PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACION EN BIOQUIMICA CLINICA
INSTRUMENTAL QUIMICO AVANZADO
PROFESOR: JAIME CASAS
PRESENTADO POR: HERNAN MAURICIO RIVERA ESCOBAR
INFORME Nº 1. CICLO 3

DETERMINACION FLUOROMETRICA DE FLUORESCEÍNA EN H2O

OBJETIVOS:

1. Conocer el funcionamiento de un fluorómetro de filtro.

2. Ilustrar el proceso de estandarización de un método fluorométrico
de análisis.
3. Diseñar el espectro de emisión de la fluoresceína.
4. Diseñar la curva de calibración para el sistema en estudio:
fluoresceína en H2O
5. Determinar el porcentaje m/v de fluoresceína de la muestra
problema.

1. Muchos compuestos orgánicos y algunos inorgánicos tienen la capacidad de

absorber energía radiante de una longitud de onda determinada y luego emitir
la energía como radiación a una longitud de onda mayor. Éste fenómeno se
conoce como fluorescencia y determina las bases para un instrumento analítico
muy sensible. La fluorescencia se puede medir con un instrumento simple
llamado fluorómetro, que emplea filtros para seleccionar la longitud de onda.
A continuación presento dos esquemas sencillos que representan el
funcionamiento de un espectrofluorómetro:

Diagrama 1. Esquema de un espectrofluorómetro.

 Diagrama 2. Un fluorómetro típico. (Cortesía de Farrand Optical Co., Inc.)

Mediante determinación fluorimétrica es posible determinar concentraciones de

especies orgánicas (tales como: compuestos orgánicos, enzimas, agentes
medicinales, productos naturales, esteroides y vitaminas), gracias a la alta
sensibilidad del método.

Como lo mencione anteriormente, los métodos espectrométricos de emisión

tienen sensibilidades dos o tres órdenes de magnitud superiores a los métodos
de absorción, ya que la sensibilidad de un método espectrométrico de emisión
se puede aumentar aumentando P0 mientras que en espectrofotometría de
absorción un aumento en P0 también aumenta P y no afecta A.

Ahora bien, el funcionamiento de un fluorómetro difiere en esencia mas no del

total de los componentes de un espectrofotómetro, es por esto que con
frecuencia se hace uso de un sistema espectrofotométrico múltiple y se adecua
según lo que se requiera trabajar. En un sistema como este trabajamos en el
laboratorio.

En los siguientes diagramas presento algunas generalidades en cuanto al

funcionamiento de un fluorómetro de filtro:
 Fotografía 1

En esta fotografía presento el fluorómetro con el cual se llevo a cabo la práctica

de laboratorio, aquí se relacionan de izquierda a derecha:

• El obturador encargado de dejar pasar la señal al fotomultiplicador.

• En la cabina central: el “Zero Adj” que se utiliza para ajustar el blanco
(en este caso agua) al 0% de porcentaje de fluorescencia, el slit (en
grado 3) y el selector: encargados de hacer el ajuste tanto de radio de
abertura de la rejilla como de la relación matemática del porcentaje de
emisión que se relaciona en la escala del registrador y el
monocromador cuya función es determinar la longitud de onda sobre la
cual se toman las medidas en el equipo.
• La cabina donde se colocan las muestras en celdas de cuarzo con una
perilla que permite ubicar tanto el blanco como la muestra a medir.
Detrás de la cabina se encuentra la fuente.

En las fotografías 2 y 3 se reflejan mucho mejor la cabina donde se colocan las

muestras (hasta 4) y el filtro que posee la fuente que le permite dejar pasar tan
solo las líneas del espectro del mercurio de la zona ultravioleta.
Fotografía 2

Fotografía 3
En el siguiente esquema se muestra el espectro del mercurio.

Fotografía 4.

En esta fotografía se muestra el obturador, en la parte superior se ve la perilla

que se cierra o se abre dando paso de la señal al fotomultiplicador. Ver
fotografía 5.
 Fotografía 5

En cuanto al fotomultiplicador, está conectado al obturador y tiene 2 perillas: El

grueso y el fino. El primero fundamental a la hora de proteger el equipo, se
hace recomendable antes de empezar el análisis colocar el grueso al máximo.
Y el fino que junto con el slit y el selector regulan el porcentaje de emisión.

