“Año del Buen Servicio al Ciudadano”

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS

CURSO: Fisiología General (viernes 2- 4pm)

PRÁCTICA N°1: Tolerancia osmótica y cambio de forma
celular.
PROFESOR: Martha Valdivia Cuya
INTEGRANTES: Aguirre Huacaychuco, Fernando
Ataucusi Vargas, Nieves
Diaz Peña, Silvia Ruby
Mondragon Kemper, Angel
Sanchez Lozano, Christian

2017
 Introducción
En esta práctica realizaran diferentes estudios en los espermatozoides de cuy, como la
tolerancia osmótica y cambio de forma celular en situaciones de estrés; en este primer
estudio de la tolerancia osmótica nos indicara como una célula especializada haploide
(espermatozoide de cuy) influirá en su capacidad de interactuar con el entorno ante una
solución distinta a su punto isosmótico lo cual le conferirá la capacidad de sobrevivir
experimentando cambios en su volumen celular. Y en el segundo estudio de los cambios
de forma del espermatozoide serán evaluados con el Test Hipostático (HOST), que
evalúa la vitalidad del espermatozoide en una solución hiposmótica.
 Procedimiento
1. Se realiza la disección de los testículos de cuy y se hizo la extracción del
epidídimo (el que se visualizaba más grande).
2. En una placa Petri se colocó el epidídimo y se empezó a triturar con ayuda de
una tijera de punta fina.
3. De empezó aislar el líquido seminal de cualquier resto de carne o sólido, para
extraer solo el líquido y homogeneizarlo con medio de HAM F10.
4. Separaremos una gota del homogeneizado en una lámina para observar la
movilidad de espermatozoides. Cubrir con una cubreobjeto la muestra,
colocando pequeñas bolitas de pastilina en las esquinas del cubreobjeto que
servirá para no dañar la muestra y los espermatozoides puedan moverse.
5. Lo que quedó de muestra se tomó como stock y se puso a incubar para evitar
que se mueran los espermatozoides.
6. Se tomó una alícuota del stock con ayuda de una micropipeta y se colocó en
una lámina. Se colocó eosina Y (reactivo-colorante) para observar la vitalidad
espermática.
7. Se extrajo otra alícuota para el Test Hiposmótico (HOST) para evaluar el
hinchamiento producido ante la solución hiposmótico y la utilizamos como
prueba alternativa para determinar la vitalidad del espermatozoide. Se
visualizará de 30-45 minutos después de su preparación.
8. Finalmente, se determinó la tolerancia osmótica de los espermatozoides a
diferentes concentraciones de solución salina: 150, 300 y 600 mOsm/L. Se llevó
a visualizar al microscopio para analizar la movilidad, el cambio de forma, la
reacción del acrosoma y se contrastarán los resultados con las diferentes
soluciones de NaCl.
9. Con el análisis, se determinará la concentración de cloruro sódico en la cual
espermatozoides presentan las mejores características fisiológicas, semejante
al control y se entregará la solución próxima a la del medio HAM F10
 Resultados
1. Movilidad espermática

Movilidad Espermática Número aproximado por campo %

1 2 3
Movilidad Progresiva (PR) 200 200 200 90.09
Movilidad No Progresiva (NP) 8 10 4 7.21%
Inmóviles (IM) 5 4 3 2.70

2. Vitalidad espermática

Vitalidad espermática Número aproximado por campo %

1 2 3
Los espermatozoides vivos 200 200 200 91.53
Los espermatozoides muertos 15 10 12 8.47

3. HOST (Vitalidad)

HOST %

Cambio de A 6%
forma B 80%
C 6%
D 2%
E 2%
F 1%
G 3%

4. Tolerancia osmótica a 150 mOsm/L de NaCl

5. Tolerancia osmótica a 300 mOsm/L de NaCl
6. Tolerancia osmótica a 600 mOsm/L de NaCl

Porcentaje mOsm/L 150 300 600

Movilidad PR 5% 82% 1%
NP 4% 5% 4%
IM 91% 13% 95%
Vitalidad Vivas 9% 82% 5%
Muertas 91% 18% 95%
Cambio de forma 15% 3% 20%
Reacción acrosomal Intacto 90% 96% 25%
Reaccionado 10% 4% 75%
 Análisis de resultados
Movilidad espermática:
Para el análisis de movimiento se observó parte de la muestra stock (medio: HAM F10) al
microscopio y contabilizo teniendo en cuenta las siguientes categorías:

*Motilidad progresiva (PR): espermatozoides moviéndose activamente, ya sea de forma lineal

o círculo grande, independientemente de la velocidad.

