GUIA DE ESTUDIO

PROGRAMA DE HEMATOLOGÍA

SEGUNDO AÑO

AUTORES:

Dra Tania Carballo Treto

Dr Ariel Colina Rodríguez

2003
 Unidad I

Tema 1: Anemias. Generalidades.

Objetivos:
1) Identificar el concepto de anemia, sus causas, frecuencia y distribución
mundial.
2) Clasificación morfológica de las anemias según las constantes
corpusculares.

Introducción:

Definición de Anemia: Es la reducción de la concentración de hemoglobina y

del número de eritrocitos por debajo de los límites considerados como
normales, según el sexo, la edad y la altitud del lugar de residencia.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) establece que existe anemia
cuando la concentración de hemoglobina en sangre es inferior a los siguientes
valores:
Niños de 6 meses a 6 años - 11 g/dl
Niños de 6 años a 14 años - 12 g/dl
Varones adultos - 13 g/dl
Mujer adulta, no embarazada - 12 g/dl
Mujer adulta, embarazada - 11 g/dl

Contenido del Tema:

Clasificación morfológica: Se realiza teniendo en cuenta las constantes

corpusculares, fundamentalmente el volumen corpuscular medio (VCM):
- Anemias normocíticas (VCM = 80–100 fl)
- Anemias macrocíticas (VCM > 100 fl)
- Anemias microcíticas (VCM < 80 fl)
Las patologías incluidas en cada una de ellas se relacionarán en la estrategia
diagnóstica.

Manifestaciones clínicas: Existen manifestaciones clínicas comunes a todos

los tipos de anemia
Generales: Cansancio, disminución del deseo sexual. Cardiorespiratorias:
Palpitaciones, disnea al esfuerzo o en reposo si la anemia es severa, angina,
claudicación intermitente, manifestaciones de insuficiencia cardiaca
congestiva.
 Neurológicas: Cefalea, mareos, vértigos, somnolencia, confu-sión,
irritabilidad, ruidos en los oídos, pérdida da la concentración, debilidad
muscular.
Los síntomas son ligeros si la instauración es lenta, como ocurre en las
anemias crónicas. Si la instalación es aguda, como en las hemorragias éstos se
agravarán y pueden ir desde la hipotensión hasta el shock..

Diagnóstico de la Anemia: Se realiza a través de tres elementos esenciales.

1. Interrogatorio: Es importante conocer:
Edad, sexo y raza
Ocupación
Dieta
Antecedentes de cirugía en el tractus gestrointestinal
Antecedentes familiares de anemia
Hábitos tóxicos
Enfermedades subyacentes
2. Exámen físico:
Piel y mucosa: Palidez, íctero, púrpuras
Sistema cardiovascular: Soplos, edemas
Faneras: Caída del cabello, fragilidad de las uñas.
Sistema hemolinfopoyético: Adenopatías, hepatomegalia y
esplenomegalia.
Miembros inferiores: Ulceras en las piernas.
3. Estudios de laboratorio:
Debe estar orientado a establecer en primer lugar la presencia y magnitud de
la anemia y en segundo lugar a conocer su etiología. Para ello se realizan los
siguientes análisis.
1) Hemograma: Este es un estudio complejo que incluye los siguientes
parámetros:
- Hemoglobina: Se realiza de forma manual ó automatizada, por una variedad
de métodos colorimétricos y técnicas espectrofotométricas, pero el más
recomendado es el de la cianometahemoglobina (CMH), ya que todas la
formas de hemoglobina son convertidas en ella, usando un reactivo apropiado
( por ejemplo el reactivo de Drabkin el cual contiene cianuro de potasio y
ferricianuro de potasio). La absorbancia de la CMH es medida en un
espectrofotómetro a 540 nm y se determina la concentración de Hb.
Los valores de referencia normales fueron explicados con
anterioridad.
- Hematocrito: Es la proporción del volumen de una muestra de sangre que
es ocupada por los eritrocitos.
Puede realizarse de forma manual (siendo recomendado el microhematocrito
por ser sencillo y reproducible) ó automatizado a partir de cálculos
matemáticos teniendo en cuenta el número de eritrocitos y el volumen de
éstos.
Valores de referencia: Mujer: 37–47 l/l
Hombre: 41–54 l/l
- Conteo de eritrocitos: Este parámetro debe realizarse en contadores
celulares automatizados y no de forma manual donde el error puede ser de 7-
14%, dependiendo de la experiencia del técnico.Valores de referencia: Mujer:
4.3 ±0.7x1012/L
Hombre: 4.8±0.6x1012/L
- Constantes corpusculares:
 Volumen corpuscular Medio (VCM). Se mide directamente en los
contadores ó se puede calcular por la fórmula:

Hto l/l x 1000

VCM= 
Conteo de eritrocitos (X 1012/L)

Valores de referencia: 80–100 fentolitros (10-15L)

Es el más útil ya que permite clasificar y desarrollar una estrategia en el
diagnóstico de las anemias.
 Hemoglobina Corpuscular Media (HCM):
Es una medida del peso promedio de la hemoglobina por glóbulo rojo. Se
calcula:
Hb g/L
HCM= 
Conteo de eritrocitos (x1012/L)

Valores de referencia: 28-32picogramos (10-12g)

 Concentración hemoglóbica corpuscular media (CHCM). Es una
medida de la concentración promedio de la hemoglobina en el glóbulo
rojo.
Hb g/L
CHCM= 
Hto(L/L)

Valores de referencia: 320-360 g/L

La HCM y la CHCM no dan información adicional de importancia comparado
con el VCM para el diagnóstico de la anemia. Su utilidad está dada en el
control interno de la calidad, evaluando la estabilidad de la medición de un
control por un equipo automatizado.
- Indice de distribución eritrocitario (IDE):
Refleja la variación en el tamaño de los glóbulos rojos en una muestra (nos da
el grado de anisocitosis), lo cual tiene valor en el diagnóstico temprano de las
anemias.
Valores de referencia: 11-15,8 %
En la anemia ferropénica por ejemplo el IDE está elevado con un VCM
disminuido a diferencia de la talasemia, donde el VCM está también
disminuido pero el IDE es normal.
- En la actualidad existen contadores celulares de varias firmas (Coulter,
Sysmex, ABX...) que realizan las mediciones en los eritrocitos, plaquetas y
leucocitos, reflejando además los conteos difirenciales, con la ventaja de
contar gran número de células, minimizando el error estadístico.
2) Conteo de reticulocitos:
El reticulocito es una célula joven, inmadura, de la serie eritroide, que
contiene material reticulado (ARN). Su estudio permite diferenciar anemias
por fallo medular de las producidas por hemorragias o hemólisis. Además se
utiliza para chequear la efectividad del tratamiento en las anemias
nutricionales.
Para su observación se necesita realizar una coloración supravital.
Valores de refrencia: 0,005-0,015
Para lograr una medida más exacta de la eritropoyesis se realiza la corrección
del conteo de reticulocitos por la siguiente fórmula:
Hto del paciente
Retículos contados (%) X 
Hto normal

3) Exámen de la lámina periférica:

Nos permite conocer las alteraciones eritrocitarias características de cada
patología. Además se observan las alteraciones de los leucocitos y las
plaquetas.
4) Medulograma y biopsia de médula:
Son estudios que están muy relacionados con los resultados de la lámina
periférica y que permiten confirmar el diagnóstico sospechado en ella.

Estrategia en el estudio de las Anemias:

Una vez confirmada la presencia de anemia, para conocer su etiología en el
menor tiempo posible y con poca afectación para el paciente, se deben realizar
estudios de forma escalonada, donde el primer paso será conocer el valor del
VCM y así poder clasificarla en microcítica, macrocítica ó normocítica. Ver
los algoritmos propuestos para el estudio de las anemias.
Conclusiones:
La anemia es la reducción de la concentración de hemoglobina y del número
de eritrocitos por debajo de los límites considerados como normales, según el
sexo, la edad y la altitud del lugar de residencia. La clasificación morfológica
se realiza según las constantes corpusculares y de ellas la más importante es el
volumen corpuscular medio, para su diagnóstico se tienen en cuenta tres
elementos fundamentales: el interrogatorio al paciente, el exámen físico y los
estudios de laboratorio que incluyen el hemograma, conteo de reticulocitos,
lámina periférica y las constantes corpusculares, las que permiten desarrollar
una estrategia diagnóstica para conocer la etiología de la misma.

Evaluación:
Cuestionario:
1) Diga qué entiende por anemia y cuáles son los estudios de laboratorio
que permiten su diagnóstico.
2) Explique la clasificación morfológica de las anemias teniendo en cuenta
las constantes corpusculares.
3) Causas de Anemias normocíticas, anemias macrocíticas y anemias
microcíticas.
 Temas 2 y 3: Anemias Nutricionales y su estudio.

Objetivos:
1) Interpretar el metabolismo del hierro
2) Identificar la frecuencia y distribución de la anemia ferropénica.
3) Identificar las causas de Anemias Ferropénica y Megaloblásticas.
4) Realizar la técnica de Hierro Sérico y Capacidades para el estudio de la
anemia feropénica y mencionar las técnicas utilizadas para el estudio de
las anemias megaloblásticas.

Introducción:

El hierro es el metal más abundante en el universo y está contenido en todas

las células del organismo. Su uso en la cura de diferentes trastornos se
menciona desde la antigüedad. Con el progreso del conocimiento se ha podido
profundizar en el metabolismo del hierro y las consecuencias para el
organismo de una inadecuada homeostasia.

La anemia megaloblástica constituye una de las causas de las anemias

macrocíticas (VCM mayor de 100 fl). Se caracteriza bioquímicamente por una
síntesis defectuosa de ADN, con poca afectación en la síntesis de ARN y
proteínas y morfológicamente por una asincronía en la maduración entre el
núcleo y el citoplasma de las células.

Contenidos del Tema:

Metabolismo del Hierro

El hierro tiene propiedades químicas únicas y cumple una variedad de
funciones biológicas indispensables para la vida animal y vegetal.
- Los compuestos del hierro se pueden clasificar en dos categorías
funcionales:
1) Función metabólica o enzimática:
Hemoglobina y mioglobina: Proteínas que contienen Hem y se combinan en
forma reversible con el O2.
Citocromos a, b y c: Proteínas que contienen Hem y están implicadas en el
transporte de electrones.
Peroxidasas: Proteínas que contienen Hem y que activan el peróxido de H para
aceptar dos electrones a partir de diversos sustratos.
Catalasas: Proteínas que contienen Hem y que convierten el peróxido de
Hidrógeno en H2O y O2.
Deshidrogenasa succínica, láctica y xantino-oxidasa: Flavoproteínas que
están ligadas al hierro y que funcionan como receptores de electrones.
2) Función de Almacenamiento y Transporte:
Los compuestos relacionados con el depósito son la hemosiderina y la
ferritina, mientras que la proteína encargada del transporte es la transferrina.
La cantidad total de hierro de un individuo depende de su peso, composición
corporal, concentración de hemoglobina y volumen de los compartimientos de
depósitos, considerándose normal de 40-50 mg/Kg de peso en el hombre y 35
mg/Kg de peso en la mujer.
La mayoría del hierro está presente en compuestos Hem (65 % en la Hb, 15%
en la mioglobina y enzimas), solamente una pequeña cantidad está en el
plasma unido a la transferrina y los almacenes constituyen 30 % del hierro del
cuerpo.
En el hombre adulto se pierde diariamente por vía del tubo gastrointestinal 0,6
mg, en el sudor y exfoliación de células escamosas 0,2 mg y por el tracto
urinario 0,1 mg; para un total de 0,9 mg/día con un incremento adicional de
pérdida de 0,4 mg/día en la mujer a través de la menstruación.
La reposición de la pequeña cantidad que se pierde se realiza a través de la
ingesta, la cual varía en diferentes partes del mundo, pero se considera como
promedio entre 10 y 30 mg/día, de los cuales se absorben solamente entre el 5
y el 10 %.
Resumen de la Homeostasia normal del hierro:
Ingesta: 10 – 20 mg/día
Absorción normal: Hombre: 1 mg/día
Mujer no menstruante: 1mg/día
Mujer que menstrua: 2 mg/día
Mujer durante el embarazo: 5mg/día
Pérdidas: Hombre: 1 mg/día
Mujer no menstruante: 1 mg/día
Mujer que menstrua: 2 mg/día
-Ciclo del hierro:
En un adulto normal la hemoglobina contiene aproximadamente 2 g de hierro
(3,4 mg/g de hemoglobina). Alrededor de 23 mg/día llegan a los fagocitos del
sistema mononuclear fagocítico (SMF), debido a la destrucción de los
eritrocitos, los cuales tienen una vida media de 120 días. El SMF recibe
también un remanente de hierro que proviene de la eritropoyesis ineficaz (2
mg). De los 25 mg contenidos en el SMF 2 mg se encuentran en equilibrio
con el compartimiento de depósito y 23 mg son transportados totalmente por
la transferrina hasta la médula ósea para la síntesis de Hb. Para cerrar este
ciclo, la médula requiere diariamente 25 mg, de los cuales 23 mg provienen
del SMF y de 1 a 2 mg de la absorción intestinal. Aproximadamente 7 mg se
mantienen en equilibrio entre la circulación y los depósitos.
 Déficit de Hierro
- Prevalencia:
El déficit de hierro es la deficiencia nutricional más frecuente en países
desarrollados y subdesarrollados. Datos de la OMS muestran que el 30% de la
población mundial presenta anemia y la mitad se debe al déficit de hierro. No
obstante hay que plantear que se han realizado pocos estudios adecuados de la
prevalencia del déficit, ya que se usan diferentes análisis estadísticos que van
desde estudios muy simples hasta algunos muy sofisticados y otro problema es
la selección de la muestra a estudiar.

