Fotocolorimetria

Uso da luz para a descoberta da

concentração de uma determinada
substância em uma mostra.

Frederico Lemos

29/04/2018
Roses are red, violets are blue.

Por que ?
 Luz Branca
Lu
z nca
Br
Bra
an z
ca Lu

A rosa reflete a Cor Vermelha

E as outras cores ???

A cor que vemos.

https://www.filipeflop.com/blog/sensor-de-cor-tcs3200-rgb-arduino/
Soma e subtração de cores
 A soma de Cores - RGB.

Cores (Oposto do verde)

Complementares
Red

Green Blue

(Oposto do vermelho)
(Oposto do azul)

R G B – Cores aditivas primárias

Todo artista sabe que se ele misturar tinta vermelha verde e azul
o resultado não será o branco mas uma tonalidade de marrom-
escuro. Misturar pigmentos de tinta é completamente diferente de
misturar luzes.
Atravessando meios transparentes
coloridos: cores absorvidas.

el ho
verm
fl ete o Composição
Re
de verde com azul

R
G
B
Ciano ???

Qual a proporção das cores que serão absorvidas ???

O Prisma – gerando cores.

As ondas de diferentes frequências tomam diversos ângulos na refração o

que faz surgir várias cores. Dentro do vidro as velocidades são diferentes.
Grade de difração
Gerando cores com filtros.

Transmissão seletiva: Os filtros de cores !!!

 Lei de Beer-Lambert-Brouguer
Brouguer em 1729: Quando um feixe de luz
monocromático atravessa um meio transparente
homogêneo, cada camada desse meio, absorve igual
quantidade de energia luminosa...

Lambert em 1760: ...independente da intensidade da

luz incidente.

Beer em 1852: ...A intensidade decresce

exponencialmente a medida que a concentração da
substância absorvente aumenta aritmeticamente.
 Transmitância

Transmitância T = (P / P0)
Transmitância (%) T = 100 (P / P0)
Onde P é a intensidade luminosa que chega.
 Absorbância

Absorbância: A = log (1/T) “T” Não em percentuais

ou
A = - log (P0/ P)
 Simulando a lei de Brouguer
Emissão de Luz com cada camada absorvendo 50 %

1 cm

100% 3,125%

P0
P

0,2 cm

Comprimento ótico (b) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Transmitância T = 100.(P/P0) 100% 50% 25% 12,5% 6,25% 3,125%

Absorbância A= - log (P0/P) 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5

Gráfico da Transmitância
1 cm

0,2 cm

P=P0 * 10-ab onde “a” é uma constante

Linearizando o Gráfico T → A

Absorbância: A = - log (1/T)

 Lei de Beer –> linear
“...A intensidade decresce exponencialmente a medida que a
concentração da substância absorvente aumenta
aritmeticamente.” P=P0 * 10-a.b.c para um comprimento “b” fixo.

P/P0= 10-a.b.c → log(P/P0) = log10-a.b.c

log(P/P0) = - a.b.c → - log(P/P0) = a.b.c

A = a.b.c

Concentração diretamente
proporcional absorbância.
Até um certo valor !!!
A = a.b.c onde:

a = absorvidade molar (L / mol . cm)

b = comprimento do caminho da amostra (cm)
c = concentração da amostra (mol / L )
 Resumo da ópera
→ Existe uma relação exponencial entre a intensidade da luz que
atravessa uma substância e sua concentração. (Lei de Beer).

→ Se conhecermos a absorvidade molar de uma substância dada

por “a” e o tamanho do percurso que a luz irá atravessar dado por
“b”, a absorbância “A” se torna uma função da concentração “c”
dessa substância.

