que llegan a los
3 kHz es “enganchada” a la onda de sonido de presión. Esta propiedad implica una alta precisión
temporal de la transmisión sináptica, esencial para la percepción del tono y localización de la
fuente de sonido.
Además, esta sinapsis puede sostener una alta tasa de exocitosis. Consistente con estas
características fisiológicas, los canales de calcio Cav1,3 L-type activados por voltaje a cargo de la
exocitosis sináptica activada por calcio en las IHCs son rápidamente activados y desactivados, con
pequeñas o no-inactivaciones.
La sinapsis de las IHCs opera vía liberación multivesicular para activar a los receptores AMPA en las
dendritas de las neuronas auditivas aferentes. Cada IHC hace un contacto sináptico con 10 o 30
aferentes bipolares que difieren en tasas y umbrales de activación espontánea. Notablemente, la
zona activa de la sinapsis de las IHC incluye una estructura osmiófila característica, la cinta
auditiva, en la cual las vesículas sinápticas son “atadas”. Además, la sinapsis de la cinta de IHC
muestra especificidades moleculares. Carece de los componentes principales de la maquinaria de
liberación de neurotransmisores encontrada en las sinapsis convencionales, incluyendo
sinaptofisinas, sinapsinas, y sinaptotagminas I y II.
La elucidación de los mecanismos moleculares bajo las características funcionales específicas de la
sinapsis de las IHCs sigue siendo un reto importante. Nuestro trabajo de hipótesis es que estudios
sobre otoferlina defectuosa en una forma recesiva de sordera profunda prelingual, DFNB9,
pueden dar una idea sobre la maquinaria de las sinapsis de la cinta de IHCs. En efecto, en la cóclea
del ratón adulto, el mRNA de otoferlina se detectó sólo en las IHCs. Por otra parte, la otoferline
pertenece a la familia de proteínas ferlín, y basándose en estudios de fer-1 mutante en C. elegans
tanto en ratones knockout para disferlina y mioferlina, las ferlinas han sido “propuestas” para
activar el proceso de fusión de membranas.
Resultados
Figura 1
(G-H) Detección Immunoelectron microscopía de otoferlina en la región sináptica IHC maduro. La mayor
densidad de partículas de oro de 10 nm se asocia con vesículas atados a la cinta (puntas de flecha), frente a
una dendrita aferente (a). Algunas partículas de oro se asocian con la membrana plasmática presináptica. El
recuadro muestra una ilustración esquemática de la base de una IHC y sus contactos sinápticos con las
dendritas aferentes. Las barras de escala: 100 nm.
-La distribución de otoferlina en células ciliadas cocleares de ratón es paralela (se corresponde)
a la sinaptogénesis aferente
La secuencia predicha de otoferlina murina contiene 6 dominios C2 y un dominio C-terminal
transmembrana. El análisis de inmunohistofluorescencia usando dos anticuerpos policlonales, N14
y N19, y un anticuerpo monoclonal 13ª9, mostró que la otoferlina estaba presente en la cóclea y el
vestíbulo, núcleos cocleares y vestibulares, cerebelo, hipocampo y testículos.
-La otoferlina está asociada con las vesículas sinápticas de las células ciliadas.
Para localizar otoferlina a nivel ultraestructural, se realizó microscopía electrónica de inmunogold
de secciones del órgano de Corti de ratones adultos (P30), centrándose en las regiones sinápticas (
Figuras 1 G y 1H). En todas las secciones continentes de cinta examinadas (17 cintas de 3 ratones),
la mayor parte de las partículas de oro (n = 82) se asociaron con las vesículas sinápticas que
rodean la cinta (55% de las partículas de oro), mientras que 21% de las partículas estaban
presentes en la proximidad inmediata de la membrana plasmática presináptica y 24% estaban
presentes en el citoplasma. Algunas partículas de oro decoradas también el aparato de Golgi y el
retículo endoplásmico de las IHCs (no se muestra). No se observó inmunotinción de otoferlina si el
antisuero primario se omitió o preadsorbió en péptidos diana.
-La otoferlina une Calcio e interactúa con Syntaxin1 y SNAP25 en el modo dependiente de Calcio.