Fotografía 6. El equipo en pleno

 Fotografía 7. El equipo casi en pleno

2. Para ilustrar el proceso de estandarización de un método fluorométrico de

análisis creo conveniente establecer momentos puntuales lo que relaciono a
continuación:

Si se desconoce la longitud de onda, se debe elaborar el espectro de emisión

de la sustancia fluorescente con la finalidad de establecer la longitud de onda
de máxima emisión. Para tal fin, se dispone de una sustancia fluorescente
promedio que está dentro de una serie de patrones de concentración
conocida. Con esta sustancia se establece un rango amplio de emisión a
diferentes longitudes de onda (lambda) y se describe el comportamiento en un
espectro de emisión (lambda vs % de fluorescencia).

Ya establecido el lambda máximo a partir del espectro de emisión se procede a

ajustar nuevamente el blanco (dependiente del solvente sobre los que se
hicieron las diluciones) se colocan uno a uno los patrones de acuerdo a su
concentración (de la menos diluida hasta la más concentrada). Se diseña la
curva de calibración para el sistema en estudio y se determina la concentración
de la muestra problema por extrapolación.

Con respecto a la curva de calibración, existe la probabilidad de que los

patrones no entren en la linealidad de la zona 1 de la curva. Si los valores a
extrapolar reflejan dos puntos de concentración diferente, para establecer el
punto verdadero se debe hacer dilución ½ de la muestra y volver a medir el %
de fluorescencia, este valor resultante debe ser la mitad del inicial puesto que
la relación entre el % de fluorescencia y la concentración es directamente
proporcional. En dado caso que este valor no sea la mitad de la muestra
concentrada se deben establecer diluciones tantas cuantas sean necesarias
hasta que se relacionan de manera directamente proporcional la concentración
y el % de fluorescencia.

Establecida la curva de calibración con los patrones de concentración conocida

es posible hacer la extrapolación de la muestra problema, dicha concentración
debe ser cotejada con la arrojada por la ecuación de la recta y adecuada con
los inversos del factor de dilución (si los hay).

3. Espectro de emisión de la fluoresceína

Lambda % Fluorescencia Valor relativo de % de Fluorescencia

400 0 0
410 0 0
420 1 0,952380952
430 1 0,952380952
440 1 0,952380952
450 1 0,952380952
460 1 0,952380952
470 2 1,904761905
480 7 6,666666667
490 35 33,33333333
495 62 59,04761905
500 89 84,76190476
501 93 88,57142857
502 96 91,42857143
503 99 94,28571429
504 101 96,19047619
505 102 97,14285714
506 103 98,0952381
507 103 98,0952381
508 105 100
509 104 99,04761905
510 103 98,0952381
512 98 93,33333333
515 91 86,66666667
520 77 73,33333333
530 54 51,42857143
550 32 30,47619048
570 14 13,33333333
 Espectro de Emisión de la Fluoresceína

Se estableció Máxima longitud de onda: 508 nm pero es importante anotar

que este espectro está relacionado con el % de fluorescencia relativo mas
no absoluto de la fluoresceína.

4. Curva de calibración para el sistema: fluoresceína en H2O

Cálculos en la siguiente hoja:

% de Concentración Valor relativo de % de

Muestra Fluorescencia ppm Fluorescencia
1 16 0,928 15,23809524
2 39 2,552 37,14285714
3 63 4,176 60
4 80,5 5,8 76,66666667
5 100 7,424 95,23809524
Problem
a 49 X 46,66666667
 C UR VA D E C AL IB R AC ION S IS T E MA F L UOR E S C E ÍNA E N H 2O

120
Valor R elativo % F luores c eína

100

V alor relativo de % de
80 F luores c enc ia

L ineal (V alor relativo

60 de % de
F luores c enc ia)
40

y = 12,286x + 5,551
20 R 2 = 0,9962

0
0 2 4 6 8
C onc e ntra c ión (ppm )

5. Previa a la determinación el porcentaje m/v de fluoresceína de la muestra

problema se hace la extrapolación:

Para un % de fluorescencia relativo de 46.67 el valor de concentración es:

• Si y = 12.286x + 5.551 entonces

x = y – 5.551
12.286

x = 46.67 – 5.551
12.286

x = 3.347 ppm

3.347 ppm (3.347 mg / 1000 ml) * 100

% m/v = 0.3347

El porcentaje m/v de la muestra problema es 0.3347 mg % (m/v)