PROGRAMA DE EDUCACIÓN CONTINUA

ADN Y CROMOSOMAS
EN EL AULA DE ENSEÑANZA MEDIA

Cromosomas en animales domésticos

Rody Artigas, María Montenegro, Wanda Iriarte

Silvia Llambí

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 CULTIVOS CELULARES EN ANIMALES
DOMÉSTICOS

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA, CAPTURA Y

ANÁLISIS DE IMÁGENES

Rody Artigas, María Montenegro, Wanda Iriarte

Silvia Llambí

Área Genética
Dpto. de Genética y Mejora Animal
Instituto de Producción Animal
Facultad de Veterinaria - UdelaR

Imagen de portada: http://www.hyle-capacitacion.com

 CONTENIDO

Prólogo 7
Fundameto Teórico 9
Cromosomas 9
Cariotipo 10
Cultivo Celular 11
Prácticas de Laboratorio 13
Protocolo Procesamiento de Cultivos Linfocitarios (Macrocultivo) 13
Realización de Preparados 16
Tinción Cromosómica con Colorante Giemsa al 3 % 19
Ejercicios 21
Referencias Bibliográficas 25
 PRÓLOGO

El presente librillo es fruto del esfuerzo de un grupo de docentes del Área Genética de la
Facultad de Veterinaria, interesados en acortar las distancias entre la universidad y secundaria.
Está dirigido a profesores de biología interesados en incursionar en nuevas experiencias que
les permitan a sus estudiantes acercarse a una disciplina tan abstracta como la genética, de
manera más amigable.

En él se describen los principales procedimientos de laboratorio aplicados al diagnóstico e

investigación en citogenética animal. En el pasar de las páginas quedará clara la importancia de
esta disciplina tanto en la medicina animal como humana. Se integrará el conocimiento de las
diferentes etapas del ciclo celular con los diferentes estadíos cromosómicos, fundamentando
en gran medida cada una de las etapas del análisis citogenético.

Esperamos que el librillo les resulte de interés y sobre todo de apoyo al momento de abordar
la unidad de genética en el aula de enseñanza media.

Los autores
 FUNDAMENTO TEÓRICO

CROMOSOMAS

El núcleo celular contiene el material genético, el ADN, asociado a un gran número de

proteínas conformando la cromatina. En el período del ciclo celular en el que no hay división
(interfase), la cromatina se encuentra dispersa y despiralizada. Las fibras de cromatina se
condensan durante la mitosis y la meiosis formando los cromosomas, condensación que
permite la correcta segregación del material genético a las células hijas durante estos procesos
de división (Figura N° 1).

Figura N° 1: Estado de la cromatina en los diferentes estadios del

ciclo celular (Imagen extraída de www.ceibal.edu.uy).

Los cromosomas tienen un tamaño y una forma característica. Poseen una constricción
llamada centrómero, el cual puede localizarse en diferentes posiciones originando distintas
morfologías. Dicha constricción genera dos brazos cromosómicos denominados p (corto) y q
(largo). Cuando el centrómero se sitúa en el centro del cromosoma, la morfología es
metacéntrica, siendo los dos brazos del mismo tamaño. Cuando el centroméro se localiza
entre el centro y uno de los extremos del cromosoma, la morfología se denomina
submetacéntrica. La morfología es acrocéntrica cuando el centrómero está próximo al extremo

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(brazo p muy pequeño, no visible al microscopio óptico), mientras que cuando el centrómero
está en el extremo el cromosoma es telocéntrico (Figura Nº 2).

Figura Nº 2: Morfología cromosómica. a. cromosoma

metacéntrico; b. cromosoma submetacéntrico; c. cromosoma
acrocéntrico; d. cromosoma telocéntrico.

Todas las células somáticas de los individuos eucariotas de una misma especie tienen el mismo
número de cromosomas (Tabla N° 1). Los cromosomas se encuentran de a pares formando
pares de cromosomas homólogos, siendo una excepción los cromosoms sexuales de machos
en mamíferos (XY) y de hembras en aves (ZW).