Dominios C2 están presentes en diversas proteínas de la membrana, algunos de los cuales han
sido implicadas en la exocitosis de vesículas sinápticas ( Nalefski y Falke, 1996 ). Uno de sus
representantes más ampliamente estudiadas es la vesícula sináptica proteína de membrana
sinaptotagmina I (Syt I). Esta proteína interactúa con syntaxin1 ( Chapman et al., 1995 , Kee y
Scheller, 1996 , Li et al., 1995 ) y SNAP25 ( Gerona et al., 2000 , Schiavo et al., 1997 , Shao et al.,
1997 , Zhang et al., 2002 ) y se considera como el principal Ca 2 + sensor de rápida de la exocitosis
de vesículas sinápticas en las sinapsis convencionales (revisado en [ Chapman, 2002 ] y [ Sudhof,
2004 ]). La localización sináptica de otoferlina y sus dominios C2 previstos otoferlina sugirió que
podría desempeñar un papel similar en la fusión de vesículas sinápticas IHC. Por lo tanto, investigó
si otoferlina podría obligar a Ca 2 + e interactuar con estos dos miembros del complejo SNARE, los
cuales también están presentes en los IHCs ( EYBALIN et al., 2002 , Safieddine y Wenthold, 1999 ).
-Ratones mutantes defectuosos para otoferlina tienen una discapacidad profunda de audición.
Para estudiar la función de otoferlina in vivo, hemos producido ratones transgénicos que carecen
de los exones OTOF 14 y 15, que codifican la mayor parte de su dominio C2C ( Figura 3 A). Las dos
líneas de ratones producidos a partir del tallo (ES) líneas de células embrionarias recombinados
independientes ( Figura 3 B) muestran fenotipo similar. Se observó segregación mendeliana
normal del alelo suprimido OTOF (129 y ratones de tipo salvaje en 65 litros 128 homocigotos
tm1Ugds/tm1Ugds OTOF, en adelante denominada OTOF - / -, - 261 heterocigotos OTOF + /).
Experimentos de RT-PCR sobre cócleas OTOF - / - confirmaron la presencia de un ARNm OTOF
recombinante que carece de la secuencia codificada por los exones 14 y 15 ( figura S4 ), y por lo
tanto espera que resulte en un cambio de marco y un codón de parada prematuro. La ausencia de
una forma truncada de otoferlina en homocigotos mutantes se demostró por experimentos de
inmunotransferencia y immunohistolabeling utilizando N14, C19, y 13a9 anticuerpos ( Figuras 3 y
3E D y datos no presentados) OTOF -. / - ratones no mostraron defectos morfológicos evidentes.
Evaluación bruto de la función vestibular (véase Procedimientos Experimentales )se llevó a cabo
en el P30 (n = 16) no mostró evidencia de disfunción vestibular en los mutantes. Un defecto sutil o
compensación por las entradas visuales y / o propioceptiva, sin embargo, no pueden ser excluidos
( de Caprona et al., 2004 ).
La figura 2
(B) Los extractos de células HEK293 productoras otoferlina (OTOF) y syntaxin1 o otoferlina y SNAP25 se
sometieron a inmunoprecipitación (IP) con el anticuerpo otoferlina 13a9 o con un ratón sin relación IgG.
Tanto syntaxin1 y SNAP25 fueron coimmunoprecipitated con otoferlina.
(C) La misma ip se llevó a cabo utilizando un extracto de neuroepitelio coclear. Tanto syntaxin1 y SNAP25
fueron coimmunoprecipitated con otoferlina.
(D y E) Efecto de la concentración de Ca2 + en la unión de otoferlina a syntaxin1 (D) y SNAP25 (E) GFP-
etiquetados otoferlina se inmovilizó sobre una columna y se incubaron con cantidades iguales de de longitud
completa radiomarcada syntaxin1 o SNAP25, en la presencia de 2 mM EGTA o varias concentraciones de Ca2
+ libre. La fracción de proteína unida se determinó por autorradiografía y se cuantificó por phosphorimaging.
Los valores normalizados se representaron gráficamente. Los datos representan la media ± SEM calcula a
partir de tres ensayos independientes. Curva de ajuste y cálculo de las CE 50 se realizaron con el software
GraphPad prisma.