Causas de la deficiencia de hierro:

1) Disminución en ingesta:
-Dieta no equilibrada ó prácticas alimenticias inadecuadas.
2) Disminución en la absorción:
-Síndrome de malabsorción
-Aclorhidria
-Enfermedad Celiaca
-Aumento del tránsito intestinal
-Cirugía gastrointestinal: Gastrectomía, resección intestinal, anastomosis
del intestino delgado.
3) Incremento en las pérdidas de Fe:
Sangramiento gastrointestinal por:
Hemorroides, Ingestión de salicilato, Ulcera péptica, Hernia hiatal,
Divertículos, Neoplasias, Colitis ulcerativa, Esquistosomiasis, Trichuriasis
Várices esofágicas
Sitios desconocidos
Excesiva pérdida menstrual (Anticonceptivos, fibromas y otras patologías
ginecológicas)
Donación de sangre
Hemoglobinuria
Hemosiderosis pulmonar idiopática
IRC y hemodiálisis
Trastornos en la hemostasia
4) Aumento en las necesidades:
Fases de crecimiento en las infancia
Embarazo
Lactancia
Metabolismo de la Vitamina B12:
La vitamina B12 existe en la naturaleza en diferentes formas químicas
conocidas como cobalaminas (metilcobalamina, adenosilcobalamina,
hidroxicobalamina y cianocobalamina). Es producida sólo por
microorganismos de forma que el hombre la recibe por la dieta
exclusivamente.
Fuentes de vitamina B12: Carnes de órganos parenquimatosos, pescado,
productos lácteos, yema de huevo.
Depósitos en el organismo: 2 – 5 mg
Requerimientos diarios: 2 – 3 g
Pérdida diaria: 1,3 g
Se necesitan de 4-5 años para producir anemia por déficit en la ingestión.
Absorción: Las cobalaminas de los alimentos se encuentran unidas a
proteínas, liberándose en el estómago a través de proteolisis con pepsina a ph
bajo, aquí la cobalamina se une a proteínas de unión específica denominadas
proteínas R. Después de la exposición a proteasas pancreáticas la vitamina es
liberada de las proteínas R en el duodeno y forma un complejo con el Factor
Intrínseco (FI), glicoproteína termolábil que se produce en las células
parietales gástricas y tiene la capacidad de unir cobalaminas con alta afinidad
y especificidad. El complejo cobalamina-FI se absorbe en el ileon a tavés de
receptores localizados sobre las microvellosidades de las células de la mucosa
de esta región. Una vez que la vitamina es internalizada en el enterocito y
liberada del FI, se une a la transcobalomina II, la cual es encargada de llevarla
a los tejidos. El complejo TC II/cobalamina es aclarado rápidamente de la
circulación y unida a receptores de superficie específicos presentes en muchas
células, en el interior de las mismas la cianocobalamina y la
hidroxicobalamina deben ser convertidas en sus formas coenzimáticas activas,
reduciéndose inicialmente a Co++ (cob II alamina), luego una parte de éstas
son reducidas en las mitocondrias a la forma Co+(cob(I)alamina), la cual es
alquilada por el ATP para formar 5 desoxiadenosilcobalamina, cuya función es
participar en el ciclo de los propionatos, interviniendo en la transformación de
metilmalonilCoA a succinilCoA. El resto de la cobalamina se une a la N 5
metil-tetrahidrofolato homocisteína-metiltransferasa en el citoplasma, donde
es convertida a metilcobalamina, esencial para el paso de homocisteína a
metionina, catalizando la desmetilación del ácido metiltetrahidrofólico que se
convierte en FH4.
Existen otras dos formas de transcobalaminas:
TC I: No es una proteína de transporte y tiene un rango de aclaramiento bajo.
Constituye una forma de almacenamiento de la vitamina, se produce en los
precursores granulocíticos.
TC III: Función de transporte. Se aclara aproximadamente en 3 minutos. Se
une a un amplio espectro de análogos de la cobalamina que son rápidamente
aclarados por el hígado. Se produce en los gránulos específicos de los
neutrófilos.

3.3 Metabolismo del Acido Fólico:

Los folatos de la dieta están constituidos por poliglutamatos, encontrándose en
los vegetales frescos, proteínas animales como hígado y riñón, huevos,
levaduras, habichuelas y frutas.
La leche tiene poca cantidad y en la cocción prolongada (mayor de 15
minutos) se pierde hasta el 95 %.
Depósitos: 6-20 mg, ubicados fundamentalmente en el hígado.
Necesidades diarias: 50-75 g en los adultos.
Aporte de dieta: 1 - 1,5 mg, el exceso se elimina.
La OMS recomienda una ingesta de 200 g en adulto, 400 g en la
embarazada y 300 g durante la lactancia.
Absorción: Se necesita la enzima conjugasa del intestino para desdoblar los
poliglutamatos a monoglutamatos que se absorben de forma rápida y eficaz en
el duodeno y primera porción del yeyuno. En el intestino el folato es reducido
a FH2 y luego a FH4 por la dihidrofolato reductasa, lo cual puede tener lugar
también en el hígado u otros tejidos. Posteriormente se metila a N5-
Metiltetrahidrofólico. En esta estructura química pasa al torrente sanguíneo,
uniéndose a diferentes proteínas como la albúmina y a una proteína
transportadora específica. Es rápidamente aclarado del plasma y su entrada a
la célula ocurre a través de receptores específicos.
Funciones:
- Intervienen en la transformación de uridín-monofosfato (UMP) a
timidínmonofosfato (TMP), un nucléotido esencial para la síntesis de DNA.
- En la síntesis de purinas de novo.
- Son capaces de aceptar varios fragmentos de un carbono
- Degradación del FIGLU
3.4 Interrelación entre el metabolismo de la Vit B 12 y el ácido fólico: (Figura #
5).
La cobalamina cataliza la desmetilación del metilFH4, convirtiéndolo en su
forma activa (FH4). Cuando existe déficit de Vitamina B12 el mecanismo se
interrumpe acumulándose N5MetilFH4, que se continúa generando sin poder
pasar a su forma activa con disminución del resto de los intermediarios
metabólicos, menor producción de purina y timina y disminución de la síntesis
de DNA.

Causas de Anemias Megaloblásticas:

I.- Deficiencia de Vitamina B12
1. Déficit en la ingestión
2. Trastorno en la absorción:
a) Ausencia del factor Intrínseco
- Anemia perniciosa congénita y adquirida
-Cirugía gástrica
-Ingestión de cáusticos
b) Factor Intrínseco funcionalmente anormal
c) Fallos en la absorción en el intestino delgado
-Captación anormal en el ileon (Síndrome de Imerslun Grasbeck).
-Enfermedades como: resección ileal, enteritis regional, tuber-culosis y
linfomas del ileon terminal, enfermedad celíaca, síndrome de Zollinger
Ellison, enfermedad crónica del páncreas.
-Competencia biológica por la Vitamina B12
- Superdesarrollo bacteriano en el intestino delgado: divertículos, anastomosis,
fístulas, asas ciegas, esclerodermia.
. Infestación por Dyphylobotrum Latum del pescado.
. Malabsorción inducida por drogas.
3. Transporte defectuoso
-Déficit congénito de transcobalomina II
-Transcobalomina II defectuosa
4. Transtorno en el metabolismo
-Errores congénitos del metabolismo
-Exposición a drogas, óxido nitroso.
II. Causas de deficiencia de ácido fólico
1. Déficit en la ingestión: pobreza, desnutrición extrema, ebullición
mantenida, alimentación con leche de cabra, dietas especiales.
2. Defecto en la absorción
-Congénito: mala absorción congénita de folato
-Adquiridos: Divertículos, resección intestinal, ileitis regional, linfomas.
-Inducida por drogas
3. Aumento en los requerimientos: Alcoholismo, cirrosis hepática, embarazo,
infancia, enfermedades asociadas con rápida proliferación celular, hemólisis
crónica.
4. Trastornos en el metabolismo:
-Congénitos: Errores congénitos del metabolismo (déficit enzimáticos)
-Adquiridos: Alcoholismo, enfermedades hepáticas, fármacos.
5. Aumento en la excresión: Diálisis.
III. Transtornos congénitos de la síntesis de DNA
a) Aciduria orótica
b) Síndrome de Lesch-Nyhan
c) Anemia megaloblástica que responde a la tiamina
d) Homocistinuria y aciduria metilmalónica
e) Déficit de enzimas requeridas para el metabolismo del folato.
IV. Trastornos de la síntesis de DNA inducida por drogas y toxinas:
a) Antagonistas del folato (Methotrexate)
b) Antagonistas de las purinas (6 Mercaptopurina).
c) Antagonistas de las pirimidinas (citosar)
d) Agentes alquilantes (ciclofosfamida)
e) Zidovudina (AZT, RETROVIR)
f) Trimetropín
g) Anticonceptivos orales
h) Anticonvulsionantes
i) Oxido nitroso
j) Arsénico
V. Eritroleucemia

Estudios de Laboratorio para el diagnóstico de:

a) Anemia Ferropénica:

Hemograma:
- Hemoglobina: Es un excelente representante de los compuestos que
contienen hierro funcionante. Los valores en el déficit de hierro latente son
normales y pueden ser tan bajos como de 3 a 4 g/dl en anemias crónicas
severas.
- Constantes corpusculares: Disminuidas (anemia microcítica-hipocrómica)
- Índice de distribución Eritrocitario (IDE): Es realizado fácilmente por los
modernos contadores celulares. Es reportado como el coeficiente de variación
(en %) del volumen eritrocitario. Puede jugar un rol en la detección y
diagnóstico diferencial del déficit de hierro, ya que generalmente se encuentra
elevado en éste, mientras que en talasemia y anemia de proceso crónico tiende
a ser normal.
- Hallazgos en sangre periférica: La anisocitosis es el primer cambio
morfológico reconocible. Los glóbulos rojos son anormales en adultos sólo
cuando la anemia es de moderada a severa (hombre < 12 g/dl y mujer < 10
g/dl) observándose eliptocitos, poiquilocitos, células en diana.
Leucocitos: Generalmente normales, en los casos con eritropo-yesis ineficaz
importante se observará leucopenia.
Plaquetas: Es común la presencia de trombocitosis la cual retorna a la
normalidad después del tratamiento.
Algunos pacientes con anemia ferripriva de larga evolución tienen
trombocitopenia ligera, posiblemente por déficit de folato ó secuestro
esplénico.
2. Reticulocitos: Usualmente normales. Si se encuentra reticulocitosis debe
estar relacionada con sangramiento activo ó terapia reciente con hierro.
3. Resistencia osmótica:
Normal ó ligeramente aumentada lo cual retorna a la normalidad con el
tratamiento.
4. Medulograma:
El exámen de médula es necesario cuando los procedimientos menos
invasivos no han sido útiles en el diagnóstico.
Existe hiperplasia eritropoyética, los eritroblastos son pequeños, pueden tener
citoplasma escaso, poco hemoglobinizados, a menudo con borde irregular. Sin
embargo estos cambios no son suficientes distintivos para ser de valor
diagnóstico.
La importancia en realidad radica en evaluar los depósitos de hierro de la
médula por la coloración con Azul de Prusia: una ausencia de coloración
confirman la deficiencia; pero resultados erróneos pueden obtenerse en
pacientes transfundidos ó tratados con Fe parenteral, donde se observan
cantidades de Fe coloreable normal e incluso aumentado, aunque no esté
disponible para la eritropoyesis.
5. Concentración de hierro sérico: Está bajo en pacientes no tratados. El rango
normal depende del método usado, por lo que existen diferencias
interlaboratorios, no obstante en la mayoría está entre 13-31 mmol/L para el
hombre y entre 10 y 31 mmol/L para la mujer.
Métodos para determinación de Hierro Sérico:
Más del 90 % de todas las determinaciones de hierro en el laboratorio clínico
son realizadas colorimétricamente, las cuales tienen los siguientes pasos en
común:
1. Liberación de iones de hierro férrico(Fe+3) desde el complejo con la
transferrina, utilizando un ácido. .
3+ 2+
2. Reducción de iones Fe a iones Fe : Se usan agentes reductores como
ascorbato, hidroquinona, tioglicolato y la hidroxilamina.
3. Reacción de Fe2+ para formar un complejo coloreado: Los únicos agentes
utilizado para formar complejo son la batofenantrolina y la ferrozina.
Los métodos de referencia han sido propuesos por el Comité Internacional
para Estandarización en Hematología (ICSH) y más recientemente por el
Centro de Control de Enfermedades (CDC).
La principal limitación del uso de hierro sérico es la considerable variabilidad
en los valores, lo cual depende de factores técnicos, fisiológicos y patológicos.
-Factores Técnicos:
Contaminación de tubos de vidrio y reactivos con hierro.
Atrapamiento del Fe en las proteínas plasmáticas durante su precipitación.
Usar sueros ó plasma heparinizados.
Hemólisis de la muestra.
-Factores fisiológicos:
Las concentraciones de hierro tienen un ritmo diurno, disminuyendo en la
tarde y la noche y con valores máximos entre las 7am y 10 am.
Menstruación: Los valores disminuyen con ésta.
-Factores patológicos:
Procesos inflamatorios o malignos: Se observa disminución de los valores en
los procesos crónicos.
Concentraciones normales ó aumentadas se pueden obtener en pacientes con
déficit de Fe si reciben medicación antes de realizar el análisis, aún con
tabletas de sólo 18 mg de hierro elemental y con inyecciones de hierro por
varias semanas.
6. Determinación de la capacidad total de unión al hierro (CT) y de la
capacidad latente de unión al hierro (CL)
CT: Es la cantidad de Fe que puede ser unida a la transferrina en un volumen
específico de suero.
CL: Es el resultado obtenido cuando la cantidad de Fe presente es sustraído de
la CT. Representa la transferrina sin hierro.
Para medir la capacidad total: Un exceso de iones de Fe3+ se adicionan al suero
para saturar la transferrina. Los iones de Fe3+ no unidos son precipitados con
carbonato de magnesio ligero. Después de centrifugación se mide el hierro en
el sobrenadante.
Valor de Referencia para CT: 45 – 72 mmol/l
Indice de saturación de la trasnferrina: Se calcula con la siguiente fórmula:
Fe sérico x 100
% saturación de transferrina = 
CT

Valor de Referencia: 20 – 45 %
7. Determinación de las proteínas de unión al hierro: Transferrina y ferritina.
Los métodos modernos para su determinación se basan en inmunoensayos.
a) Para la determinación de Tansferrina debido a su concentración
relativamente alta se utilizan los métodos de precipitación inmunológicos
directos, entre ellos tenemos inmunodifusión radial, métodos turbidimétricos y
nefelométricos.
Rango de referencia: 2.0 – 4.0 g/L
b) Ferritina: La medición de ferritina en plasma provee el estimado indirecto
más útil de los almacenes de hierro del cuerpo. Esfuerzos internacionales se
han dirigido para la estandarización de la determinación de ferritina
coordinados por la OMS, el Comité Internacional de Estandarización en
Hematología y otros. Existe un gran número de métodos comerciales, como
son :
Métodos turbidimétricos
Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA).
Inmunoensayo nefelométrico.
Inmunoensayo de fluorescencia (FIA)
Inmunoensayo con luminiscencia (LIA)
Radioinmunoensayos (RIA)
Electroquimiluminiscencia (CELIA)
La selección de un método dependerá de las características del laboratorio,
tipo y número de muestras, urgencia de la determinación, posibilidad de
automatización, personal requerido y costo por determinación.
Rango de referencia: Hombre: 30-300 ng/ml
Mujer < 50 años: 10-160 ng/ml
Las únicas dos condiciones que producen disminución de ferritina del
plasma independientemente de la disminución en los almacenes de Fe son el
hipotiroidismo y la deficiencia de ascorbato. Sin embargo, debido a que la
ferritina es una reactante de fase aguda cuando coexisten una enfermedad de
proceso crónico con déficit de Fe, la concentración de ferritina está
generalmente en rango normal y la interpretación de los resultados se hace
difícil.
8. Medición de receptores de transferrina en el plasma: Provee un medio útil
para detectar déficit de hierro:
El receptor de transferrina soluble es una forma truncada del receptor de
transferrina tisular, consiste del dominio citoplasmático N-terminal que ha
sido probablemente liberado desde la membrana celular. Este ensayo requiere
técnicas inmunológicas cuantitativas. Los valores en pacientes con déficit de
Fe están incrementados, lo que permite el diagnóstico diferencial con anemia
de proceso crónico donde los valores no se incrementan.
Hay que señalar que observaciones preliminares de algunos grupos de trabajo
han tenido resultados contradictorios con esta técnica, en cuanto a utilidad y
especificidad para el diagnóstico de las deficiencias de Fe.
9. Protoporfirina eritrocitaria libre (PEL):
Cuando el aporte de hierro a los eritrocitos es insuficiente para la síntesis del
hem, la protoporfirina que no ha podido ser utilizada, se acumula en los
hematíes. El aumento en la PEL es un índice muy precoz y sensible de
carencia del mineral, aunque no es específico pues también aumenta en la
intoxicación por plomo y en las anemias sideroblásticas.
Valor de Referencia: 10-99 g/dl
10.Exploración de la absorción de hierro:
 La disminución de los depósitos de Fe resulta en aumento en la absorción
intestinal del mismo.
El procedimiento tiene aplicación práctica limitada pues es incómodo para el
paciente, exige aparatos no disponibles en todos los centros y se encuentra
bajo influencia de varios factores como por ejemplo cualquier alteración a
nivel del estómago y por otra parte aumenta también en las anemias
sideroblásticas y talasemias aún con depósitos normales.

b)Anemias Megaloblásticas:
Estudios para establecer diagnóstico de anemia megaloblástica:
1. Hemograma: Anemia (70–80g/l), puede ser severa al diagnóstico
-VCM: 110 – 130 fl
-IDE: Elevado
-CHCM: Normal
2. Sangre periférica: Se caracteriza por la presencia de macrocitos ovales,
que pueden preceder al desarrollo de la anemia. También puede
observarse anisopoiquilocitosis, punteado basófilo, corpúsculos de
Jowell Jolly, anillos de Cabot. Existe hipersegmentación de los
neutrófilos (6 a 10 lóbulos ó más). Puede haber leucopenia y
trombocitopenia.
3. Conteo de reticulocitos: bajos.
4. Medulograma: Médula hipercelular global, hiperplasia eritroide con
asincronía en la maduración núcleo/citoplasma.
Serie granulopoyética: Se afecta también la maduración observándose stabs y
metamielocitos gigantes.
Sistema megacariopoyético: Alteraciones nucleares que dan aspecto de
megacariocito en rosario.
Azul de prusia: Positivo, puede haber sideroblastos anillados.
5. Enzima lacticodeshidrogenosa (LDH): Aumentada (LDH 1 > LDH 2)
6. Urobilinógeno urinario y fecal: Aumentado
7. Hierro sérico: Aumentado con disminución de la capacidad total (excepto
que exista un déficit concomitante de este mineral)
8. Bilirrubina sérica: Aumentada a expensas de la fracción indirecta
b) Exámenes para distinguir entre el déficit de vitamina B12 y de ácido fólico:
1. Determinación sérica de vitamina B12: Los valores de referencia varían
según el laboratorio y el método empleado, en general oscilan entre (200-900
pg/ml)
Se realiza por los siguientes métodos:
- Ensayos microbiológicos
- Métodos de dilución radioisotópica (RIA)
- Método de Electroquimioluminiscencia
 - Test de Schilling
- Anticuerpos anti células parietales:
- Anticuerpos anti factor intrínseco
- Estudio de secreción gastrointestinal: Aclorhidria histamino resistente
Gastroscopía: Atrofia de la mucosa gástrica.
Determinación del ácido fólico sérico y eritrocitario. Métodos empleados:
-Microbiológicos
-Método de dilución radioisotópico
- Método de Electroquimioluminiscencia
Metabolitos séricos y urinarios:
-Metilmalonato en orina para déficit de B12 : Aumentada en el déficit de
B12.
-Metilmalonato en suero:Aumentada en el déficit de B12
-Homocisteína en suero:Aumentada en el déficit de B12 y ácido fólico.
-Formiminoglutamato (FIGLU) en orina: Aumentada en el déficit de B12 y
ácido fólico.
c) Estudios para determinar la etiología del déficit:
-Adecuado interrogatorio: Conocer si es vegetariano, si la alimentación es con
leche de cabra, si existe cirugía previa ó diarreas crónicas ó el uso prolongado
de alcohol y determinadas drogas.
-Biopsia de yeyuno
-Pruebas de absorción
-Tránsito intestinal para determinar enfermedades congénitas ó adquiridas del
intestino.

Conclusiones:
Entre los nutrientes esenciales para la síntesis del eritrocito se encuentran el
hierro, la vitamina B12 y el ácido fólico, de los cuales es necesario conocer su
metabolismo y las consecuencias para el organismo de una adecuada
homeostasia ya que el déficit de éstos afecta varios órganos y sistemas. Con el
progreso del conocimiento se han incorporado exámenes de laboratorio que
permiten el diagnóstico específico de la deficiencia de estos nutrientes.

Evaluación:

La evaluación de estos temas debe realizarse en un seminario que abarque los

objetivos planteados, enfatizando en el estudio por el laboratorio de la
deficiencia de hierro, teniendo en cuenta las fases preanalítica, analítica y
posanalítica en la determinación de hierro sérico.
 Temas 4y 5: Anemias Hemolíticas y su estudio.

Objetivos:
1) Recapitular la estructura y función del eritrocito y el catabolismo de la
hemoglobina.
2) Definición de Anemia Hemolítica.
3) Clasificación etiológica de las Anemias Hemolíticas.
4) Identificar las pruebas de Laboratorio para el diagnóstico de las
Anemias Hemolíticas.

Introducción:

En el síndrome hemolítico se incluyen varias entidades nosológicas que tienen

como característica común la disminución de la supervivencia de los glóbulos
rojos en la circulación y la aparición de la anemia cuando la destrucción de los
hematíes excede la capacidad de síntesis medular.

Contenido del Tema:

Eritrocito: Constituye la célula madura de la serie. Tiene forma de disco

bicóncavo y tamaño de 8 m. Su vida media es de 120 días, durante los
cuales debe cumplir su función de transportar O2 y para ello tiene una
propiedad importante que es la deformabilidad que le permite atravesar
repetidamente capilares de solo 2-3 m. Esta propiedad está influenciada por
tres factores
1-Geometría de la célula: disco bicóncavo
2-Viscosidad: Dado por el contenido de hemoglobina
3-Componentes de la membrana celular y el citoesqueleto.
La membrana está compuesta por una bicapa fosfolipídica, colesterol y
proteínas a la cual está anclada una red de otras proteínas que constituyen el
citoesqueleto de la célula. (Ver fig. 3)
Proteínas Integrales: Banda 3 y Glicoforina
Proteínas periféricas: Espectrina, actina, 4.2 estableciéndose interacciones
horizontales y verticales.
-Horizontales:1-Dímero Espectrina – Dímero Espectrina
2-Espectrina - 4.1 - actina
-Verticales: 1-Espectrina - Bicapa Lipídica
2-Espectrina -2.1 - Banda 3
3-Espectrina-4.1-Glicoforina
-Bioquímica del eritrocito:

El eritrocito no tiene fosforilación oxidativa, sistema de citocromo, ni ciclo de

Krebs. No puede sintetizar lípidos ni proteínas. La vía de producción de
energía es la glicolisis anaerobia donde se forman tres importantes productos:
NADH (cofactor en la reacción de reducción de metahemoglobina), el ATP
(principal nucleótido de fosfato de alta energía) y el 2, 3 Difosfoglicérido (un
regulador en la función de la hemoglobina y reserva energética formado en el
cortocircuito de Rapaport Luebering)
-Cortocircuito Hexosa – Monofosfato ó Vía de las Pentosas:
Se ramifica de la principal vía glicolítica. El primer paso de esta vía es
catalizado por la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (G6PD), reacción
en la que se reduce el NADP a NADPH, cofactor requerido para la reducción
del Glutation Oxidado a Glutation reducido (GSH), el cual se requiere para
proteger a las células contra el estrés oxidativo.
- Formación y reducción de metahemoglobina:
La metahemoglobina es la forma de la hemoglobina en la cual el hierro del
Hem ha sido oxidado a forma férrica (Fe +3; esta forma no es funcional, ya
que no se puede unir al O2. Aunque pequeñas cantidades son producidas
constantemente, existen potentes sistemas enzimáticos y no enzimáticos que
reducen la metahemoglobina, convirtiendo el hierro al estado ferroso (Fe+2

Hemoglobina. Estructura y función.