Tabla N° 1: Número cromosómico en animales domésticos (2n)

Bovinos (Bos taurus, Bos indicus) 60 Pavo (Meleagris gallipavo) 82

Cerdo (Sus scrofa) 38 Paloma (Columba livia) 80

Oveja (Ovis aries) 54 Pato (Anas platyrhyncha) 80

Caballo (Equus caballus) 64 Conejo (Oryctolagus cuniculus) 44

Burro (Equus asinus) 62 Perro (Canis familiaris) 78

Cabra (Capra hircus) 60 Gato (Felis catus) 38

Gallina (Gallus domesticus) 78 Humano (Homo sapiens) 46

La citogenética es una rama de la genética que estudia la estructura y función de los

cromosomas. Las técnicas y análisis citogenéticos, permiten entre otras cosas, detectar
alteraciones cromosómicas númericas y estructurales, constituyendo una importante
herramienta en investigación y diagnóstico en Medicina. Una de estas herramientas es la
confección de cariotipos, que implica la cuantificación y observación cromosómica.

CARIOTIPO

El cariotipo es la representación gráfica de los cromosomas de una especie, ordenados por

tamaño, de mayor a menor, y por su morfología (Foto N° 1). Para confeccionar el cariotipo de
un individuo, es necesario realizar un cultivo linfocitario a partir de sangre entera periférica.

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 Foto N° 1: Cariotipo de un equino hembra, 2n = 64, XX (Imagen
cortesía de Rody Artigas).

CULTIVO CELULAR

El cultivo celular es el proceso mediante el cual pueden cultivarse células en condiciones

controladas. Dichas células pueden ser aisladas de los tejidos para cultivo in vitro de muchas
maneras, siendo las sanguíneas las que pueden ser cultivadas con mayor facilidad. Sin
embargo, sólo los leucocitos son capaces de crecer en cultivo.

Los pasos a seguir para la realización de un cultivo celular son los siguientes:

1) Extracción de sangre del individuo: la toma de la muestra se realiza con jeringa con
anticoagulante (heparina), en condiciones de asepsia. La muestra debe conservarse
refrigerada hasta el momento de la realización del cultivo (no dejar pasar más de 2 o 3
días).

2) Cultivo en medio completo: El medio completo contiene RPMI-1640, suero fetal bovino,
glutamina, penicilinia/estreptomicina y fitohemaglutinina.

RPMI-1640: El medio Roswell Park Memorial

Institute (RPMI), es uno de los medios más
difundidos para el cultivo de células y tejidos;
siendo el RPMI-1640 el más usado en la
actualidad, debido a que ha demostrado una
amplia aplicabilidad para el crecimiento in
vitro de muchos tipos de células, incluyendo
linfocitos humanos.

Este medio contiene una gran cantidad de Foto Nº 2: Componentes del medio de
fosfato, así como también distintos cultivo completo.
11
aminoácidos y vitaminas, y está formulado para ser usado en una atmósfera con 5% de dióxido
de carbono. Dicha formulación se basa en el medio RPMI-1630, que utiliza al bicarbonato
como sistema amortiguador.

Suero fetal bovino: El suero fetal bovino (SFB) es el suero más usado como suplemento para el
medio basal de crecimiento, ya que provee de una amplia variedad de proteínas
macromoleculares, nutrientes de bajo peso molecular, proteínas transportadoras, hormonas y
factores de anclaje, que le otorgan capacidad buffer al medio y neutralizan componentes
tóxicos.

Glutamina: La glutamina es uno de los aminoácidos más comunes, empleado en la codificación

del código genético. Su función es sintetizar proteínas, aumentar el nitrógeno de la sangre,
aumentar el adenosín trifosfato (ATP) y mejorar el sistema inmune. También es necesario
suplementar el medio basal con otros aminoácidos, debido a que los requerimientos pueden
variar de una célula a otra.

Penicilina/Estreptomicina: Los antibióticos y los antifúngicos son inhibidores del crecimiento

de contaminantes, por lo que es necesario suplementar el cultivo con sustancias antibióticas
de diferente espectro de acción, siendo estrictamente controladas, para evitar efectos nocivos
sobre el cultivo.

Fitohemaglutinina: La fitohemaglutinina (PHA) es una lectina correspondiente al grupo de

proteínas que reconocen carbohidratos, que se caracteriza por su habilidad para combinarse
con receptores de membrana de carbohidratos. Es reconocida por su capacidad de aglutinar
eritrocitos y leucocitos, así como también, por estimular inespecíficamente la proliferación de
élulas T; es por dicho poder mitogénico que se emplea como factor de crecimiento en los
medios de cultivo.