(F) Cartografía de la región de unión otoferlina en syntaxin1. Syntaxin1 esquema adaptado de Margittai et
al., 2003 , que indica el dominio Habc, el motivo SNARE, y el dominio transmembrana (TM). Formas de
longitud completa (FL) o truncados (Δ1 y Δ2) de syntaxin1 se inmovilizaron en columnas como proteínas de
fusión GST en presencia de 10 mM Ca 2 +. Radiomarcado OtofΔC2A-C se une a FL, Δ1 pero no Δ2.
Se analizaron las respuestas auditivas del tronco cerebral (ABR), lo que refleja la respuesta
eléctrica de las neuronas del ganglio coclear y los núcleos de la vía auditiva central a la
estimulación de sonido (banda ancha clic o ráfagas de tonos puros de 5, 10, 15, 20 y 40 kHz), en
OTOF - / -, OTOF + / -, y la camada de tipo salvaje, de la edad de 3 semanas en adelante. De tipo
salvaje (n = 12) y OTOF + / - ratones (n = 15) producen formas de onda de ABR característica en
respuesta a todos los estímulos, con umbrales de nivel de presión de sonido entre 20 y 45 dB
(SPL), mientras que OTOF - / - compañeros de camada ( n = 12) no mostró ABR visible, incluso para
intensidades de estímulo de 100 dB SPL ( Figuras 4 A y 4B). Hemos investigado si la deficiencia
auditiva involucró un defecto de las OHC por productos de distorsión de emisiones otoacústicas
(DPOAE), que indican la actividad de amplificación de las OHC (revisado en [ Kim, 1986 ]). Los
niveles de DPOAE no fueron significativamente diferentes en OTOF - / -, OTOF + / -, y OTOF + / +
ratones, independientemente de la frecuencia y la intensidad del estímulo utilizado ( Figura 4 D). A
continuación, se exploró si el nervio auditivo de OTOF - / - ratones respondió a dirigir la
estimulación eléctrica. Las respuestas cerebrales eléctricamente evocadas (eEBRs) se suscitó en
OTOF - / - ratones, pero requieren niveles de corriente más alta que en OTOF + / + littermates (
Figura 4 C). Por lo tanto, ambos OHCs y la vía auditiva aferente del OTOF adultos - / - ratones son
funcionales y la discapacidad auditiva profunda en estos ratones probablemente se debe a un
defecto de IHC.
Figura 3
(A) Los mapas de la construcción de la orientación, los alelos de tipo salvaje OTOF, y los alelos mutantes
resultantes, lo que indica la sustitución de los exones 14 y 15 por un sitio interno de entrada ribosomal (IRES)-
higromicina casete colocada en la orientación transcripcional opuesta y la introducción de nueva Bgl II y los
sitios Sph I. Las cajas negras representan los exones, puntas de flecha indican los sitios loxP. El casete de
higromicina era secundario eliminado usando la recombinasa Cre, generando el alelo tm1Ugds OTOF. Se
indican las dos sondas utilizadas para validar la recombinación homóloga en células ES mediante análisis de
transferencia de Southern.
(B) análisis de Southern blot de Bgl II-Sph I y digerido con ADN genómico derivado a partir de dos clones de
células ES resistentes a higromicina independientes.
(C) Análisis de PCR de los de tipo salvaje (+ / +), heterocigotos - mutantes, y homocigotos (- / -) (+ /) ratones
obtiene después de cruzar las líneas iniciales de ratón con Pgk-1-Cre ratones transgénicos para eliminar la
higromicina casete.
(E) tinción Immunohistofluorescence para otoferlina con anticuerpo N14 (verde) y phalloidin (rojo), en
preparaciones completas de los órganos de Corti de ratones P6, que muestran una intensa tinción otoferlina
de centros de salud integrados y OHCS en ratones de tipo salvaje (+ / +) y un pérdida completa de la tinción
en ratones mutantes homocigotos (- / -). Las barras de escala: 10 micras.
Figura 4
(A) grabaciones ABR representativos de OTOF + / + (líneas negras) y OTOF - / - (líneas grises) P30 ratones a
20-100 dB SPL de clics de banda ancha. Números romanos marcan los picos de las ondas ABR estándar. No
hay forma de onda de ABR es visible en la OTOF - / - grabaciones de ratón.