Assim, a lei de Beer-Lambert (corrigindo Lambert-Beer) fica:

A = a.b.c Onde: A = absorbância

a = absorvidade molar (L / mol . cm)
b = comprimento do caminho da amostra (cm)
c = concentração da amostra (mol / L )

Se b e a forem conhecidos, então c ~ A

Condições físico-químicas para o uso
da lei de Beer
- As partículas (átomos, moléculas ou íons) da solução devem
absorver a luz de forma independente entre si;

- O meio absorvente deve ser homogêneo e não dissipar a

radiação;

- A radiação incidente deve estar colimada (raios paralelos

entre si) para atravessar a mesma distância enquanto
interagem com as partículas da solução;

- A radiação deve ser monocromática e no comprimento de

onda para o qual a absorção da amostra é máxima;

- A radiação incidente não pode desestabilizar os átomos,

moléculas ou íons da solução. Ex: Não poderá provocar
fluorescência ou fosforescência.
Como implementar fisicamente
a lei de Beer-Lambert ?

1) Luz monocromática;

2) Percurso luminoso transparente e de

tamanho fixo;

3) Medir a quantidade de luz absorvida.

 O Monocromador

Fotocolorímetros

Prismas e grades de difração

Fotocolorímetro ~ espectrofotômetros
Comprimentos de onda das cores
Cor Comprimento de onda (nm) Frequência (THz)

Vermelho 625 a 740 480 a 405

Laranja 590 a 625 510 a 480

Amarelo 565 a 590 530 a 510

Verde 500 a 565 600 a 530

Ciano 485 a 500 620 a 600

Azul 440 a 485 680 a 620

Violeta 380 a 440 790 a 680

Exemplo: Usa-se uma cubeta de tamanho “b” fixo.
b

Qual a cor que essa amostra não vai absorver ?

 Medir a quantidade de luz absorvida.

Procura-se a fotocélula !!!

Photoeletric-cell

? Sensor luminoso de resposta linear, sem histerese, sensível as variações de

intensidade luminosa. Qual o componente eletrônico que atende essas necessidades
nos dias de hoje ? Resposta em corrente.
 I1
I1

F1
50
60
70 0
80 + -
90
100
I1 I2 I2

R2 F2
I1t
I2t
Esquema do Klett-Summerson
Espectrofotômetro
Espectrofotômetro
 Prática de
fotocolorimetria
Esperando o sangue coagular
Separado o soro do sangue
pela centrifuga
Retirado o soro do sangue para
o tubo teste.
Retirado o sangue para o tubo
teste.
Aspecto do soro sanguíneo
Marcando os tubos
Os três tubos: Branco,
Teste e Padrão.
Adicionando 20uL de reagente
de cor aos 2mL de sangue:
Tubo teste.
 20uL de água destilada para
com os 2mL de reagente de cor,
formar o “Branco” .
Homogeneizando e levando ao
banho maria.
Espera de dez minutos para que
a reação ocorra.
Tudo Pronto !!!
Branco Teste
Água destilada + Sangue +
reagente de cor reagente de cor
Depois de descobrir o
comprimento de onda mais
sensível...

Zera-se o equipamento com o

Branco.
Leitura para o Padrão

O Padrão apresentou uma leitura em

transmitância de T = 55%

A = log (1 / T)

A = log (1 / 0,55)

A = 0,25

Lembre-se que em 0,25 temos

100mg / dL

0,25 ------> 100mg / dL

Teste -------> x mg / dL
Leitura para o Teste

O Teste apresentou uma leitura

em transmitância de T = 40%

A = log (1 / T)

A = log (1 / 0,40)

A = 0,39

0,25 ------> 100mg / dL

0,39 -------> x mg / dL
 Conclusão

Conc = (ABS do Teste / ABS de Padrão) x Conc do Padrão

Conc = ( 0,39 / 0,25 ) x 100 mg / dL

Conc = 156 mg / dL

éti c a
Diab
A lógica da regra de três..

0,25 ------→ 100 mg / dL

0,39 ------→ x

X = [0,39 (T) x 100 mg / dL ] / 0,25

X = 156 mg / dL