Você está na página 1de 16

Débora Dettmer – ATM19

1
Medicina PUCRS

GENÉTICA P1 – Prof.ª Deise – deise.friedrich@pucrs.br

REVISÃO DE CONTEÚDOS BÁSICOS

Cromossomo condensado e com duas cromátides irmãs: apenas durante a metáfase


 Unido na região do centrômero
 Separação na anáfase
 2x o conteúdo de DNA necessário
 Fase máxima de condensação
 Diminuição de 10.000x

Célula em interfase
 Apenas cromatina = DNA enrolado em proteínas (histonas) para uma condensação que faça com que ele
caiba no núcleo
 Desenrolado
 Cada dupla hélice dá dias voltas ao redor das histonas
 Cada duas voltas = nucleossomo (primeiro nível de compactação do DNA)
 Nucleossomos se torcem um sobre o outro para se compactarem mais = diminui em 500x o tamanho dessa
dupla hélice
 No núcleo: diversos pedaços de dupla-hélice = diversos cromossomos
 46 dupla-hélices (cromossomos) condensados (23 dupla-hélices + par sexual)

Nucleotídeos: A, T, G, C
Hemácia: célula anucleada

O que é um gene?
 Sequência de nucleotídeos que codifica algo
 Pedaço da dupla-hélice, sequência de nucleotídeos, que tem um código que gera uma mutação
 Uma sequencia de nucleotídeos que não codifica nada é apenas DNA, não é gene
 Para ser gene tem que codificar algo
 A posição de cada gene é sempre a mesma
 Todo mundo tem todos os genes, o que podemos ter é versões diferentes do mesmo gene (alterações na
sequencia que fazem com que a proteína gerada seja diferente)
 Todas as células têm todos os genes

Cromossomo duplicado: os dois lados dele tem o mesmo gene (cópias)

Nomenclatura: relação com a posição do centrômero


Telocêntrico: seres humanos não possuem
Metacêntrico: centrômero no meio do cromossomo
Submetacêntrico: uma das extremidades é um pouco maior que a outra (braço curto: p, braço longo: q)
Acrocêntrico: cromossomos bem pequenos, centrômero quase na extremidade do braço curto
Braço de cima: p; braço de baixo: q
Essa é a primeira forma de diferenciar os cromossomos na hora de arrumá-los no cariótipo, por exemplo
Cariótipo: cromossomos em metáfase
Débora Dettmer – ATM19
2
Medicina PUCRS

Cromossomo Y é acrocêntrico
Corante para corar o cromossomo: giemsa. Ele se liga mais nas regiões de heterocromatina e menos nas regiões de
eucromatina
 Heterocromatina: não expressa, gene de DNA repetitivo e sem função, não codifica nenhuma proteína
 Eucromatina: cromatina que expressa algo, região transcricionalmente ativa, grande concentração de genes,
está mais frouxa (para as enzimas conseguirem se ligar nelas)
 Mais de 50% do cromossomo Y é heterocromatina

3p14 = cromossomo 3, braço p, lócus 14  aqui tem algo que, quando alterado, faz a pessoa desenvolver câncer
renal
Lócus: posições fixas. A investigação de dados genético de qualquer pessoa é realizada através da comparação entre
diferentes locais do DNA (a denominação de local/locais, em genômica utiliza o termo em latim lócus/loci , ou
apenas lócus em português), que variam entre as pessoas da população. As diferentes formas que o DNA pode
apresentar para um mesmo lócus são chamadas alelos, e cada indivíduo possui dois alelos para cada lócus: um de
origem materna e o outro de origem paterna.
Pode haver mais um gene ativo em um lócus
Cada gene tem o seu lócus

Cariótipo: conjunto de uma cópia de cada um dos cromossomos humanos (cariograma)


Padrão de bandas dos cromossomos é igual em cada pessoa (pode haver mutações)
Nem todo gene é ativo a vida inteira, alguns são silenciados durante a vida (viram heterocromatina) e outros são
ativados (viram eucromatina)