Proteínas:
Son compuestos orgánicos de gran peso molecular, formados por aminoácidos
que se unen entre si para formar cadenas de polipéptidos. Son las moléculas
orgánicas más abundantes en las células. Se encuentran distribuidos en todos
los compartimentos celulares pues son fundamentales en la estructura y
función celular.

Existen muchas clases de proteínas, cada una de ellas especializadas en una

función biológica diferente.

Existen varias maneras para clasificar las proteínas:

 Según su composición :
 Proteínas simples: Son aquellas que por hidrólisis producen solo
aminoácidos, sin ningún otro producto principal, orgánico o inorgánico.
 Proteínas conjugadas: Son aquellas que por hidrólisis producen
aminoácidos u otros componentes orgánicos o inorgánicos.
 Según su conformación:
 Proteínas fibrosas: Constituidas por cadenas polipeptídicas ordenadas de
modo paralelo a lo largo de un eje, formando fibras o láminas largas.
 Proteínas globulares: Constituidas por cadenas polipeptídicas plegadas
estrechamente, de modo que adoptan formas esféricas o globulares
compactas.
 Según estructura:

 Estructura primaria: Se refiere al esqueleto covalente de la

cadena polipeptídica, y establece de modo específico la
secuencia de sus restos de amino ácidos.
 Estructura secundaria: Se refiere a la ordenación regular y
periódica en el espacio de las cadenas polipeptídicas a lo largo
de una dirección.
 Estructura terciaria: Se refiere al modo como la cadena
polipeptídica se curva o se pliega para formar la estructura
estrechamente plegada y compacta de las proteínas globulares.
 Estructura cuaternaria: Pone de manifiesto como se disponen
en el espacio las cadenas individuales polipeptídicas de una
proteína que posee más de una cadena.

 Según su función:

 Formando parte de la estructura celular (colágeno).

 Biocatalizadores (enzimas).
 Reguladores del metabolismo (hormonas).
 Preservar la composición genética (cromosomas).
 Almacenar amino ácidos como elementos nutritivos (caseína de la
leche).
 Transporte (hemoglobina, transferrina).
 Como elementos esenciales de los sistemas motiles contráctiles (actina
y miosina).
 Protección o defensa (inmunoglobulinas, trombina, fibrinógeno).
 Toxina (toxina diftérica).
Hemoglobina (Hb):

- Estructura: La hemoglobina está constituida por una parte proteica llamada

globina y una parte prostética llamada Hem en cuyo centro está localizado un
átomo de hierro.
Cada molécula de hemoglobina contiene dos pares de cadenas polipeptídicas
( con 141 aa y  con 146 aa); cada una de las cadenas está unida a un grupo
hemo. Las cuatro subunidades están unidas por medio de enlaces débiles de
tipo salino de Hidrógeno e interacciones no polares de Van der Waals,
formando una estructura tridimensional con la característica que los grupos
polares se sitúan hacia el exterior y los no polares en el interior y el grupo
Hem se encuentra contenido en una bolsa no polar formando varios contactos
con la cadena polipeptídica.
El grupo hemo está formado por un anillo porfirínico que contiene 4 grupos
pirrólicos unidos entre sí por puentes metenos (CH), en medio del cual se sitúa
un átomo de hierro.
Cada grupo pirrólico se sintetiza a partir de la glicina y ácido succínico
(intermediario del ciclo de Krebs) los cuales se unen por medio de la enzima
para formar el ácido -aminolevulínico, ocurriendo varias reacciones
enzimáticas hasta la producción de protoporfirina. Por medio de la enzima
hemosintetasa se une un átomo de hierro a la protoporfina para formar el Hem.

Tipos de hemoglobinas:

En las distintas etapas del desarrollo (desde el embrión hasta llegar al

individuo adulto), se sintetizan, en un orden fijo y rigurosamente determinado,
diferentes hemoglobinas constituidas por dos pares de cadenas polipeptídicas.
Se usan letras griegas para designar estas cadenas: α, β, γ, δ, ε y ζ.
Las hemoglobinas normales difieren según la etapa de desarrollo del
individuo.
Hemoglobinas embrionarias:
 hemoglobina Pórtland (γ 2 ζ 2).
 Hemoglobina Gower (ε 2 ζ 2).
 Hemoglobina Gower (α 2 ε 2).

Hemoglobinas fetales: G
 Hemoglobina F (α 2 γ 2).
 Hemoglobina F1(α2 γ2 A).

Hemoglobinas adultas:
  Hemoglobina A (α 2 β 2).
 Hemoglobina A2 (α 2 δ 2).

- Función de la Hemoglobina:
Consiste en transportar O2 desde los pulmones hasta los tejidos y el CO 2 (que
es un producto de los procesos metabólicos) en sentido inverso.
Una de las propiedades más importantes de la hemoglobina es su alta afinidad
por el O2 en presencia de cantidades moderadas de gas (pulmones) y baja
afinidad en lugares pobres en el gas (tejidos).
La interacción entre Hb y O2 están caracterizados por la curva de disociación
del O2 que se obtiene cuando el % de Hb saturado con O 2 se relaciona en una
gráfica con la presión parcial de O2. Esta curva es sigmoide y sus
características se relacionan con la propiedades de la hemoglobina y el medio
dentro del glóbulo rojo: Ph, temperatura y concentración del 2,3
difosfoglicérido (2,3 DPG).

2.5 Mecanismos de destrucción del glóbulo rojo:

Se postulan 4 mecanismos:
-Lisis osmótica
-Eritrofagocitosis
-Citolisis inducida por el complemento
-Fragmentación

2.6 Sitios de destrucción:

-Extravascular: En macrófagos del bazo y del hígado fundamentalmente

-Intravascular: 10 al 20 % de destrucción del glóbulo rojo es intravascular y
utiliza el sistema de la haptoglobina.
Haptoglobina: Glicoproteína sintetizada en el hígado que forma un complejo
con la hemoglobina el cual es removido por el sistema mononuclear fagocítico
hepático en un tiempo rápido.
La hemoglobinuria se presenta cuando la cantidad de Hb intravascular supera
el poder de unión a la haptoglobina y la capacidad de absorción de los túbulos
renales.
Hem, hemopexina y metahemalbúmina:

La hemoglobina libre en el plasma es rápidamente oxidada a

metahemoglobina, ésta se disocia en hem y globina. El hem se une a una
globulina  del suero llamada hemopexina formando un complejo que sufre
endocitosis en el hígado. Una parte de los grupos hem de la Hb libre circulante
se une también a la albúmina produciéndose metahemalbúmina, observable
solo cuando existe hemólisis intensa.

-Catabolismo de la hemoglobina:

Los glóbulos rojos senescentes son removidos de la circulación por los

macrófagos del bazo, hígado y médula. La globina se separa y es catabolizada
rápidamente en aminoácidos. El complejo de porfirina restante es dividido por
la enzima hem-oxigenasa, dando lugar a la formación de molécula de CO 2 y al
mismo tiempo la molécula de hierro de la Hb es liberada para su reutilización.
La molécula resultante llamada biliverdina es reducida enzimáticamente en
bilirrubina libre o no conjugada, la cual es conducida al hígado a través del
plasma unida a la albúmina. Luego se conjuga en las células parenquimatosas
con ácido glucurónico y así es excretado en la bilis y luego en el duodeno.
Una pequeña cantidad es reabsorbida en la sangre (circulación entero-
hepática). La bilirrubina intestinal recibe acción de bacterias formando
urobilinógenos que se eliminan en los excrementos y una pequeña cantidad es
reabsorbida de los intestinos y excretada en la orina.

Clasificación de las Anemias Hemolíticas:

I. Anemias Hemolíticas intracorpusculares (intrínsecas), debidas a un defecto
del glóbulo rojo:
1) Defectos de la membrana eritrocitaria:
-Esferocitosis hereditaria
-Eliptocitosis hereditaria
-Estomatocitosis
-Enfermedad por Rh
-Fenotipo Mc Leod
-Abetalipoproteinemia
2) Alteraciones de las enzimas:
a) Enzimopatías de la vía glucolítica:
-Hexoquinasa
-Glucosa fosfato isomerasa
-Fosfofructoquinasa
-Aldolasa
-Triosa Fosfato Isomerasa
-2,3 Difosfogliceratomutasa
-Fosfogliceratoquinasa
-Piruvatoquinasa
b) Enzimopatías de la vía de las pentosas y del metabolismo del glutation:
-G 6 Fosfato deshidrogenasa
 -  glutamilcisteil sintetasa
-Glutation sintetasa
c) Enzimopatías del metabolismo nucleotídico:
-Adenilatociclasa (AK)
-Adenosíndeaminasa (ADA)
-Pirimidín 5’Nucleotidasa (P5’N)
3) Defectos en la estructura y síntesis de la hemoglobina:
-Hemoglobinopatías: S, C, D y otras
-Talasemias
-Hemoglobinas inestables
-Hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN)
II. Anemias hemolíticas extracorpuculares (extrínsecas) secundarias a
alteraciones del medio que rodea al glóbulo rojo:
1) Inmunes:
- Transfusión de sangre incompatible
- Enfermedad hemolítica del recién nacido
- Anemia hemolítica autoinmune
- Asociada a fármacos
2) Traumática y microangiopática:
-Prótesis valvulares
-Síndrome urémico-hemolítico
-Púrpura trombocitopénica trombótica
-Coagulación intravascular diseminada
3) Infecciones: Protozoos: Paludismo, toxoplasma, tripanosoma
Bacterias: Cólera, fiebre tifoidea
4) Sustancias químicas: Drogas, venenos y tóxicos
5) Agentes físicos: Calor, quemaduras
6) Hiperesplenismo
7) Déficit de vitamina E en el recién nacido
Generalmente las anemias intrínsecas son de origen congénito, mientras que
las extrínsecas son adquiridas, aunque existen excepciones como la HPN, que
es una enfermedad adquirida donde sólo una porción de glóbulos rojos están
afectados, presentando una sensibilidad anormal a la lisis mediada por el
complemento.
Desde el punto de vista patogénico la hemólisis extravascular es la más
frecuente, localizándose en el sistema mononuclear fagocítico de bazo, hígado
y médula. La hemólisis intravascular es rara, caracterizándose por
hemoglobinemia y hemoglobinuria cuando se agota la capacidad de saturación
de la haptoglobina plasmática, la mayor parte de la hemoglobina filtrada por el
glomérulo es reabsorbida en el túbulo proximal donde el hierro se transforma
en hemosiderina, la cual puede observarse en el epitelio tubular mediante la
coloración de Azul de Prusia.

Diagnóstico de Laboratorio:
Para realizar un diagnóstico adecuado sin pérdida de tiempo ni recursos, el
primer paso siempre estará encaminado a demostrar la existencia de la
hemólisis y luego que esté conformado el segundo paso será establecer su
etiología.(ver figura: Algoritmo para el estudio de las anemias hemolíticas y
las tablas: Signos de destrucción acelerada de los eritrocitos y: Signos de
eritropoyesis acelerada)

Evaluación:
1) Defina y clasifique las Anemias Hemolíticas.
2) Explique el algoritmo a seguir para el estudio de las Anemias Hemolíticas.
3) Diga el fundamento y procedimiento técnico de las siguientes técnicas:
Electroforesis de Hemoglobina, Test de Brewer, Resistencia osmótica y
Prueba de Coombs.
 Unidad II

Tema 1: Fisiología de la Hemostasia

Objetivos:
1) Identificar el funcionamiento normal de los sistemas de la coagulación
y la fibrinolisis y sus mecanismos de control.
2) Interpretar la participación de las plaquetas en la hemostasia.