3) Incubación en estufa de cultivo (o baño Memmert), durante 72 horas (a la temperatura

corporal del individuo).

4) Sacrificio del cultivo: Este paso consiste en el agregado de colchicina, hipotonía, fijacion y
lavado.

Agregado de colchicina: La colchicina es una sustancia antimitótica que evita la formación de

los microtúbulos del huso mitótico (por la inhibición de tubulina), deteniéndo a la célula en el
estadio de metafase.

Choque hipotónico: Durante este paso se agrega una solución hipotónica de cloruro de potasio
(KCl), produciéndose la entrada de agua a la célula, la misma se expande y permite una mejor
visualización de los cromosomas. El objetivo de este paso también es producir hemólisis
(ruptura de eritrocitos), para eliminar aquellas células que no contienen material genético. La
precisión en la preparación y el tiempo de tratamiento hipotónico es fundamental para la
obtención de metafases óptimas para su estudio.

Fijación: El proceso de fijación, llevado a cabo con fijador Carnoy, también es crítico en la
cosecha, ya que en el pellet celular acumulado después de aplicada la solución hipotónica, se
encuentran restos de la hemólisis de los eritrocitos. La fijación evita la formación de grumos de

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hemoglobina que son difíciles de disolver produciendo extendidos sucios (con restos
citoplasmáticos y cromosomas poco definidos) y con bajo índice mitótico.

Lavado: Durante esta etapa se agrega fijador Carnoy con el objetivo de eliminar residuos
citoplasmáticos y producir preparados más limpios.

Para la visualización de los cromosomas metafásicos se realizan extensiones celulares. Las

preparaciones se realizan mediante la técnica de goteo a la llama sobre portaobjetos
previamente sumergidos en metanol 70% y se colorean con Giemsa al 3% en buffer fosfato
Sorensen (pH 6.8).

5) Observación de las preparaciones (búsqueda y captura

fotográfica de metafases): Se realizará mediante microscopio
óptico, para la posterior confección del cariotipo.

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 PRÁCTICAS DE LABORATORIO

PROTOCOLO PROCESAMIENTO DE CULTIVOS LINFOCITARIOS (MACROCULTIVO)

Materiales:

Balanza

Baño María (Memmert)

Centrífuga

Estufa

Agitador

Termómetro

Timer

Tubos de cultivo esterilizados

Tubos cónicos de centrifuga

Gradillas

Micropipetas

Tips

Pipetas graduadas

Pipeteador

Pipetas Pasteur

Peritas de goma

Espátulas

Matraz

Probetas

RPMI-1640

Suero fetal bovino (SFB)

Fitohemaglutinina (PHA)

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Antibióticos (penicilina/estreptomicina)

Colchicina

Agua destilada

Cloruro de potasio (KCl)

Metanol

Ácido acético

Recipientes de descarte

Procedimiento:

1. Para comenzar el procesamiento de las muestras, se deben agregar los siguientes

componentes (a fin de preparar el medio de cultivo completo) en tubos de cultivo
estériles, correctamente identificados:

• 5 mL de RPMI-1640

• 0,25 mL de fitohemaglutinina (PHA)

• 1,5 mL de suero fetal bovino (SFB)

• 0,15 mL de antibióticos (penicilina/estreptomicina)

2. Tomar una alícuota de sangre con pipeta Pasteur y agregar de 10 a 15 gotas.

3. Colocar las muestras a baño María (Memmert) o estufa de

cultivo, a la temperatura propia de la especia que se está
analizando, durante 72 horas.

4. Pasadas las 72 horas, se procede al sacrificio del cultivo.

Entre 15 y 30 minutos antes de detener la incubación,
adicionar 0,05 mL de colchicina o colcemid 100 mg/mL (50
µL/5mL) en cada tubo.

5. Pasar el material biológico del tubo de cultivo a tubos cónicos de centrifuga (previa
resuspensión).

15
6. Centrifugar a 800 rpm durante 10 minutos.