Informações:
 22 pares de cromossomos AUTOSSOMOS (numerados de 1 a 22)
 Um par de cromossomos SEXUAIS X e Y: Mulheres XX; Homens XY
 Somatório: 44 autossômicos + 2 sexuais = 46 cromossomos
 Padrão: Mulheres: 46, XX Homens: 46, XY

Genótipo: quais variações de gene eu tenho


Fenótipo: o que é expresso (nem sempre dá pra ver a olho nu); como a proteína age, função gerada a partir daquele
genótipo, não é só o que enxergamos

Tradução: produção de uma proteína


Aminoácidos: constituinte básico do monômero de uma proteína; existem 20 aa’s codificantes. Todas as proteínas
que existem são variações dos 20 aa’s. conformação da proteína depende do tipo de aa’s que ela tem
Função de uma proteína é, muitas vezes, dependente de sua conformação
Tradução sempre ocorre no citoplasma feira pelo ribossomo
Grande parte do funcionamento e da estrutura do nosso organismo é dado por proteínas
Débora Dettmer – ATM19
3
Medicina PUCRS

Variabilidade genética, diversidade individual


 Mesma espécie [Homo sapiens], mesmos cromossomos, mesmos lócus, sequência de DNA diferentes
 Todos nós temos os mesmo cromossomos, os mesmos lócus, mas temos sequencias de DNA diferentes! Isso
que dá a nossa variabilidade de uma pessoa para outra
 Podemos ter diferenças dentro dos genes e na sequencia deles: ALELOS
 Sequência diferente de genes = alelos diferentes (Às vezes muda apenas um nucleotídeo só)
 Alelo: uma das versões do mesmo gene (definição clássica)
 Gene monomórfico: tem apenas uma sequência (todo mundo tem ele com os mesmo nucleotídeos nas
mesmas posições)  muito raro
 De maneira geral os genes são polimórficos  se eu tenho mais de duas sequências diferentes eu já tenho
mais de dois alelos
 Gene ABO  existem 3 alelos e 4 fenótipos
Fenótipos: A, B, AB, O
Alelos: I^A, I^B, i
Genótipo: os dois alelos que eu possuo; ex: I^A I^B, I^A IÂ, i i...
 Alelos: sequências diferentes do mesmo gene
 Mutação: uma troca. Não quer dizer que vá causar problemas
 Alelo com frequência maior que 1% = polimorfismo
Alelo com frequência menor de 1% = mutação

ALELO: O Alelo é uma das diferentes versões do lócus/gene. Quando um segmento que ocupa um lugar no genoma
(lócus), tem versões diferentes, dá-se o nome de ‘alelo’ a cada uma dessas diferentes versões. Um alelo é formado
sempre que uma sequência original de um segmento sofre algum tipo de mutação (mudança) aleatória que não é
eliminada ou corrigida, ficando, portanto, presente na espécie. Imagine originalmente a sequência de DNA de um
lócus passando sempre de forma idêntica de geração em geração; em determinado momento, pode ocorrer uma
mutação (que seria uma mudança qualquer num zigoto, ou num gameta, por exemplo), que acaba por modificar a
sequência original do lócus. Se essa mutação não for corrigida, ou se ela não for responsável pela morte do indivíduo
onde ela ocorreu (sendo assim eliminada), ela poderá ser passada para os descendentes deste indivíduo. É desta
forma que se formam os alelos dos lócus/genes. Alelo é, então, uma de várias formas alternativas de um gene ou
sequência de DNA em uma posição específica do cromossomo (lócus). Para cada lócus autossômico um indivíduo
diploide possui dois alelos: um herdado do pai e um da mãe. Mesmo que para um determinado lócus existam mais
de dois alelos diferentes na espécie [por exemplo, os do grupo sanguíneo ABO, onde existe o alelo ‘A’, o alelo ‘B’ e o
alelo ‘O’], cada indivíduo normal herda sempre apenas dois.