Introducción:

Hemostasia normal.
La sangre es una variedad especial de tejido conectivo. Tiene una sustancia
intercelular líquida, el plasma, formado por agua, proteínas, carbohidratos y
lípidos, en el que están suspendidos los elementos formes: eritrocitos,
leucocitos y plaquetas. La sangre circula dentro de un sistema cerrado
formado por el corazón y los vasos sanguíneos. Sus funciones principales se
ejercen a través de su circulación por los diferentes órganos del cuerpo.

La pared vascular de todos los vasos (arterias, venas y capilares), presenta en

su superficie interna o luminal una monocapa de células endoteliales
(endotelio vascular), que tiene en el adulto un área mayor de 1000 m 2 y que
funciona dinámicamente como una interfase entre los constituyentes de la
sangre y los tejidos además de poseer una intensa actividad biológica y
metabólica. En el endotelio vascular se producen sustancias tromboresistentes
que inhiben la actividad plaquetaria, la generación de trombina y estimulan la
fibrinolisis. El endotelio vascular es soportado por un grupo de estructuras
(subendotelio, membrana elástica interna, capa media muscular y membrana
elástica externa), que varían según el tipo y calibre del vaso y presentan
sustancias trombogénicas que activan la hemostasia.

Las principales sustancias tromboresistentes producidas por el endotelio son:

factor relajante vascular(oxido nítrico), prostaglandina I2, nucleótidos de
adenina, glicosaminoglicanos, sulfato de heparán, trombomodulina, receptor
endotelial de la proteína C, activador tisular del plasminógeno, receptor del
activador tipo uroquinasa del plasminógeno, mientras que los principales
componentes trombogénicos de la pared vascular son: fibras colágenas,
fibronectina, trombospondina, laminina, factor von Willebrand, factor tisular e
inhibidor del activador del plasminógeno.
La pared vascular está sufriendo lesiones constantemente más o menos
extensas con pérdidas del endotelio, que deben ser reparadas mediante un
proceso rápido, localizado y reversible. El sistema hemostático es el
encargado de llevar a cabo este proceso, él controla la pérdida de
sangre(hemorragia) cuando se produce una solución de continuidad en la
pared vascular, mediante complejas interacciones celulares y bioquímicas que
involucran la pared vascular, las proteínas del plasma(coagulación y
fibrinolisis) y las células de la sangre(plaquetas y otras).

Cuando se produce la lesión del vaso, comienza la formación de un tapón

hemostático sobre el área lesionada formado por plaquetas(trombo primario),
al que se le añade una malla de fibrina(trombo estable secundario) terminando
en la reparación de la pared vascular dañada y la disolución del trombo
formado. También es función de la hemostasia controlar, regular y localizar el
proceso cerca del área dañada, manteniendo la fluidez de la sangre y su
circulación. La extensión incontrolada o propagación del proceso de la
hemostasia dentro de un vaso sanguíneo puede producir una oclusión parcial o
total del mismo, con disminución o detención del flujo de sangre(trombosis), o
el desprendimiento de un fragmento del trombo que ocluye otra zona del
sistema vascular(embolia).

La hemorragia y la trombosis se presentan en muchas situaciones clínicas, por

lesiones vasculares o disregulaciones adquiridas o congénitas del sistema
hemostático que rompen el equilibrio entre los
factores procoagulantes y anticoagulantes.

Contenidos del tema:

Mecanismos de la Hemostasia.
La hemostasia es un mecanismo de defensa que funciona estrechamente
vinculado con los procesos de reparación tisular (inflamación y regeneración
tisular), protegiendo la integridad del sistema vascular. Es un proceso
complejo en el que intervienen componentes celulares y plasmáticos con
actividades pro y anticoagulante, que interaccionan de forma continua desde
que se lesiona el endotelio de un vaso sanguíneo. Para su estudio se describen
cuatro fases:

1. Vasoconstricción localizada en el área afectada.

2. Adhesión, activación, liberación y agregación de las plaquetas sobre el sitio
de lesión (hemostasia primaria).
3. Generación de trombina y formación de una red de fibrina que estabiliza el
trombo plaquetario (coagulación o hemostasia secundaria).
4. Eliminación de los depósitos de fibrina (fibrinolisis) y reparación de la
pared vascular.

Inmediatamente después de una lesión de un vaso se produce una estimulación

de terminaciones simpáticas de la musculatura lisa por un mecanismo reflejo
que resultan en una vasoconstricción rápida que detiene la circulación y
facilita la adhesión y agregación de las plaquetas y la formación de fibrina.

Hemostasia primaria.

Las plaquetas son células anucleadas pequeñas que se originan de la

fragmentación del citoplasma de los megacariocitos maduros. Los
megacariocitos son las células hematopoyéticas mayores de la médula ósea,
son células poliploides que se desarrollan mediante un proceso de endomitosis
donde sufren de 3 a 5 ciclos de duplicación cromosómica sin división
citoplasmática. El proceso de liberación de las plaquetas o fragmentación se
produce en los sinusoides de la médula ósea y en los capilares de la
circulación pulmonar. Las plaquetas circulan de 7 a 11 días, el compartimento
plaquetario periférico está formado por 2/3 de plaquetas circulando y 1/3 en el
bazo. Sólo una pequeña fracción de la masa de plaquetas es consumida en
condiciones normales en la hemostasia, el resto son removidas al término de
su vida por el sistema fagocítico mononuclear. La concentración de plaquetas
en la sangre oscila entre 140 a 450 X 10 9/L. La disminución del número de
plaquetas estimula la trombogenesis, este proceso es regulado por la
trombopoyetina (TPO).

Las plaquetas se observan al microscopio óptico en una extensión de sangre

periférica coloreada con colorantes tipo Romanowsky (Wright, Giemsa, May-
Grünwald, Leishman) con un diámetro de 3 a 5 m, redondas u ovoides con
un halo de citoplasma basófilo (hialómero) y con gránulos azurófilos
concentrados hacia el centro de la célula(granulómero). Si la cuenta de
eritrocitos es normal de 4.5 a 6.0X 1012/L un promedio de 1 plaqueta por cada
10 a 30 eritrocitos es observado. Con un aumento de 1000X(ocular 10X y
objetivo de 100X) de 7 a 20 plaquetas se observan por campo en el área donde
la morfología de los eritrocitos es óptima. Cuando la sangre utilizada para la
extensión es anticoagulada las plaquetas se observan desagregadas, mientras
que si se utiliza sangre no anticoagulada capilar o venosa normalmente se
observan en las láminas formando grumos o agregados.

La ultraestructura de las plaquetas es compleja. Las plaquetas en reposo tienen

forma discoide con bordes lisos. En cortes observados en el microscopio
electrónico (ME) de transmisión se observa una zona externa llamada
glicocálix rica en glicoproteínas integrales y proteínas absorbidas del plasma,
glicolípidos y mucopolisacáridos, con un espesor de 15 a 20 nm, que le
confiere a la plaqueta en reposo una carga neta negativa en su superficie
debido a los residuos de ácido siálico sobre las proteínas y lípidos. En esta
zona se encuentran múltiples receptores que median la transmisión de señales
de agentes estimulantes. La membrana plasmática es una típica membrana
trilaminar formada por una bicapa de fosfolípidos, colesterol y proteínas.
Cuando se examinan las plaquetas en un ME de transmisión o de barrido se
observan aberturas en su superficie que son parte de un extenso sistema de
canales que se extiende por todo su interior e incrementa el área de contacto
del interior de la plaqueta con el exterior, esta estructura se llama sistema
canalicular conectado a la superficie(SCCS). Por debajo de la membrana
existe una banda de microtúbulos que brindan soporte estructural a la forma
discoide de la plaqueta y otros componentes del citoesqueleto principalmente
la actina y otras proteínas asociadas (miosina, talina, proteína que une actina,
vimentina, etc.), que se extienden por todo el citoplasma de la plaqueta y
tienen como función principal brindar soporte estructural a los procesos de
activación, cambio de forma, liberación y agregación de la célula. Cercano al
SCCS se encuentra un sistema de canales cerrados de aproximadamente 400 a
600 nm de diámetro, derivado del retículo endoplasmático liso de los
megacariocitos nombrado sistema tubular denso (STD) que funciona
almacenando y regulando la concentración de calcio intracelular.

Además de mitocondrias y gránulos de glucógeno, las plaquetas tienen 4 tipos

de gránulos: gránulos alfa, gránulos densos, lisosomas y microperoxisomas.
Los dos primeros se identifican en ME por sus diferentes densidades
electrónicas y los otros dos requieren tinciones citoquímicas, los gránulos alfa,
son los gránulos predominantes en las plaquetas, son redondos u ovales con un
diámetro de 300 a 500 nm y contienen diferentes proteínas.

Las plaquetas tienen un papel fundamental en la hemostasia primaria y

participan en la hemostasia secundaria (generación de trombina). La
hemostasia primaria presenta 4 pasos críticos: la adhesión de las plaquetas al
endotelio dañado, la activación y el cambio de forma, la liberación del
contenido de los gránulos y la agregación de otras plaquetas.

Las plaquetas pueden desempeñar su función fisiológica en la hemostasia

porque están dotadas de una extraordinaria capacidad para responder a
estímulos. La interacción inicial de estos estímulos con la plaqueta tiene lugar
en la membrana, donde son captados y reconocidos por diferentes receptores
que continúan un proceso complejo de transmisión de los mensajes iniciados
por el estímulo hacia el interior de la plaqueta, mediante reacciones
bioquímicas que terminan en una respuesta biológica adecuada.

Cuando se lesiona el endotelio vascular las plaquetas que circulan en forma

aislada se ponen en contacto con la matriz subendotelial. Se inician
interacciones entre proteínas adhesivas en la pared vascular (factor von
Willebrand) y colágeno con receptores proteicos de la membrana plaquetaria
(complejos de glicoproteínas Ib/IX/V y Ia/IIa). La activación produce
cambios estructurales en la membrana con exposición de glicoproteínas como
la IIb/IIIa, que facilitan las interacciones entre plaquetas utilizando como
moléculas de adhesión, al fibrinógeno y al FvW. La plaqueta cambia su forma
de discoide con bordes lisos a esférica con pseudópodos.

Conjuntamente se inicia una secuencia de procesos bioquímicos que propician

la agregación, y la liberación de sustancias como el ADP, serotonina y
tromboxano A2 (TXA2), que son estímulos plaquetarios que refuerzan la
activación y la agregación y promueven el reclutamiento de nuevas células al
trombo en formación.

Hemostasia secundaria.

La formación de una red de fibrina en la zona de lesión vascular, es un paso

fundamental en el mecanismo de defensa contra la hemorragia. El sistema de
la coagulación, al igual que las plaquetas, es también activado por la ruptura
del endotelio vascular que expone la sangre al tejido subendotelial y
extravascular. Las respuestas del sistema de la coagulación son coordinadas
con la formación del tapón plaquetario que ocluye la lesión vascular. Los
mecanismos anticoagulantes naturales aseguran el control de la coagulación
en la zona afectada y en condiciones normales prevalecen sobre los factores
coagulantes. Alteraciones del balance natural de los sistemas coagulantes y
anticoagulantes causados por factores adquiridos o genéticos resultan en
hemorragias o trombosis.

En este proceso intervienen un grupo de proteínas, los factores de la

coagulación, que incluyen enzimas, cofactores y receptores. Las enzimas
pertenecen a la familia de enzimas proteasas tipo tripsina y quimiotripsina. En
general las proteínas y los componentes celulares de la hemostasia están en
forma inactiva. Las enzimas y los cofactores circulan en forma de proenzimas
y procofactores que son activados por ruptura de enlaces peptídicos y
liberación de fragmentos que los convierten en formas activas.
La trombina es la enzima principal del sistema de la coagulación, interviene
en la activación plaquetaria, en la conversión del fibrinógeno en fibrina y en la
amplificación de la coagulación, pero también la trombina interviene en la
generación de proteínas anticoagulantes y en el control de la fibrinolisis. La
generación balanceada y precisa de trombina en el sitio del daño vascular es
el resultado de una serie ordenada de reacciones que se conocen como
coagulación.