7. Eliminar el sobrenadante, de manera de dejar una capa sobre el pellet celular.

8. Agregar entre 5 y 6 cm. de solución hipotónica de KClA (conservarla a

la temperatura del cultivo), resuspendiendo lentamente con pipeta
Pasteur de punta fina. Se deja actuar durante 20 o 25 minutos.
Utilizar una pipeta por cada tubo, y descartarla en recipiente con
agua corriente e hipoclorito.

9. Cortar la hipotonía con 6 gotas de fijador CarnoyB (conservado en

freezer).

10. Centrifugar a 800 rpm, durante 10 minutos.

11. Lavado: Descartar el sobrenadante, adicionar fijador y resuspender.

Dejar actuar durante 15 minutos. Repetir este paso dos veces (hasta
que se obtenga una suspensión traslúcida).

12. Fijación: Descartar el sobrenadante traslúcido, agregar fijador y resuspender. Dejar actuar
durante 30 minutos (en caso de elaborar preparaciones, realizar el paso 6).

13. Conservar los tubos en la heladera, adecuadamente cerrados.

SOLUCIONES NECESARIAS PARA LA TÉCNICA DE CULTIVO CELULAR

A. Preparación de solución hipotónica de cloruro de potasio (KCl) - 0,075 M:
 Pesar 2,79 g de KCl.
 Agregar H2O destilada, hasta llegar a un volumen de 500 mL.
 Agitar hasta disolución total de la sal.

B. Preparación de fijador Carnoy:

 Mezclar 3 partes de metanol con 1 parte de ácido acético.

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REALIZACIÓN DE PREPARADOS:

Materiales:

Mechero Bunsen

Coplin

Láminas portaobjetos

Pinza

Pipetas Pasteur

Peritas de goma

Ácido acético

Metanol

Agua destilada

Probeta

Procedimiento:

Previo al comienzo, introducir portaobjetos en un coplin con metanol al 70 % y colocar el

mismo en freezer para evitar la evaporación de dicho alcohol.

1. Centrifugar la muestra a 800 rpm durante 10 min.

2. Descartar el sobrenadante con pipeta Pasteur y agregar fijador (cantidad de acuerdo al

pellet celular).

3. Resuspender el pellet celular.

4. Tomar una pequeña alícuota con pipeta

Pasteur y dejar caer de 2 a 3 gotas sobre un
portaobjeto desde una distancia de 30 a 50
cm. El portaobjeto se toma del coplin con
metanol 70 %.

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5. Tomar el portaobjetos con una pinza desde el extremo de la
etiqueta. Acercar el extremo opuesto a la llama del mechero
Bunsen y retirar. Dejar secar a temperatura ambiente. Recuerde
rotular cada portaobjetos correlativo a la muestra.

6. Antes de la tinción es conveniente comprobar la calidad del preparado al microscopio

mediante contraste de fases.

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TINCIÓN CROMOSÓMICA CON COLORANTE GIEMSA AL 3 %

Materiales:

Pinzas

Pipetas Pasteur

Peritas de goma

Coplin

Vaso de bohemia

Probeta

Pipetas graduadas

Pipeteador

Agua destilada

Glicerol

Metanol

Giemsa en polvo

Fosfato disódico (Na2HPO4)

Procedimiento:

1. Para elaborar el colorante se deben incorporar en un coplin de 50 mL:

• 46.5 mL de agua destilada

• 3 mL de buffer fosfato SorensenC (pH 6.8)

• 1.5 mL de solución Giemsa madreD

2. Introducir las preparaciones, las que deben estar secas, en el coplin con el colorante y
dejar durante 10 minutos.

19
3. Transcurrido este tiempo retirar y lavar con agua corriente. Dejar secar a temperatura
ambiente o en estufa, el tiempo necesario.

En el caso de que se quieran desteñir, se deben sumergir las preparaciones en un coplin con
fijador Carnoy hasta que se haya eliminado todo el colorante. Si a las preparaciones se les
había adicionado aceite de inmersión durante su observación, es necesario un tratamiento con
Xilol durante 24 horas a temperatura ambiente.