(B) Media umbrales ABR (y la media ± SEM) para los de tipo salvaje (círculos cerrados, n = 12), (círculos a
medio llenar, n = 15), heterocigotos y homocigotos mutantes (círculos blancos, n = 12) de los ratones. No se
encontraron diferencias significativas en el umbral entre los ratones de tipo salvaje y heterocigotos (prueba
de la t de Student, p> 0,05). Por el contrario, todo OTOF - / - ratones tenían umbrales por encima de 100/110
dB SPL pico ratones equivalentes y varios mostradas no wave ABR, incluso en la más alta intensidad de
prueba (110 dB). La línea de puntos: umbrales promedio ABR para referencia CBA / J ratones.
(C) evocada eléctricamente evocados (eEBR) en una de tipo salvaje + / + (línea de color negro) y un mutante
homocigoto - ratón (línea gris) estimulada por un electrodo en la ventana redonda - /. La intensidad de la
estimulación eléctrica (en mV) se indica en el lado derecho de las trazas. En eEBR, onda que no es visible, ya
que los procesos sinápticos IHC se pasan por alto. Wave IV y las ondas posteriores, correspondientes a las
respuestas de los centros auditivos más altos, son visibles en ambas trazas. Más intensa estimulación
eléctrica se requiere para provocar EABR en OTOF - / - ratones, probablemente debido a una disminución del
número de neuronas del ganglio coclear funcionales (ver Tabla 1 ).
(D) La media (y la media ± SEM) funciones de crecimiento de DPOAE en el 7,5, 10 y 15 kHz para los estímulos
equilevel, aumentando gradualmente desde 30 hasta 40 a 70 dB SPL en la de tipo salvaje (cuadrados
rellenos) y homocigotos mutantes cuadrados (abiertas ) ratones. No se observó ninguna diferencia
significativa entre los ratones de tipo salvaje y mutante (ANOVA, p> 0,05).
-Alteración de la exocitosis activada por calcio en la sinapsis de las células ciliadas en ratones
Otof -/-
Discusión
Los ratones mutantes que carecen otoferlina son
profundamente sordos, sin ABR detectable en
todas las frecuencias de sonido a prueba. DPOAE
muestran que se mantiene la amplificación coclear,
lo que implica que tanto el proceso de transducción
mecano-eléctrica y la electromotilidad de OHCs no
se ven afectados. Además, eEBRs, registrados
después de la estimulación eléctrica directa de las
neuronas del ganglio coclear, indican que la vía
auditiva, a partir de estas neuronas a través de los núcleos del tronco cerebral auditivo para el
colículo inferior, es funcional. Por lo tanto, un defecto que afecta a IHCs y / o sus contactos
sinápticos de nervio aferente parece ser responsable de la pérdida de audición en ratones OTOF - /
-. La supresión casi completa de exocitosis sináptica de IHCs en respuesta a la despolarización de
las células, a pesar de IHC normal y sinapsis ultraestructura (al menos hasta P6), es consistente con
un fracaso de la liberación de neurotransmisores IHC.
-Otoferlina actúa “río abajo” desde el acoplamiento de las vesículas sinápticas a la membrana
plasmática.
Entonces, ¿qué hace exactamente otoferlina? Cuando en la cascada de la exocitosis de vesículas
sinápticas se produce el defecto responsable de la sordera? Las vesículas sinápticas se dirigen
primero al sitio de fusión de la membrana plasmática presináptica por medio de interacciones
proteína-proteína que implican proteínas SNARE, proteínas de la familia Rab, y Munc18 (revisado
en [ Jahn et al., 2003 ] y [ Robinson y Martin, 1998 ]). Asociada a vesículas de proteína de
membrana (VAMP / sinaptobrevina) se une a syntaxin1 y SNAP25, que son preferentemente
anclado a la membrana plasmática presináptica ( Fasshauer et al., 1998 ), formando de este modo
el complejo SNARE y trayendo la vesícula sináptica y la membrana plasmática en contacto
estrecho en el sitio de fusión (revisado en [ Jahn et al., 2003 ] y [ Sudhof, 2004 ]). Las mismas
proteínas SNARE están presentes en los IHCs y pueden por lo tanto estar implicados en la
liberación de neurotransmisores en estas células ( Safieddine y Wenthold, 1999 ), tal como fue
revisado en [ Lenzi y von Gersdorff, 2001 ]). De tipo salvaje y OTOF - / - ratones tenían números
similares de vesículas atados a cintas y se acopló a la membrana plasmática presináptica por
debajo de las cintas, lo que indica que ni la biogénesis ni el acoplamiento de vesículas sinápticas a
la membrana plasmática presináptica se vieron comprometidas en estos mutantes.