El sistema se activa por la exposición del factor tisular expresado en la

superficie de células subendoteliales (células epiteliales, fibroblastos) y en
células intravasculares activadas por citoquinas inflamatorias(monocitos,
células endoteliales). El FT es una glicoproteína proteína integral de la
membrana que se une con el factor VII tanto en su forma activa como en su
forma inactiva. La activación del factor VII unido al FT por los factores, VII a,
IXa y Xa produce una amplificación del proceso. Los factores IX a y Xa pueden
permanecer asociados a las células que expresan el FT o difundir en la sangre
y unirse a la superficie de plaquetas cercanas que han formado el coágulo
plaquetario primario. Las plaquetas activadas exponen en su superficie
fosfolípidos aniónicos que unen los factores de la coagulación, ensamblando
complejos macromoleculares formados por enzimas, cofactores y sustratos,
determinantes para la propagación y amplificación del proceso de
coagulación, estas reacciones enzimáticas involucradas en la generación de
trombina se producen también en la superficie de otras células dañadas o
estimuladas por citoquinas inflamatorias, como las células endoteliales,
monocitos, células tumorales, además de las plaquetas.

La protrombina o factor II, es activada a trombina (II a) por el complejo

protrombinasa que está formado por el factor Xa, su cofactor el factor Va,
calcio y fosfolípidos de la plaqueta activada. El factor V es activado por el
factor Xa sobre los fosfolípidos y por la trombina, tanto en solución como
unido a fosfolípidos.

La trombina amplifica el sistema por la activación no sólo del factor V sino

también de los factores VIII y XI. El factor VIII circula unido al factor von
Willebrand (fvW) que es una importante proteína adhesiva que permite la
interacción de las plaquetas con el tejido subendotelial a través de la unión con
el receptor plaquetario Ib/XI/V y con otras plaquetas mediante la interacción
con el receptor IIb/IIIa.. Después de la activación el factor VIII a se disocia del
fvW y forma un complejo sobre la superficie plaquetaria con el factor
IXa(tenasa) que activa al factor X.. La activación del factor XI a factor XI a por
la trombina es otro mecanismo de amplificación que produce cantidades
mayores de factor IXa, que activan al factor X.
La iniciación de la coagulación por la exposición del FT es la conocida vía
extrínseca y es el mecanismo por el que la coagulación es iniciada en
respuesta a un trauma. La vía intrínseca es un mecanismo alternativo por el
cual la coagulación puede desencadenarse. Esta involucra un grupo de
proteínas: el factor XII, el kininógeno de alto peso molecular, la precalicreina
y el factor XI. El rol fisiológico no es bien conocido pero no es importante en
la coagulación iniciada por traumas de los vasos sanguíneos.

El fibrinógeno es el precursor de una proteína estructural, la fibrina. La

molécula está formada por un grupo duplicado de 3 cadenas polipeptídicas
unidas por puentes disulfuro(A, B y ). La trombina corta los enlaces en
las uniones A- y B- y libera los fibrinopéptidos A y B de la molécula nativa
que forma los monómeros de fibrina los que polimerizan rápidamente
formando una red o malla de fibrina que envuelve el tapón plaquetario.

La generación máxima de trombina se produce después de la formación del

coágulo de fibrina. Esta trombina es importante para la generación adicional
de fibrina y para la activación del factor XIII(XIII a) y del inhibidor de la
fibrinolisis activado por la trombina.

Las enzimas y sustratos que intervienen en este proceso son proteínas

dependientes de la vitamina K. Estas proteínas sufren un proceso de
carboxilación postraduccional, en la posición gamma de los residuos de ácido
glutámico localizados en el extremo aminoterminal. Está reacción es
catalizada por una enzima carboxilasa del retículo endoplasmático que
requiere de la vitamina K reducida (KH2) como cofactor. Estos residuos son
necesarios para la unión con el calcio de estas proteínas, lo que produce un
cambio conformacional de las mismas que permite su unión a los fosfolípidos
de las membranas para formar los complejos coagulantes. La inhibición de la
reacción de gammacarboxilación por medicamentos antagonistas de la
vitamina K resulta en una pérdida de la función coagulante de estos factores,
al perder su capacidad de unirse en complejos a las membranas fosfolipídicas.
Esta es la base molecular del tratamiento con anticoagulantes orales
(Warfarina, Acenocumarol, etc.)

La coagulación es regulada por inhibición de las enzimas o por modulación de

la actividad de los cofactores.
El inhibidor de la vía del factor tisular inhibe las reacciones donde intervienen
el factor tisular y el factor VIIa. El inhibidor tiene un mecanismo complejo,
primero se une al factor Xa y después al VIIa en su complejo con el FT.

Muchas de las enzimas que se producen durante el proceso de la coagulación

son inhibidas por un inhibidor de serina proteasas (serpin) llamado
antitrombina, que se une al centro activo de la enzima y facilita su
eliminación. La antitrombina es solo, un débil inhibidor de las enzimas pero la
heparina y las sustancias tipo heparina que están presentes en las células
endoteliales estimulan su actividad. Este mecanismo es la base molecular para
el uso de la heparina como anticoagulante terapeútico.

El sistema anticoagulante de la proteína C regula la coagulación modulando la

actividad de los cofactores VIIIa y Va. La proteína C es la forma inactiva de
una enzima proteasa dependiente de la vitamina K. Es activada sobre la
superficie de las células endoteliales intactas por la trombina unida a una
proteína integral llamada trombomodulina(TM). La trombina tiene por tanto la
capacidad de expresar una actividad coagulante cuando está circulando y
anticoagulante cuando está unida a las células endoteliales. En la zona de
daño vascular la trombina está en forma libre y expresa su acción
procoagulante mientras que en el sistema vascular intacto la trombina
generada se une a la TM y funciona como anticoagulante activando a la
proteína C. En las células endoteliales de los grandes vasos existe un receptor
endotelial de la proteína C que tiene como función principal facilitar la
activación de la proteína C por el complejo trombina-trombomodulina donde
la concentración de TM es baja. La proteína C puede cortar los cofactores V a
y VIIIa unidos a los complejos sobre las membranas fosfolipídicas, lo que
resulta en una inhibición del sistema de la coagulación activado. Una proteína
cofactor dependiente de la vitamina K, la proteína S, determina la actividad
anticoagulantre de la proteína C activada (PCA). La proteína S se encuentra en
el plasma en dos formas, un 30% está libre y el resto esta unida a la proteína
que une C4b. La PCA y la proteína S libre forman un complejo que corta e
inhibe a los cofactores VIIIa y Va, aún cuando estén unidos a los complejos
tenasa y protrombinasa.

Fibrinolisis.
El coágulo formado cuando se produce la lesión vascular debe ser eliminado
después que se repara la pared del vaso, este proceso es llamado fibrinolisis.
El sistema fibrinolítico o sistema del plasminógeno está formado por un grupo
de proteínas proteasas serina en forma inactiva (plasminógeno y activadores
del plasminógeno), por inhibidores de proteasas serina(serpin) y por
receptores celulares
La plasmina es una enzima proteolítica, que corta una serie de uniones en la
malla de fibrina, produciendo unos fragmentos llamados los productos de
degradación de la fibrina (pdf). Esta es la enzima clave en este proceso, al
igual que la trombina lo es, en el proceso de la coagulación. Varios
mecanismos conducen a su formación.

Los factores de la vía intrínseca de la coagulación o factores de contacto (XII a,

Kalicreina, XIa,) convierten el plasminogéno que es la forma inactiva en su
forma activa la plasmina, esta es la llamada vía intrínseca del sistema del
plasminógeno.

La activación extrínseca la realiza el activador tisular del plasminógeno (t-

AP), una enzima que se une a la fibrina formada y produce la activación del
plasminógeno. Esta conversión se produce sólo de forma eficiente sobre la
fibrina formada.

El activador del plasminógeno tipo uroquinasa(u-AP) y su precursor de simple

cadena participan también en la generación de plasmina, en un proceso
directamente vinculado con las células. El u-AP y su precursor tienen un
receptor celular que se expresa en las membranas de diferentes tipos de células
(células endoteliales, fibroblastos, monocitos, plaquetas, células tumorales), y
facilita la activación del plasminógeno unido a las mismas.

Existen activadores exogénos como la estreptoquinasa, la estreptoquinasa

recombinante, el complejo acilado estreptoquinasa-plasminógeno, la
estafiloquinasa y diferentes formas recombinantes del t-AP y del u-AP, que se
uitlizan para producir una fibrinolisis terapeútica durante procesos
tromboembólicos arteriales y venosos.

La inhibición y regulación del sistema fibrinolítico se produce a diferentes

niveles. La alfa 2 antiplasmina inhibe directamente a la plasmina formada, los
inhibidores del activador del plasminógeno(PAI) inhiben el t-AP y u-AP. El
inhibidor de la fibrinolisis activable por la trombina (IFAT), elimina residuos
de lisina del extremo carboxilo terminal de las moléculas de fibrina e impide
la unión de t-AP y plasminógeno sobre la malla de fibrina.

Conclusiones:
El sistema hemostático en el que participan componentes celulares y proteínas
plasmáticas solubles, mantiene la sangre en su estado fluido y detiene la
pérdida de la misma cuando se lesiona la pared vascular. Cuando se pierde la
integridad del endotelio vascular, las plaquetas se adhieren al subendotelio
expuesto, se activan, agregan y generan el trombo primario, además permiten
el ensamblaje de complejos enzimáticos que intervienen directamente en la
generación de trombina. La formación de trombina es resultado, de la unión
del factor VII activado con el factor tisular expuesto en la membrana de
células subendoteliales y extravasculares. La trombina generada en estas
condiciones corta el fibrinógeno en el plasma formando monómeros de fibrina
que por un proceso de polimerización y estabilización dan origen al trombo
secundario, que involucra al trombo plaquetario. Este proceso es regulado por
un grupo de mecanismos naturales, antitrombinas, proteína C activada e
inhibidor del factor tisular, que inactivan o inhiben diferentes elementos
coagulantes. Finalmente, la plasmina formada por diferentes vías produce la
destrucción del coágulo y facilita la reparación tisular.

Evaluación: Cuestionario:
1)Diga la estructura y función de las plaquetas en la hemostasia.
2)Explique las vías intrínsecas, extrínsecas y común del mecanismo de la
coagulación.
3)Cómo se produce la regulación de la hemostasia?
4)Cuál es el papel de la fibrinolisis?
5) A qué se denominan factores vitamina K dependientes?
 Tema 2: El Coagulograma
Objetivo:

1) Interpretar el fundamento y los resultados de las técnicas incluidas en el

coagulograma completo, así como adquirir las habilidades prácticas en
la realización de las técnicas.
2) Correlacionar las pruebas de laboratorio para explorar la hemostasia
primaria y los desordenes de la misma.

Introducción:

Estudios de laboratorio para explorar la hemostasia.

Para estudiar la hemostasia existen diferentes pruebas, unas exploran la

integridad del sistema y nos orientan hacia un tipo de trastorno, estas son las
pruebas globales o de orientación las cuales pueden ser afectadas por varios
factores dentro de cada fase: hemostasia primaria, hemostasia secundaria y
fibrinolisis, y por tanto aportan una información general y poco específica.
Otras definen el sitio afectado, estas son pruebas que confirman o
diagnostican al medir de forma específica un componente del sistema
hemostático.
Nos referiremos a las pruebas de orientación.
A. Pruebas de laboratorio que exploran la hemostasia primaria.
Las pruebas de orientación para estudiar la hemostasia primaria son:
a) Resistencia capilar.
b) Tiempo de sangramiento.
c) Retracción del coágulo.
d) Cuenta de plaquetas.
e) Evaluación de las plaquetas en lámina periférica.