Homo e heterozigotos:
 Alelo dominante: é o que se expressa no heterozigoto (o DNA do recessivo até é transcrito, mas não vemos a
sua expressão)

Haplótipo
 Região do cromossomo que sempre passa em blocos de uma geração pra outra
 Cromossomos Y é, praticamente, um grande aplótipo (passa os mesmos alelos de pai pra filho)


Débora Dettmer – ATM19
4
Medicina PUCRS

Indivíduo Diploide
 Para um lócus autossômico (ou do cromossomo X em mulheres): Alelo herdado do pai é igual ao alelo
herdado da mãe → Indivíduo HOMOzigoto. Alelo herdado do pai ≠ Alelo herdado da mãe → Indivíduo
HETEROzigoto
 Usa-se HEMIzigoto para lócus do cromossomo X e Y nos homens, pois estão em dose única

Definição pelo conceito biológico e médico


 Mutação no DNA: Qualquer alteração na sequência original de bases do DNA, a qual pode ser uma inversão,
uma deleção, uma inserção ou uma duplicação, por exemplo. Na área médica, a mutação no DNA, que pode
ocorrer em uma única base nucleotídica ou em um grupo de bases, é responsável pela manifestação de um
fenótipo patológico [doença].
 Polimorfismo: Quando uma mutação altera um lócus gênico ela cria um alelo; quando esse alelo alterado já
está presente em, pelo menos, 1% dos indivíduos da população, chama-se ao lócus gênico de polimórfico
(poli = muitos; morfismo = formas). Na área médica, se considera polimórfica a alteração que não tem efeito
patológico no fenótipo.

SNP: só um alelo troca

ORGANIZAÇÃO DO GENOMA HUMANO

 Genoma nuclear: mais de 26 mil genes, 3,2x109 pares de bases ou 3 Gb, um pouco mais de 1% codificante de
proteínas
 3 Gb distribuídos em 24 tipos diferentes de moléculas lineares de DNA dupla-fita
 Em média, 41% de pares G+C
 DNA associado a proteínas histonas e não-histonas
 2 cópias na maioria das células somáticas (diploides)
 Variação na distribuição de eucromatina e heterocromatina constitutiva entre os cromossomos
 Variação também no número de genes entre os cromossomos

 Genoma mitocondrial: 37 genes, 19,6 kb


 DNA dupla-fita circular
 Fita pesada – Gs (concentra quase todas as guaninas)
 Fita leve – Cs (concentra quase todas as citosinas)
 Quantidade de mtDNA varia entre os tipos celulares  o número de mitocôndrias varia de acordo com o
tipo celular (se ela se divide muito, ela vai ter muitas mitocôndrias; se ela se divide pouco, ela vai ter menos)
 Genes sem íntrons  isso é característica de DNA de bactéria
 Quantidade muito pequena de sequência não codificante  entre os genes existe um pouquinho de DNA
não codificante, mas não é um íntron todo e tal
 Alguns genes parcialmente sobrepostos  economia de tamanho, genes transcritos no sentido oposto
 Transcrição gera grandes transcritos primários
 Código genético diferente do nuclear, código genético só dela; alguns códons de parada dela são diferentes
também
Débora Dettmer – ATM19
5
Medicina PUCRS


 Distrofia muscular de Duchene: vem pelo X
 Gene distrofina: maior gene humano em pares de bases pq tem íntrons enormes e enxós pequenos


 Pseudogenes: não são mais transcritos
 Tamanho médio de uma proteína: 430 aa’s (cada aa tem 3 nucleotídeos)
 Pseudogene: tem toda a sequencia de um gene que é transcrito, mas ele não é mais por alguma mutação ao
longo da evolução
 DNA satélite: centrômero
 Famílias gênicas:
 Similaridade de sequência e estrutura dos produtos proteicos, gerados por duplicação gênica, incluindo
cópias que perderam a função (pseudogenes)
 Superfamílias gênicas:
 Sequências de DNA cujos produtos possuem estruturas e funcionalidades relacionadas porém com pouca
homologia de sequência

 Transposons/retrotransposons
 Sequências que saem de um lugar e se religam em outro
 Quase todo DNA repetitivo não codificante disperso no genoma é derivado de transposons.
 São sequências móveis de DNA que podem migrar para diferentes regiões do genoma
 Retrotransposons: SINE (família Alu) e LINE
 Transposons de DNA: sequência de DNA excisada e reinserida em outro local