Por lo tanto, los defectos de Otoferlin perjudican la exocitosis de IHC aguas abajo de la etapa de
acoplamiento.
Una vez acoplado a la membrana plasmática presináptica, la vesícula sináptica se somete a
cebado, un paso que implica la maduración Munc13-1 y otros factores ( Augustin et al., 1999 ),
necesarios para el Ca 2 +-triggered exocitosis de las vesículas sinápticas (revisado en [ Klenchin y
Martin, 2000 ]). Estudios bioquímicos y genéticos detallados han proporcionado pruebas
convincentes de que syt I, una proteína transmembrana que contiene el dominio C2, es el principal
sensor de Ca 2 + para el último paso de la liberación de neurotransmisores rápido y sincrónico en
las sinapsis del sistema nervioso central (revisado en [ Chapman, 2002 ] y [ Sudhof, 2004 ]). En
respuesta al incremento por la acción de la activación por potencial en la concentración pre
sináptica de calcio, Syt que une hasta cinco iones Ca 2 + y conduce la fusión dependiente de
SNARES de las vesículas cebadas con la membrana plasmática presináptica. Aunque el papel de
otoferlina en el cebado no se puede descartar, vale la pena destacar que la proteína carece del
dominio identificado como mínimo requerido para esta actividad ( Stevens et al., 2005 ). En
contraste, varias líneas de evidencia sugieren que otoferlina es un sensor de Ca 2 + en la IHC cinta
sinapsis. En primer lugar, ni syt I ni su pariente cercano Syt II ha sido detectado en el IHC (
Safieddine y Wenthold, 1999 ). En segundo lugar, otoferlina es una proteína transmembrana
dominio C2 de las vesículas sinápticas IHC y se puede unir Ca 2 +, al menos, a través de su dominio
C2D. En tercer lugar, otoferlina interactúa con syntaxin1 y SNAP25, y estas interacciones se
potenció por Ca 2 +, como se informó para syt I ( Chapman et al., 1995 , Gerona et al., 2000 ,
Schiavo et al., 1997 , Shao et al. , 1997 ). En cuarto lugar, otoferlina y syt I se unen al mismo sitio
en syntaxin1 in vitro ( Kee y Scheller, 1996 ). Por último, el análisis biofísico de la exocitosis de la
célula ciliada es consistente con una pérdida de la sensibilidad al Ca 2 + de la maquinariasinaptica
exocitica de IHCs. De hecho, la abolición de IHC exocitosis rápida en respuesta a la despolarización
de membrana o Ca 2 + uncaging se parece mucho al fenotipo observado en exocytic Syt células
neuroendocrinas I-deficientes ( Voets et al., 2001 ). En ambos casos, la exocitosis de la piscina
fácilmente liberable de vesículas se abolió casi normal, a pesar de Ca 2 + afluencia, y el
componente rápido de la ráfaga exocítica en respuesta a la flash fotólisis de jaula Ca 2 + se perdió,
mientras que el componente lento era ( al menos en parte) mantenido.
Así, los resultados actuales se extienden las similitudes funcionales identificadas entre las familias
sinaptotagmina y ferlin. De hecho, algunos miembros de estas dos familias de proteínas Syt I y II
Syt ( Geppert et al., 1994 , Nagy et al., 2006 ) y otoferlina (este estudio), están implicadas en la
exocitosis sináptica, mientras que otros-Syt VII ( Chakrabarti et al., 2003 , Reddy et al., 2001 ) y la
disferlina ( Bansal et al., 2003 ), están involucrados en el resellado de la membrana plasmática
después de la lesión, lo que también implica la fusión de membranas Ca 2 +-dependiente.
(A) Ca 2 + corrientes (arriba) y Δ C respuestas m (inferior) del representante OTOF + / + (negro) y OTOF - / -
(gris) IHCs de ratones P6 a 20 ms despolarización a pico de Ca 2 + potencial actual . Las grabaciones en (A-C)
se realizaron en la configuración perforada-patch.
(B) Ca 2 + relaciones actuales I / V de OTOF + / + (negro) y OTOF - / - (gris) de centros de salud integrados P6
(círculos abiertos) y P15 ratones (cuadrados cerrados): magnífico promedios, incluyendo uno de E / V relación
de cada célula (ver C para n).