a) Estudios de resistencia capilar. Método del Lazo o Rumpel Leede. Se

somete el sistema vascular en una zona específica a una presión positiva
(Esfigmomanómetro) o negativa (Ventosa), produciendo estasis o
succión durante un periodo de tiempo y se cuentan el número de
petequias que aparecen. Esta prueba es positiva en las púrpuras
vasculares o angiopáticas, un grupo de enfermedades que se
caracterizan por manifestaciones hemorrágicas por trastornos vasculares
sin alteraciones de las plaquetas o de los mecanismos de la coagulación
 o fibrinolisis, también es positiva en trombocitopenias severas y
trombopatías.
b) Tiempo de sangramiento. Método de Ivy. Se mide el tiempo de
sangramiento desde que se realiza una herida estándar en la piel del
antebrazo hasta que se detiene la hemorragia, previamente se
incrementa la presión vascular a un valor de 40 mm de Hg en el adulto
utilizando un esfigmomanómetro,. Es una prueba muy útil para estudiar
pacientes con sospecha de trastornos plaquetarios o del factor vW. Su
normalidad no excluye alteraciones de la hemostasia primaria. No es
una prueba útil para evaluar el riesgo de sangramiento quirúrgico en
pacientes asintomáticos. Con frecuencia se realiza también por el
método de Duke.
c) Retracción del coágulo. La acción combinada de las plaquetas y la
malla de fibrina producen la formación de un coágulo retráctil. Cuando
el número de plaquetas o su función están disminuidos o existen
trastornos cualitativos o cuantitativos del fibrinógeno, la sangre total sin
anticoagulante gelifica en un coágulo cuya capacidad de contraerse esta
disminuida.
d) Cuenta de plaquetas. El número de plaquetas se mide en sangre total
anticoagulada, se utilizan como anticoagulante sal disódica, dipotásica
o tripotásica del ácido etilendiamino tetraácetico (EDTA) a una
concentración de 1,5mg/ml de sangre o montadas con sangre capilar.
Las plaquetas se pueden medir manualmente utilizando una cámara
contadora de células con rayado de Neubauer modificado en un
microscopio de contraste de fases, o en un microscopio de campo
brillante, previa dilución de la sangre 1/100 en oxalato de amonio al
1%, se llena la cámara y después de un tiempo en reposo, se realiza la
cuenta de las células en los cuadrados centrales de ambos lados de la
cámara. El número total de células contadas se divide entre 2 y el
resultado es el número de plaquetas X 10 9/L. Las plaquetas también se
miden con equipos semiautomáticos o automáticos (contadores de
células). El número de plaquetas oscila normalmente entre 150 y 450 X
109/L. Su incremento es nombrado trombocitosis y su disminución
trombocitopenia.
e) Evaluación de las plaquetas en una lámina periférica. En la lámina
périferica es necesario evaluar cualquier alteración cuantitativa de las
plaquetas detectada por una cuenta manual o automatizada. Además el
estudio morfológico permite detectar anomalías de la forma y el tamaño
de las plaquetas, de los gránulos o de otras células de la sangre que
orientan hacia una enfermedad específica. (ver capítulo de hemostasia
normal).
B. Pruebas de Orientación que exploran la hemostasia secundaria.

a) Tiempo de tromboplastina parcial activado.

b) Tiempo de protrombina.
c) Tiempo de trombina.

a) Tiempo de protrombina. Evalúa la función de los factores de la vía

extrínseca (VII, X, V y II y fibrinógeno). Al PPP descalcificado se le
adiciona tromboplastina (factor tisular) y cloruro de calcio, midiéndose
el tiempo en que se forma el coágulo. Esta prueba se utiliza además
para controlar el rango terapéutico y la dosis de anticoagulantes orales,
los anticoagulante orales. interfieren la formación de vitamina K en su
forma activa y disminuyen los niveles funcionales y antigénicos de los
factores de la coagulación II, VII, IX y X. Para utilizar esta prueba con
este objetivo se utiliza un reactivo (tromboplastina) calibrado, el
proceso de calibración conlleva la determinación del índice de
sensibilidad internacional (ISI) de la tromboplastina, utilizando un
reactivo de referencia. El resultado del TP del paciente se expresa en la
razón internacional normalizada (INR), mediante la relación entre el TP
del paciente en segundos (TPP)y el TP medio de treinta plasmas
normales (MNPT), y utilizando como exponente el ISI del reactivo
utilizado (TPP/MNPT)ISI. El resultado en INR disminuye las variaciones
que se producen por las diferentes sensibilidades de las tromboplastinas
al déficit de los factores y facilita la interpretación de los resultados
obtenidos con diferentes reactivos y en diferentes laboratorios, todo ello
permite un adecuado control analítico del rango terapeútico de los
pacientes tratados con anticoagulantes orales. El TP para estudiar
factores en otras situaciones clínicas, se utiliza expresando los
resultados, en segundos, en % o en la razón entre el TPP y el TP de un
control (mezcla de plasmas normales).
b) Tiempo de tromboplastina parcial activado. Evalúa los factores de la vía
intrínseca y común (XII, XI, precalicreina, kininógeno de alto peso
molecular, IX, VIII, X, V, II y fibrinógeno). Es especialmente sensible
para los factores VIII y IX. A un PPP descalcificado se le adicionan
fosfolípidos (cefalina), un activador de los factores de contacto (caolín,
ácido elágico o celite) y cloruro de calcio, midiéndose el tiempo en que
el plasma coagula, lo cual es expresión de la función de los factores
involucrados. En un adulto el tiempo en segundo esta entre 20-45
segundos. Es el método utilizado para controlar el rango terapéutico de
las heparinas no fraccionadas.
 c) Tiempo de trombina. La adición de trombina a un PPP descalcificado
evalúa la función del fibrinógeno y la presencia de inhibidores de la
fibrina y tipo heparinas.
Los resultados que se obtienen con las pruebas de orientación determinan los
siguientes estudios a realizar. Utilizando estas pruebas generales, diferentes
esquemas de aproximación al diagnóstico se pueden seguir.
Si el TS está prolongado y la cuenta de plaquetas es normal deben estudiarse
como posibles causas la enfermedad de vW, trombopatías y púrpuras vascular,
si las plaquetas están disminuidas se evalúa la producción y la sobrevida de las
plaquetas.
Cuando el TTPA está prolongado y el resto de los estudios son normales está
indicado repetir el estudio mezclando a partes iguales el plasma problema (PP)
con plasma normal (PN) y evaluar entonces factores o inhibidores según los
resultados. Si sólo el TP está prolongado se sigue el mismo esquema que para
el TTPA pero con el TP, repitiéndose el estudio con mezclas PP-PN. Cuando
se tienen alteraciones en el TTPA y en el TP, las causas pueden ser variadas, lo
más frecuente es la deficiencia por consumo de factores como se observa en la
coagulación intravascular diseminada y en enfermedades hepáticas.

4. Las alteraciones del TT orientan como causas más posibles de los

problemas hemorrágicos: hipofibrinogemias, inhibidores tipo herparinas u
otros inhibidores

TIEMPO DE PROTROMBINA
Principio: Cuando a un plasma obtenido de sangre venosa utilizando citrato de
sodio como anticoagulante le agregamos un exceso de tromboplastina (extracto
tisular rico en factor tisular) y lo recalcificamos, el tiempo que demora en
producirse el coágulo lo podemos tomar como índice de la concentración de los
factores que intervienen en la fase extrínseca de la coagulación (I,II,V,VII,X).
La protrombina también llamada factor II se sintetiza en el hígado siendo uno
de los factores vitamina K dependiente. Los anticoagulantes orales inhiben la
producción de los factores dependientes de la vitamina K (II,VII,IX,X). Esta
prueba es más sensible a los defectos de los factores VII, X y V que a la
deficiencia del factor II. El método no detecta disminuciones moderadas de
fibrinógeno.

Objetivos: Medir la fase extrínseca de la coagulación sanguínea.

Instrumentos:

 Tubos de vidrio 10x75.

  Baño Termostatizado
 Cronómetros
 Pipetas mecánicas de 100 L y puntas.
Reactivos:
 Citrato de Trisódico pentahidratado al 3.8% o dihidratado al
3.2%(0.109M)
 Cloruro de calcio 0,025 M
 Tromboplastina tisular de cerebro de conejo, humano, bovina, placenta,
etc

Toma de muestra: Se prepara una dilución 1:10 de la sangre venosa con Citrato
de Sodio. Para ello se adicionan: 1ml del anticoagulante y 9ml de sangre
venosa en un tubo de plástico o de vidrio siliconizado, se cierra con una tapón
de goma o plástico, se mezcla suavemente por inversión (5 veces) y se
centrifuga a 3,500rpm, durante 20 minutos. El plasma pobre en plaquetas
obtenido debe ser procesado antes de las 2 horas.

Procedimiento
En un tubo de vidrio (10x75) previamente calentado a 37oC en el baño
termostatizado añadir:
 0,1ml de plasma pobre en plaquetas
 0,1ml de tromboplastina, esperar 60 seg. Mantener el tubo dentro del agua a
37oC.
 0.1ml de CaCL2 (0.025M)

Sincronizadamente con la adición del Calcio y con el tubo dentro del baño,
echar a andar el cronómetro y esperar 8 seg. La temperatura del baño debe
mantenerse en 37oC. Sacar el tubo del baño, inclinarlo en un ángulo de 60
grados a la altura de los ojos y realizando un movimiento de agitación
constante mirar la formación del coágulo. Cuando se forma el coágulo, el
plasma pasa del estado liquido a un gel y se detiene el movimiento del plasma
con los reactivos dentro del tubo de vidrio, en este momento se detiene el
cronometro y el tiempo registrado en segundos es el tiempo de protrombina.
De control se utiliza pool de plasmas.

Intervalo de referencia:
Hasta 3seg por encima del control. El tiempo promedio normal está entre 11 y
13 seg.

Interpretación de los resultados:

 Los resultados pueden expresarse de distintas formas.
1)Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en segundos. Es la forma descrita
anteriormente, que se utiliza para medir la concentración funcional de los factores
de la vía extrínseca de la coagulación.

2)Porcentaje de Actividad Protrombínica respecto de un plasma normal (100% de

Actividad ), para ello se debe trazar la curva de actividad protrombínica de un pool
de plasmas frescos normales.

Curva de Calibración:
En tubos de cristal preparar 5 diluciones (cada una por duplicado) de un pool
de por lo menos 3 plasmas normales, según:

 Diluciones 1/1 1/2 1/3 1/4 1/8

 Porcentaje de
100% 50% 33.3% 25% 12.5%
actividad
 Pool de plasmas
0.5ml 0.3ml 0.3ml 0.2ml 0.2ml
normales
 Solución
- 0.3ml 0.6ml 0.6ml 1.4ml
Fisiológica

Determinar el TP para cada dilución empleando el procedimiento descrito.

En un papel milimetrado graficar los resultados en un sistema de coordenadas.
Colocar los TP en segundos sobre el eje de las ordenadas y los porcentajes de
actividad protrombínica en el eje de las abscisas.
Cada laboratorio debe trazar su propia curva de calibración correspondiente al
lote de reactivos en uso. Repetir con cada nuevo lote de reactivos.
Habitualmente no se utiliza en Cuba.

3. Índice de Sensibilidad Internacional (ISI). La pendiente de una recta

obtenida al analizar estadísticamente mediante una regresión ortogonal los
resultados de los tiempos de protrombina de 60 pacientes anticoagulados y 20
plasmas controles normales con una tromboplastina de referencia internacional
y con la tromboplastina de trabajo, empleando un protocolo bien establecidos,
se denomina, Índice de Sensibilidad Internacional(ISI). Este ISI nos permite
estandarizar los resultados obtenidos en pacientes anticoagulados
independientemente del uso de diferentes tromboplastinas y sistemas analíticos
mediante:
 Razón Internacional Normalizada (INR).
La OMS ha recomendado el uso de INR para el monitoreo del tratamiento con
medicamentos anticoagulantes orales, para que resulten comparables los datos
obtenidos en distintos laboratorios y con tromboplastinas de distintos orígenes.

La conversión del TP en segundos a INR se realiza mediante la siguiente

formula:

INR= R ISI
R= TP del paciente
MNPT

MNPT. TP medio normal en segundos de 30 controles normales.

TP del paciente y del control normal deben ser determinados con la misma
tromboplastina.

Variaciones fisiopatológicas.

Esta prueba se ve alterada en pacientes que presentan:

Déficit severo de los factores II, VII, V, X y I de las vías extrínseca y
común de la coagulación.
Inhibidores especificos o de interferencia.
Tratamiento con anticoagulantes orales.

Control de calidad.

 Uso de plasmas controles normales y anormales.

 Muestras por duplicados. Se acepta menos de un 5% de diferencia entre
los duplicados.
 Control de estricto de los procesos preanaalítico, analítico y
postanalítico. Toma de muestra de sangre venosa con jeringuilla de
plástico o siliconizada, aguja de 1 pulgada y diámetro 19 0 20, realizar
una punción limpia, no utilizar torniquete. Evitar la hemólisis de las
muestras. Tubos, pipetas, puntas, bien limpios (no utilizar detergentes en
la limpieza de los mismos). Baño de agua a 37oC con el agua limpia
(utilizar agua desionizada y cambiarla diariamente). Los tubos deben
estar sumergidos en el agua del baño termostatizado hasta la mitad de su
longitud; unos 3cm, mientras se realizan las pruebas. Pipetas bien
calibradas. Reactivos bien preparados y conservados. Cronómetros bien
 calibrados. Fuente de luz adecuada para observar la formación del
coágulo.
 Los plasmas deben ser procesados antes de 4 horas, después de obtenidas
la muestras.
 No guardar las muestras en refrigeración.
 Los reactivos de uso deben ponerse a 37oC antes de la prueba y
conservarse no más de 24 horas después de utilizada en refrigeración.
Solo debe calentarse la cantidad que se utilizará, el resto del reactivo se
mantiene en refrigeración por el tiempo especificado anteriormente.