*Motilidad no progresiva (NP): todos los otros patrones de motilidad con ausencia de
progresión. Nadando en pequeños círculos, la fuerza flagelar apenas desplazando la cabeza, o
cuando sólo se puede observar un latido flagelar.

*Inmovilidad (IM): sin movimiento.

Los resultados obtenidos fueron 90.09 % PR, 7.21% NP y 2.70% IM. Se consideran los valores
de Motilidad total 97.30% (PR+NP) y Motilidad progresiva 90.09% (PR) para compararlos
con los estándares establecidos por la OMS. La Motilidad total obtenida es mucho mayor al
límite establecido inferior de 40%, de igual manera, el porcentaje de Motilidad progresiva es
mayor a 32%. Esto significa que la calidad de la muestra es muy buena en cuanto a motilidad.

Vitalidad espermática:
La vitalidad de los espermatozoides utilizados en práctica se comprobó mediante 2 métodos
tinción con eosina y test hipo osmótico. Ambos métodos aplicados tienen en cuenta el estado
de la membrana plasmática. En el caso de la tinción la eosina la membrana solo es permeable
si esta está dañada. Esto significa que, las células vivas no estarán teñidas. De manera similar,
el cambio morfológico que sufren las células al se expuestas a un medio hipo osmótico,
hinchamiento y enrollamiento de la cola, demuestra que el correcto funcionamiento de la
membrana.

Los resultados obtenidos por la tinción con eosina fue 91.53% espermatozoides vivos y 8.47%
de muertos (teñidos).

Al ser el porcentaje de espermatozoides no teñidos mayor a 58%, la muestra es considerada

normal según los estándares de la OMS

Los resultados obtenidos por el test hipo osmótico fueron óptimos y similares obtenidos por la
tinción con eosina Y. Los valores fueron 94% (presentan cambios morfológicos) vivos y 6%
muertos.

Al ser el porcentaje de espermatozoides que presentaron cambios morfológicos en el flagelo

mayor a 58% (límite inferior), la muestra es considerada normal según los estándares de la
OMS
Tolerancia osmótica
Para este análisis se sometió a los espermatozoides de la solución stock a 3 diferentes
concentraciones de solución (150, 300 y 600 mOsm/L), con el objetivo de observar el
comportamiento de las células (motilidad, reacción del acrosoma) y su capacidad de soportar
el estrés osmótico.

Los resultados de motilidad en 300 mOsm/L presentan un porcentaje alto de motilidad total
(87%) siendo estos los más cercanos al porcentaje obtenido en la muestra control (97.3%). Por
otra parte en el caso de 150 y 600 mOsm/L la motilidad total fue 9% y 5%, respectivamente.

Los resultados respecto a la reacción del acrosoma a 150 mOsm/L se observó que hubo un
10% de reacción acrosomal, lo cual indica que las condiciones anisosmóticas promueven que
se manifieste esta reacción. Conforme se va aumentando las concentraciones se reduce la
reacción acrosomal porque estas se encontraran más cercano al rango de concentración
isosmótica el cual se determina con la concentración de 300 mOsm/L que solo tiene un 4% de
reacción acrosomal. Se aumenta la concentración a 600 mOsm/L y se manifestará una reacción
acrosomal del 75%, y esto se debe a que se aleja mucho del rango de las condiciones
isosmóticas dando como resultado estos datos.