SOLUCIONES NECESARIAS PARA LA TINCIÓN DE PREPARADOS

C. Preparación de buffer Sorensen (pH 6.8):
 Pesar 5.02 g de Na2HPO4 y 4.98 g de KH2PO4
 Agregar H2O destilada hasta llegar a un volumen de 1000 mL

D. Preparación de Giemsa madre:

 Medir 66 mL de glicerol y 66 mL de metanol
 Pesar 1 g de Giemsa en polvo
 Mezclar

Una vez terminados los preparados, se procede a la observación de las placas metafásicas, en
microscopio óptico Olympus (BX60), a un aumento de 100X con aceite de inmersión. Este
equipo cuenta con una cámara de fotos digital conectada a una computadora con software de
digitalización de imágenes Image Pro Express 6.0 (Foto N° 3).

Foto N° 3: Equipo para observación de preparados

y captura de imágenes. Microscopio óptico con
cámara digital incorporada, conectada
computadora con software de digitalización de
imágenes.

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 EJERCICIOS

1) CONCEPTOS GENERALES: Múltiple Opción / Verdadero o Falso

1.1) Durante la etapa de choque hipotónico de un cultivo celular, ¿qué ocurre?

a) Entrada de agua en la célula.

b) Entrada de iones en la célula.

c) Ruptura de la membrana nuclear.

1.2) La interfase es aquel período del ciclo celular en el cual no hay división.

a) Verdadero.

b) Falso.

1.3) En los cromosomas telocéntricos, el centrómero se ubica en el centro del mismo.

a) Verdadero.

b) Falso.

1.4) Con respecto al cariotipo:

a) Los cromosomas se ordenan de acuerdo a su tamaño (de menor a mayor)

b) Se puede utilizar para detectar anomalías numéricas o estructurales, a nivel

cromosómico

c) Los cromosomas se ordenan únicamente en función de su morfología

2) GENERALIDADES SOBRE CROMOSOMAS: Complete los espacios en blanco

Los cromosomas presentan una constricción llamada _______________. Dicha constricción

genera dos brazos cromosómicos, uno largo y otro corto, denominados ___ y ___,
respectivamente. Los extremos de los cromosomas se denominan _______________.

Todos los individuos pertenecientes a una misma especie presentan el mismo número de
cromosomas. A modo de ejemplo, la especie bovina tiene ___ cromosomas, mientras que el
ser humano tiene ___.

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3) MORFOLOGÍA CROMOSÓMICA: Una según corresponda

submetacéntrico

metacéntrico

acrocéntrico

4) PRINCIPALES ETAPAS EN LA REALIZACIÓN DE UN CULTIVO LINFOCITARIO: Ordene

cronológicamente

( ) Incubación en estufa de cultivo durante 72 hs.

( ) Choque hipotónico.

( ) Lavado celular.

( ) Extracción de sangre del individuo.

( ) Agregado de colchicina.

( ) Realización de extensiones celulares y tinción de las mismas.

( ) Fijación celular.

( ) Preparación del medio de cultivo completo.

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5) COMPUESTOS EMPLEADOS EN TÉCNICAS CITOGENÉTICAS DE RUTINA: Crucigrama

1 2

3
4

5
6 7

9
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Horizontales:

(1) Sustancia que oficia de suplemento del medio basal de crecimiento.

(4) Agente antimitótico que detiene a la célula en estadio de metafase.

(6) Nutriente requerido para la síntesis de proteínas.

(9) Tinción empleada para la coloración de extendidos cromosómicos.

(10) Solución fijadora compuesta por tres partes de metanol y una de ácido acético.

Verticales:

(2) Inductor de la división celular.

(3) Fórmula química del compuesto con el que se prepara la solución hipotónica.

(5) Inhibidores del crecimiento bacteriano.

(7) Alcohol en el cual se conservan las láminas portaobjetos.

(8) Medio de cultivo para células y tejidos (uno de los más difundidos en la actualidad).

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 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Eldrige, F.E. (1985). Cytogenetics of Livestock. The AVI Publishing Company, INC.Wesport,
Connecticut.

Klug, W., Cummings, M.; Spencer, C. (2006). Conceptos de Genética. 8ª edición. Pearson
Education-Prentice Hall.

http://www.morfcitologia.blogspot.com/

Los protocolos que conforman este repartido pertenecen al Área Genética de Facultad de
Veterinaria-UdelaR.

Imágenes extraídas de:

http://www.hyle-capacitacion.com/feria-cientifica-uai-2012

http://www.ceibal.edu.uy

El presente librillo se encuentra disponible en

http://share.snacktools.com/9FE55DCF8D6/ftnf4knh

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