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA CON

KAOLIN

Principio: Al poner en contacto un plasma pobre en plaquetas (obtenido con

citrato de sodio como anticoagulante) y un reactivo activador del factor XII
(polvo de Caolín, ácido elágico, celite) se inicia la vía intrínseca de la
coagulación, en presencia de fosfolípidos (cefalina), sistema amortiguador de
pH y Cloruro de Calcio se van activando los diferentes factores y cofactores,
culminando con la formación de trombina, la conversión del fibrinógeno en
fibrina y la formación de un coágulo, el tiempo transcurrido para ello depende
de la concentración y función de los factores que intervienen en esta fase
intrínseca de la coagulación que son: XII,XI,IX,VIII,V , I,II, Kalicreinas y
Kininógeno de alto peso molecular (KAPM,HMWK).

Instrumental:

 Tubos de vidrio(10x75mm).
 Baño Termostatizado.
 Cronómetros.
 Pipeta mecánica de 100 y/o 200L

Reactivos:

a) Buffer Imidazol pH 7,35(Regulador de pH)

b) Cefalina (como aporte de fosfolípidos)
c) Calcio en H20 0.025M
d) Caolín 40mg/ml
- Mezcla cefalina-Imidazol

Hacer la dilución según la concentración de la cefalina.

Ej. si es 1:200 se hace la siguiente dilución
Cefalina-------- 0,02ml
Buffer Imidazol- 4 ml

Según la titulación: Cuando se diluye con Caolín se debe echar el doble de

cefalina 0.01ml de cefalina. Hacer una mezcla a partes iguales de cefalina-
imidazol y Caolín 40 mg/ml y poner en baño de María a 37oC.
Preparar diariamente, no debe tener más de 20 horas de hecha la preparación.

Procedimiento:
En tubo de ensayo de 10x75mm previamente calentado a 37oC en un baño de
agua termostatizado se adicionan:
- 0.1ml de la mezcla cefalina imidazol-kaolin.
- 0.1ml de plasma del paciente.
- Poner en marcha el cronometro esperando 4 min. agitando la mezcla cada 30
seg.
- Parar el cronometro al cabo de los 4min y añadir.
- 0.1ml de calcio 0.025M.
- Esperar 30seg en la temperatura indicada agitando.
- Observar la formación del coagulo al cabo de 30seg cada 5 seg y detener el
cronometro cuando esta sea detectada.

Intervalo de Referencia: Se deben obtener para cada laboratorio, generalmente

esta entre 30 y 60seg

Método Modificado.
Reactivos.

 Cefalina-Imidazol-Kaolin: Un volumen de 3.75ml de una mezcla de

Kaolin al 0.5% diluido en una solución amortiguadora Imidazol-salino +
50 microlitro de cefalina. La cantidad de cefalina que se utiliza puede
variar según los valores normales de TTPA, habitualmente está entre los
20 y 30uL de cefalina para 3,75ml de la mezcla de imidazol- salina-
kaolin.

Buffer Imidazol Salina-Kaolin.

25 ml del stock de buffer imidazol

18.6 ml de HCl 0,1 N
Completar a 100 con solución salina
Adicionar 0,5g de Kaolin
Para preparar 500 ml
125 ml del stock de buffeer Imidazol
93 de HCl 0.1 N
Completar a 500 ml de solución salina.
Adicionar 2.5 g de Kaolin

Técnica.
En tubo de ensayo de 10x75mm previamente calentado a 37oC en un baño de
agua termostatizado se adicionan:
-0,1 ml de plasma pobre en plaquetas
-0,1 ml de la mezcla cefalina-imidazol-caolin.
Incubar 4 minutos a 37oC, agitando cada 30 seg.
-0,1 ml de CL2Ca 0,025 M. Simultáneamente activar el cronometro y agitando
a intervalos de 5seg medir el tiempo de formación del coágulo.

Valores de referencia.
Hasta 6 segundos por encima del control-normal
De 6 a 10 segundos por encima del control-dudoso
10 seg por encima del control-anormal

Variaciones Fisiopatológicas.
Deficiencia de los factores y cofactores de las vías intrínseca y/o común( VIII,
IX,XI, XII, Precalicreina o Factor Fletcher, Kininógenos de alto peso molecular
o factor Fitzgerald, X,V,II y I)
Afribinogenemia.
Anticoagulantes circulantes tipo heparinoides, contra un factor o
Anticoagulantes Lúpicos.
Tratamientos con Heparinas no fraccionadas.

Control de calidad.
Igual que en el TP.

Conclusiones:
Las pruebas de laboratorio para estudiar enfermedades que alteran la
hemostasia de forma primaria o secundaria son múltiples y de gran
importancia para el diagnóstico, seguimiento y control de tratamientos. Las
pruebas básicas del coagulograma, el tiempo de sangramiento, la cuenta de
plaquetas, el tiempo de protrombina, el tiempo de tromboplastina parcial y el
tiempo de trombina son pruebas de orientación que permiten estudiar
integralmente los diferentes componentes y compartimentos de la hemostasia,
mientras que las pruebas especiales nos ayudan en la evaluación de forma
selectiva y específica de posibles factores o elementos afectados.
Para estudiar los trastornos de la hemostasia es necesario además de
comprender la fisiología y fisiopatología del sistema, conocer algunos
aspectos básicos sobre las pruebas de laboratorio como son: factores
preanalíticos que influyen en los resultados, el fundamento de las principales
pruebas y diferentes estrategias que podemos utilizar para explorar
adecuadamente al paciente y obtener la información deseada en el momento
necesario.

Evaluación:
Se realizará un seminario en forma de exposición donde el alumno expondrá
el fundamento de las técnicas que se incluyen en el coagulograma completo, el
procedimiento técnico, valores de referencia, variaciones fisiopatológicas y
fuentes de error.
 Tema 3: Control de la calidad en Hemostasia
Objetivos:
1) Identificar e interpretar cómo se realiza el control de calidad en
las pruebas de hemostasia, teniendo en cuenta las fases
preanalítica, analítica y postanalítica.

Introducción:

Los estudios de la hemostasia se realizan en muestras de sangre

anticoaguladas con citrato de sodio a una concentración de 0.109M, excepto
para las pruebas de función plaquetaria donde se recomienda una
concentración de 0.129M. La relación anticoagulante sangre es de 9 partes de
sangre y 1 parte de anticoagulante.
La sangre debe ser obtenida directamente de una vena con jeringuilla plástica.
Se recomienda que la sangre para estudios de la hemostasia sea obtenida en el
proceso de extracción utilizando una segunda jeringuilla. Es importante
producir el mínimo de estasis venoso durante el proceso o sea utilizar sólo el
torniquete para puncionar la vena o no utilizarlo si fuera posible.
Los materiales utilizados para realizar las pruebas, tubos, pipetas, etc. deben
ser inertes para la activación de la hemostasia, se recomiendan plástico o
vidrio recubierto con silicona. Las pruebas generalmente se realizan sobre la
sangre total o sobre plasma, este puede ser rico en plaquetas (PRP) o pobre en
plaquetas (PPP), para lo que la sangre se centrifuga a bajas revoluciones por
minuto por corto tiempo para el primero y a elevadas revoluciones por mayor
tiempo para obtener el segundo. La centrifugación debe realizarse
rápidamente (antes de la hora de extraída la muestra) y los tubos deben estar
tapados hasta que la muestra sea analizada. El PPP se puede conservar de
forma general por periodos largos a –20ºC.
En los resultados de estos exámenes influyen muchos factores preanalíticas
además de los mencionados. El tiempo desde que se extrae la muestra hasta
que se centrifuga y hasta que se realiza la prueba, la temperatura de
conservación, medicamentos que interfieren o afectan diferentes pruebas.

Contenido:
FASE PREANALITICA
Los objetivos de las normas de control de la calidad en la fase preanalítica
son, fundamentalmente, tres: la correcta identificación de paciente, solicitante
y pruebas solicitadas; reducir al máximo la variabilidad intraindividual de los
parámetros a medir; evitar el deterioro del espécimen a través de los procesos
de obtención, manipulación, transporte y conservación.
Correcta identificación de paciente, solicitante y pruebas solicitadas:
Aunque el primer objetivo parezca obvio, también son evidentes las
consecuencias de un error a este nivel. Para cumplimentar esta área debemos
disponer de un formato de petición específico, en el que, aparte de su nombre
y apellidos, se identificará de forma inequívoca a cada paciente mediante su
número de historia u otro dato numérico, (dos pacientes pueden tener iguales
nombre y apellidos), así como al facultativo solicitante.
Reducir la variabilidad intraindividual
La variabilidad intraindividual de cualquier parámetro a medir no puede ser
eliminada totalmente, ya que el paciente es un ser vivo, pero se puede
minimizar si controlamos las causas endógenas y exógenas que la
incrementan.
Entre las causas endógenas la principal son los ciclos hormonales (ritmos
circadianos) que modifican los niveles de un parámetro a lo largo del día.
Especial importancia tiene este factor en el estudio de los componentes del
sistema fibrinolítico. Habitualmente realizaremos la extracción del espécimen
en las primeras horas de la mañana y recordaremos la importancia de este
punto cuando, por conveniencia administrativa, se plantee la posibilidad de
varios horarios de extracción a lo largo del día.
Las causas exógenas incluyen principalmente el ejercicio físico, especialmente
importante cuando vamos a medir reactantes, como factor VIII o factor von
Willebrand, y la ingestión de alimentos que, a la vez, puede representar una
interferencia en la fase analítica por enturbiar en plasma.
Obtención, manipulación, transporte y conservación del espécimen:
En cuanto a la obtención de la muestra es importante recordar: No prolongar
excesivamente la aplicación del torniquete. El ideal es no mantenerlo más de
un minuto y utilizarlo para la punción venosa pero no durante la toma de la
sangre.
Los tubos destinados a las pruebas de coagulación deben llenarse después de
los destinados a otras pruebas. Una excepción sería la determinación del
tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) en pacientes tratados con
heparina, que es un 20% más corto en el primer tubo que en el segundo.
Los tubos destinados a estudios de coagulación deben obtenerse por punción
venosa, no aprovechando catéteres posiblemente contaminados con heparina
Por último, cuando sea necesario el transporte del tubo desde el centro de
extracción hasta el laboratorio, se evitarán la agitación brusca, que puede
provocar hemólisis y las temperaturas elevadas. También se tendrán en cuenta
los plazos de conservación antes señalados.
FASE ANALITICA
La garantía de calidad en la fase analítica está dirigida a reducir la imprecisión
o error aleatorio y la inexactitud o error sistemático de las determinaciones.
Los términos imprecisión e inexactitud no son en absoluto equivalentes.
La imprecisión o error aleatorio representa el grado de discordancia entre
medidas repetitivas de un mismo espécimen, con independencia de su
proximidad al valor verdadero. Para luchar contra ella utilizaremos métodos
analíticos, aparatos y reactivos de calidad contrastada y se cuidarán los
aspectos técnicos del proceso analítico. Para valorar su magnitud utilizaremos
el control de la calidad interno.
La inexactitud o error sistemático es el grado de discordancia entre nuestro
resultado y el valor verdadero. Para prevenirla o reducirla se requiere una
correcta calibración de la técnica. Su importancia se valora mediante los
programas de evaluación externa de la calidad.
FASE POSTANALITICA
Los elementos más importantes son la ausencia de demora en la entrega del
resultado y la calidad informativa del formato de éste, tanto para el paciente
como para otros facultativos que puedan atenderle. Otro punto importante es
disponer de un sistema de almacenamiento adecuado.
Conclusiones:
Varios factores deben ser tenidos en consideración, cuando se va ha realizar un
estudio de la hemostasia. Existen recomendaciones internacionales para
estandarizar todos estos factores de forma que, las influencias sobre los
componentes de la hemostasia que se miden, sean las más semejantes posible.

Evaluación:
Debe incluirse en el seminario del coagulograma un punto que comprenda el
control de la calidad en Hemostasia.
BIBLIOGRAFÍA BÁSICA

 Dr. Celso Cruz y colabor. Temas de Laboratorio. (Los temas de

Hematología).

BIBLIOGRAFÍA COMPLEMENTARIA

 William Platt. Atlas de hematología.

 Janet y Sonnenwirth (tomo 2). Diagnóstico Clínico por Laboratorio
(Gradwohl).
 Smith. Hematología Pediatrica.
 William Williams. Haematology.