(C) Cinética de la exocitosis (parte superior) y correspondiente Ca 2 + integrales actuales (parte inferior) de +
/ + (negro) y OTOF OTOF - / - (gris) de centros de salud integrados P6 (círculos abiertos) y P15 (cuadrados
cerrados) ratones. Δ C m se obtuvieron de múltiples despolarizaciones de diferentes duraciones de pico de
potencial de corriente de calcio en cada IHC y representan grandes promedios calculados a partir de los
medios de la IHC individuo.
(D) Representante exocytic Δ C m OTOF + / + (negro) y OTOF - / - (gris) centros de salud integrados (P15
ratones) en respuesta a la fotólisis de destello de Ca 2 +-cargado DM-nitrofen. Top muestra radiométrica [Ca
2 +] i de medición, utilizando el indicador de calcio tinte Furaptra. [Ca2 +] i se estima a partir de los valores
de la relación de las señales de fluorescencia medidos durante un periodo de iluminación de 13 ms a 350 y
380 nm. Antes de que el flash, [Ca 2 +] i era demasiado baja para una medición precisa de este tinte de baja
afinidad. Parte inferior muestra la grabación de Δ C m en respuesta a un destello UV (en el tiempo cero): la
línea gris oscuro representa una versión a escala de la grabación para OTOF - / - ratones (factor de escala de
5,7 para que coincida con la amplitud máxima de la OTOF + / + flash de la respuesta).
(E) En primer lugar 200 ms después de estas Δ C m respuestas en una escala de tiempo expandida. El OTOF +
/ + Δ C m respuesta (negro) estaba bien equipado por una función doble exponencial con constantes de
tiempo de 3,8 y 63,5 ms, respectivamente (línea de puntos superpuesta), mientras que el OTOF - / - respuesta
(gris claro) se ajustó mediante una sola función exponencial con una constante de 98,2 ms Tiempo.
Procedimientos experimentales
INMUNOHISTOFLUORESCENCIA
El análisis de inmunofluorescencia se llevó a cabo en secciones de tejido y preparados todo el
montaje cocleares como se describe ( Safieddine y Wenthold, 1997 , Safieddine et al., 2002 ). Los
anticuerpos primarios contra otoferlina, CtBP2, y GluR2-3 fueron utilizados en diluciones de 1:500,
1:500, y 1:200, respectivamente. Las fotomicrografías se tomaron con un microscopio de luz
Aristoplan equipado con óptica de epifluorescencia (Leitz, Wetzlar) o con un microscopio de
barrido láser confocal (Zeiss, Pasteur, Ciencias de imágenes de células Fondo). Deconvolución y
reconstrucción se realizaron con Huygens2 (Scientific Volume Imaging, Hilversum, Países Bajos) y
el software Osirix (Antoine Rosset, Departamento de Radiología, Hospital Universitario de Ginebra,
Suiza), respectivamente.
MICROSCOPIA ELECTRONICA
Cócleas ratón se fijaron como se ha descrito ( Matsubara et al., 1996 ). Los órganos de Corti se
microdissected y procesados por la técnica de disminución de temperatura progresiva ( Robertson
et al., 1992 ). Inmunoelectrónica etiquetado se llevó a cabo como se describe ( Agulhon et al.,
2003 ), utilizando el anticuerpo N14 en la dilución 1:200. Para los análisis morfológicos, cócleas se
fijaron con paraformaldehído al 4% y 2% de glutaraldehído en PBS pH 7,4 y se sumergieron en la
solución de fijación durante 2 horas. Luego se fijaron posteriormente por incubación durante la
noche en tetróxido de osmio al 1% a 4 ° C, se deshidrataron en concentraciones de acetona
graduadas, y embebido en resina epoxi de baja viscosidad de Spurr. Semithin secciones (1 m)
fueron teñidas con azul de toluidina para microscopía óptica. La sección ultrafina estaba
manchada con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examina bajo un microscopio de
electrones Jeol1200EX.
Fotólisis flash se llevó a cabo como se describe en Beutner et al., 2001 y Procedimientos
Experimentales suplementarios .
MANEJO DE ANIMALES
Todos los experimentos reportados en esta publicación se llevaron a cabo de acuerdo con las
directrices de bienestar y del INSERM Instituto Pasteur.
DATOS SUPLEMENTARIOS