 Sequências Alu: surgiram nos primatas


 ~280 pb em extensão
 >10% do genoma
 1 a cada 3 Kb

 Retrotransposons e doenças:
 LINE - pacientes esporádicos com hemofilia A - diversos Kb de tamanho inseridos em um exon do gene do
fator VIII, inativando o gene
 Alu - hipercolesterolemia familiar - presente nos íntrons do gene do receptor de LDL gerando duplicação de
enxós;
Débora Dettmer – ATM19
6
Medicina PUCRS

- α-talassemia pela deleção de um gene da α- globina

 Sequências repetitivas em Tandem


 Heterocromatina constitutiva 6,5% do genoma humano
 DNA satélite: arranjos com centenas de Kbs, associado à heterocromatina, principalmente a centromérica
 Minissatélites: 0,1 a 20 Kb, nos telômeros ou próximo a eles, VNTRs
 Microssatélites: <100 pb, unidade de repetição de 1 a 4 pb, amplamente dispersos por todos os
cromossomos, expansão de repetições dentro de genes associado com a doença de Huntington (número de
repetição aumentado altera a proteína que se acumula nos neurônios e leva a morte neuronal), distrofia
muscular miotônica, síndrome do X frágil

 Genes de RNA
 MicroRNA’s
- pequena sequência de RNA que tem função no mecanismo de regulação da expressão
- Anela-se ao RNAm no citosol e impede que ele codifique uma proteína
- miRNA
- >1000 diferentes, citoplasmáticos
- regulam a expressão de conjuntos selecionados de genes-alvo pelo pareamento de bases com os
transcritos - inibe a tradução.
 Histonas responsáveis pelo nível mais básico de compactação, o nucleossomo, que reduz em 1/3 o comprimento
inicial do DNA
 DNA compactado porém de uma forma que esteja prontamente disponível
 Compactação de ~10.000 vezes - cromossomo mitótico
 ~500 vezes - interfásico
 cromossomo interfásico é dinâmico
 Cada cromossomo interfásico tende a ocupar seu próprio e discreto território no núcleo
 Posição alterada quando um gene é muito expresso
 Ambientes bioquímicos distintos dentro do núcleo

 Proteína P53  faz a manutenção e a parada do ciclo celular


Quando ela falta a célula continua se dividindo loucamente e pode virar um câncer

Regulação da estrutura da cromatina


 Cromossomos em forma de cromatina tem uma posição preferencial
 alguns tipos de estruturas da cromatina podem ser herdados
 a atividade de um gene depende da sua posição relativa à proximidade de uma região de heterocromatina
 Epigenética: informações que são herdadas mas não estão informadas no DNA
 Genes metilados não são expressos

Modificações covalentes de histonas:


 acetilação de lisinas
 mono, di e trimetilação de lisina
 fosforilação de serinas
 código de histonas
 As modificações são reversíveis - uma enzima modifica a cadeia lateral do Aa e outra remove a modificação

REPLICAÇÃO

Características importantes do DNA e da dulpa-hélice


Débora Dettmer – ATM19
7
Medicina PUCRS

Ligações fosfodiester: ligação covalente produzida entre a hidroxila e o carbono 5 da pentose

Dupla-hélice: fitas complementares e antiparalelas


Uma fita no sentido 5’  3’ e a complementar no sentido 3’  5’ (fitas antiparalelas)

Desnaturação e renaturação
 Se colocarmos o DNA em ambiente com alta temperatura, a fita desnatura, logo ocorre a separação (quebra
das pontes de hidrogênio).
 No momento em que ocorre o resfriamento as fitas voltam a se anelar, ocorre a ‘renaturação’.
 O aumento de ph também pode causar a desnaturação.