Se observa que en la solución de 150 mOsm/L, la movilidad progresiva disminucion

drásticamente; mientras que en 600 mOsm/L, no existe movilidad progresiva y la
movilidad no progresiva es muy baja. Las células no soportaron la presión osmótica
producida por la solución hiposmótica(las células se hinchan) y la solución
hiperosmótica(las células se deshidratan), respectivamente.
En la solución de 300 mOsm/L, se observó un porcentaje elevado de motilidad total,
similar al de la muestra stock. Esto significa que la concentración medio extracelular
era similar a la concentración del medio intracelular (medio isotónico) y que la solución
a 300 mOsm/L es isostática para las células empleadas en la práctica.
 Cuestionario
1. ¿En qué concentración salina los espermatozoides analizados se asemejan las control?

Los espermatozoides a concentración de 300 mOsm/L son semejantes a los

espermatozoides del control porque a esa concentración los espermatozoides presentan
una mayor movilidad espermática lo que no se observó en las otras dos concentraciones.
Además, según la bibliografía señalada, las concentraciones salinas en las que pueden los
espermatozoides tener vitalidad espermática, buena tolerancia osmótica y movilidad
espermática es en el intervalo de 240 a 280 mOsm/L

(Valdebenito et al. 2009)

2. Según la OMS, cómo se evalúan los tipos de movilidad en los espermatozoides.

Si bien existen muchas técnicas modernas, como el análisis seminal asistido por
computadora (ASAC) que permiten medir objetivamente y con medios
computadorizados las características del movimiento de los espermatozoides, éstos
no están disponibles en muchos centros por ser costosos, es por eso que la OMS
recomienda un sistema simple de medir la movilidad espermática sin necesidad de
equipos complejos, como por ejemplo un espermatograma, para esto la movilidad se
divide en 4 categorías:

CATEGORIA OMS DENOMINACIÓN VELOCIDAD

Rápida Progresiva a / +++ ≥ 25µm/s
Progresiva Lenta b / ++ 5-24 µm/s
No progresiva c/+ < 5 µm/s
Inmóvil d/0 -

Para determinar la concentración y motilidad espermática se emplea la cámara

Makler (Sefi Meical Instruments, Haifa, Israel), que está compuesta de dos
piezas de cristal ópticamente planas. La parte superior, que sirve de
cubreobjetos, está subdividida en 100 microcuadrados de 0,1 x 0,1 mm de lado.
La profundidad de la cámara es de 10 micras. En primer lugar se calienta la
cámara a 37ºC para evitar el shock térmico, y a continuación se coloca una gota
de 5 a 10 µl de semen y se observa al microscopio a un aumento de 200x. De
esta manera, el número de espermatozoides contenidos en cualquier línea de 10
 microcuadrados indicará la concentración en millones/ml, ya que la cámara
permite que los espermatozoides sean distribuidos de manera uniforme.

3. ¿Qué factores influyen en el cambio de forma de los espermatozoides?

El principal factor que condiciona el cambio morfológico en los espermatozoides es la

concentración de solutos osmóticamente activos del medio en el que se encuentran. En la
práctica, se expuso a los espermatozoides a un medio hipoosmótico, por lo que, la
concentración solutos respecto al agua era mayor en el medio el medio intracelular, lo que
creo una gradiente de concentraciones. Entonces el agua paso por osmosis del medio
externo al interno, a través de la membrana semipermeable, para equilibrar el sistema.
Esto provocó que los espermatozoides con membranas intactas se hinchasen y que su
forma flagelar cambiase luego de 5 minutos de exposición al medio hipoósmotico.(1).

1. Luis Sarabia Villar. Espermiograma. Según los criterio de OMS [Internet].

Universidad de Chile; p. 37. Available from:
http://pp.centramerica.com/pp/bancofotos/230-31110.pdf
Bibliografía
World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination an processing
of human semen FIFTH EDITION. 2010
Luis Sarabia Villar. Espermiograma. Según los criterio de OMS [Internet]. Universidad de Chile;
p. 37. Available from: http://pp.centramerica.com/pp/bancofotos/230-31110.pdf