Início da replicação:
 Obs: ver vídeo que está no moodle
 Regiões chamadas de origem da replicação - múltiplas em cromossomos eucarióticos
 Direção de crescimento: 5’è3’
 A replicação é semi-conservativa e semi-descontínua

Replicação:
1) Ocorre a quebra das pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas essa quebra começa em ligações A-
T, pois possuem somente duas pontes de H a enzima que efetua a separação das hélices é a helicase após
ocorrer a separação é necessário que proteínas SSB (proteínas ligantes de fitas simples) se liguem na fita que
está separada para impedir que ela volte a se unir, e assim manter as fitas de DNA separadas para que
ocorra a replicação.
2) Quando as fitas já estão separadas, chega a enzima DNA polimerase que tem como função polimerização de
nucleotídeos da ligação fosfodiester com a finalidade de produzir uma fita complementar do DNA. Para que
a DNA polimerase consiga agir o primeiro nucleotídeo já tem que estar ligado no DNA.
Débora Dettmer – ATM19
8
Medicina PUCRS

a) Esse primeiro nucleotídeo é inserido pela enzima PRIMASE que se anela ao DNA simples fita e
coloca uma molécula de primer de RNA (sequencia iniciadora) que irá servir de sinalizador para
que a DNA polimerase possa começar seu trabalho e sintetizar uma nova a fita.
b) Após a síntese pela DNA polimerase, ocorre substituição do primer de RNA (sinalizador) por
nucleotídeos de DNA. Essa substituição é feita pela enzima DNA polimerase 1.
c) DNA polimerase somente consegue adicionar o nucleotídeo na extremidade OH, logo ela
trabalha SEMPRE no sentido 3->5
3) . Na outra fita ocorre a síntese através de fragmentos de okazaki, que são fragmentos de DNA através de
primers, só que no sentido inverso. No final, todos esses fragmentos irão formar uma fita continua. A ligação
entre os fragmentos é feita pela enzima ligase.
4) Início da replicação
a) A replicação sempre começar por regiões chamadas de ‘origem da replicação’ – são múltiplas
em cromossomos eucarióticos

Existem vários pontos de origem de replicação em um cromossomo


Direção: 5’  3’
A replicação é semi-conservativa (a nova molécula de DNA sempre terá uma fita da molécula mãe e uma fita
complementar nova)
É semi-descontinua  Em uma fita ocorre replicação continua no sentido 5-3; Na outra são necessários fragmentos
de okazaki;

A DNA polimerase é sempre dimérica


 Nos telômeros, final do cromossomo, ocorrem buracos (espaços) na fita de DNA, pois não tem espaço físico
para se ligar. A enzima telomerase (possui atividade de transcriptase reversa), feita de RNA preenche esse
espaço e a partir dela sintetiza nucleotídeos de DNA que aumentam a fita antiga em algumas unidades de
repetição, assim é possível a inserção dos fragmentos de otazaki, logo não acontece a perda de
comprimento do DNA.
 As células embrionárias expressam muita telomerase que irá manter o tamanho dos cromossomos. Com o
envelhecimento a expressão de telomerase é diminuída, logo ocorre perda do tamanho do cromossomo
(deleção de genes), quando essa perda começar a deletar regiões importantes do gene a célula começara a
sofrer distúrbios.
- Exemplo ovelha dolly, os telomeros da ovelha já eram mais curtos, velhos, logo ela teve doenças
incondizentes com a sua idade

Expressão Gênica

Dogma central da biologia molecular


DNA -> auto replicação  DNA molde de RNA  RNA molde para produção de proteínas.

Fatores de transcrição: sequência regulatória ou região promotora / partes codificantes e não codificantes (exons e
introns) / RNA vai ser copiado a partir do exon  nucleotídeo +1.

A sequência regulatória são sequencias de DNA que são reconhecidas por enzima/fatores de transcrição (proteínas
auxiliares) que irão ativar a RNA polimerase, nessa parte os nucleotídeos são numerados em -1,-2,-3 (estão antes das
regiões codificantes que tem início no nucleotídeo +1) ....
Débora Dettmer – ATM19
9
Medicina PUCRS

Transcrição:
 Fatores de transcrição: proteínas auxiliares que reconhecem regiões promotoras dos genes;
 RNA polimerase: enzima que realiza a síntese do RNA

 O sentido de crescimento do RNA mensageiro é 5 3;


 O RNA que está sendo sintetizado, por um momento fica anelado ao DNA, após ocorre a separação;
 RNA tem dois grupamentos de OH, esses grupamentos são extremamente instáveis, logo a molécula pode
ser desnaturada mais facilmente. O DNA tem um OH, isso conferiu estabilidade a sua molécula;

 Célula usa a fita complementar para fazer a transcrição do gene.

- TAATTAT – tata box  uma das regiões promotoras, está relacionado com a posição -28; são sequencias
que serão reconhecidas para efetuar a transcrição.
- Se ocorrer mutações nas sequências promotoras, isso pode silenciar aquele gene, logo ele não poderá ser
expresso. Se for um gene importante, a célula sofrerá prejuízos.
- Até onde vai a transcrição não se sabe... Não se conhece ainda uma estrutura fixa para indicar o termino.

Processamento do DNA
Débora Dettmer – ATM19
10
Medicina PUCRS

 Íntrons serão removidos.


 ATG metionina serão os primeiros a ser traduzidos; o que vem antes não será traduzido, são regiões que são
transcritas mas não são traduzidas.
 Região UTR é a última para tradução, o que vem depois é transcrito mas não traduzido

Processamento do RNA
 Adição do CAP o Nucleotídeo modificado que bloqueia a ação das nucleases. Adicionado na porção 5. É uma
molécula sinalizadora.
 Inserção da cauda poliA
o Na extremidade 3, ocorre a síntese de cauda poli A, 200 adeninas que servem para proteger a
ação de nucleases.
 Remoção dos introns
o Encadeamento (splicing), retirada dos introns e união dos exons.
Débora Dettmer – ATM19
11
Medicina PUCRS

MUTAÇÕES

Mutação germinativa X somática


Germinativa: ocorre nas células germinativas  pode ser passada para as futuras gerações
Somáticas: ocorrem nas células do organismo  podem ser passadas para as células filhas delas
Mutações gênicas x cromossômicas
Gênicas: alterações a sequência do DNA
Cromossômicas: em nº ou estrutura do cromossomo
Gênicas: troca de nucleotídeos (SNP), indel
SNP: troca de um único nucleotídeo
Idel: inserção ou deleção

Efeitos das mutações gênicas (aqui estou tratando de ÉXONS)


 Mutação silenciosa
Códon novo codifica o mesmo aa  mutação/diversidade gênica não é expressada fenotipicamente

DNA é degenerado = há mais de um códon para o mesmo aa

 Mutação de sentido trocado


Troca o aa e ai o códon codificado muda
Obs.: “sentido” não está significando “direção”

anemia falciforme é um
exemplo de mutação de sentido trocado
Débora Dettmer – ATM19
12
Medicina PUCRS

 Mutação sem sentido:


Quando é gerado um códon de parada da tradução prematuro
Proteína truncada  ela fica mais curta  nela as chaperonas (proteínas de dobramento) não fazem
o dobramento e ainda sinalizam que a proteína deve ser degrada
UAG  códon de parda

 Mudança da fase de leitura:


Adição ou deleção de nucleotídeos
Gerada por Indels
Adiciona-se ou se tira um códon e ai toda a fase de leitura é alterada
Casada por inserções ou deleções
Pode criar um códon de parada prematuro ou modificar o códon de parada que era normal

Existem, também, mutações em regiões não codificantes


 Região promotora
Região que permite que o RNAm seja codificado
O que vem antes da região codificante do RNAm
Tem sequências específicas que são reconhecidas por proteínas que permitem que o RNApolimerase
faça a transcrição
TATAbox: +/- 25% de nucleotídeos antes do RNAm
 Sítios de splicing
Remoções de íntrons do DNAm  ocorre sempre e em todos os genes humanos
Transcrição  splicing (adição do CAP  adição da cauda poliA  splicing – remoção do introns) 
tradução  proteína
Splicing ocorre no núcleo antes do RNA ir para o citoplasma
 Outras causas: transposons, expansão de repetições de nucleotídeos

Mutação espontânea
 Aumenta o número de repetições em um e diminui no outro
Débora Dettmer – ATM19
13
Medicina PUCRS

Metilações  inativa

Mutações espontâneas: modificações tautoméricas

Mutação induzida
 Luz UV, radiação ionizante, agentes químicos (provocando alterações químicas nas bases nitrogenadas,
análogos de base, ligação de grupamentos químicos, intercalantes de dupla-fita)
 Luz UV produz dímeros de timina  duas timinas da mesma fita pareiam entre só  DNApolimerase não
consegue ler aquilo  ou ele para de ler, ou ele apenas pula aquela sequência

 Aflotoxina: prodito de um fungo que cresce no amendoim


Intercala-se na dupla-hélice e pode gerar tumores
Débora Dettmer – ATM19
14
Medicina PUCRS

Três tipos de reparo que podem ocorrer na célula

Isso ocorre antes de termiar a fase G2 e começar a mitose/meiose (no final da G2, antes da mitose/meiose)
Entre essas duas fases há uma parada para correção de erros  se o mecanismo de reparo não é capaz de corrigir
isso, a célula é induzida a apoptose

TÉCNICAS MOLECULARES

 Extração de DNA: passos principais


1) Lise da membrana
2) Degradação de proteínas
3) Purificação do DNA
 Durante esses 3 passos o RNA se degrada, ele é muito sensível
 Podemos usar saliva, mas o ideal é a extração de sangue  sangue é misturado com um tampão e depois é
centrifugado
 Álcool faz o DNA se agrupar e expulsa as moléculas do meio  com isso conseguimos pescar o DNA

 PCR – Reação de Polimerização em Cadeia


 A usamos para direcionar para onde queremos
 Amplificação in vitro de um fragmento de DNA (sua sequência, ou parte dela, deve ser conhecida)
 Amplificação seletiva: como se fosse uma replicação, faço diversas cópias
 Para isso utilizamos uma enzima polimerase isolada da bactéria Thermus aquaticus, a Taq polimerase
 Primers: um marca o início, outro marca o fim da sequência
- Oligonucleotídeos indicadores  DNA simples fita
 Taq polimerase: enzima polimerase que é capaz de suportar altas temperaturas
Débora Dettmer – ATM19
15
Medicina PUCRS

 PCR
 Para fazer essa reação in vitro iremos precisar de:
DNA molde
Enzima Taq polimerase
Tampão de reação
Nucleotídeos livres (dNTP = dATP, dCTP, dGTP e dTTP)
Cloreto de magnésio (cofator da enzima)
Primers específicos para a região a ser amplificada
Água estéril
Equipamento termociclador
 Enzima Taq polierase faz a síntese do DNA
 Equipamento: termociclador
 DNA polimerase pega os nucleotídeos livres e estende a fita  desnaturação a 94ºC

 A amplificação se dá de forma exponencial

 Resolução microscópica não é suficiente para eu conseguir ver os resultados


Débora Dettmer – ATM19
16
Medicina PUCRS

 Eletroforese em Gel
 É uma técnica baseada na separação de partículas em um determinado gel (matriz) de acordo com sua
massa e carga
 Pode ser utilizada para separação de diversas moléculas orgânicas, como lipoproteínas, proteínas, RNA e
DNA
 O PCR é a técnica APENAS de amplificação
- Pré-técnica para detectar mutações (ex: SNPs)
- Presença/ausência do DNA ou do genoma de um vírus (insere-se primers específicos para o genoma
daquele organismo, se houver amplificação no tubinho é porque aquela pessoa tinha o organismo presente)
- Deleções e inserções  mutações do tipo INDEL
 O princípio da eletroforese para separação de DNA baseia-se:
- na carga do DNA (ele vai do polo - para o polo +)
- No tamanho da molécula
 Brometo de etídeo  corante de DNA - molécula que se intercala na duplahélice e, quando ligada ao DNA e
exposta a luz UV, fluoresce na cor alaranjada.

 Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição – RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)


 PCR-RFLP: digestão (clivagem) enzimática de um fragmento de PCR
 Enzimas de restrição são enzimas que reconhecem sequências específicas no DNA e o clivam

 Detecções de mutações por enzimas de restrição


 EcoRI: G/AATTC
 Método de terminação de cadeia – SANGER
 S – sequencing  metade de terminação de cadeia
 É um tipo de PCR
 dd: DNA didisoxi  sem OH  toda vez que esse nucleotídeo for inserido ele termina a cadeia

Você também pode gostar