Reacciones de reconocimiento de aminoácidos.

Hidrólisis de caseína y
determinación cualitativa de sus aminoácidos mediante cromatografía en papel

Jessica Guerra C.I.20.980.963, Jorge Romero C.I. 22.405.296

Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Química. Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología,
Universidad de Carabobo, Naguanagua, Venezuela

Resumen

Las proteínas son cadenas de aminoácidos que se pliegan adquiriendo una estructura
tridimensional que les permite llevar a cabo miles de funciones. Se llevó a cabo un estudio de
los aminoácidos que contiene la caseína; una proteína conjugada de la leche del tipo
fosfoproteína. Para ello, se tuvo que realizar primero una hidrolisis peptídica para poder
fragmentar y obtener aminoácidos proteicos, con el fin de realizar una cromatografía en papel,
empleando como fase móvil una solución de Fenol al 80% y así poder detectar los aminoácidos
que están presente en la caseína; en donde solamente se observó un solo compuesto siendo este
la arginina debido a que no hubo una hidrólisis total en la práctica. Por otro lado, se realizaron
diferentes pruebas cualitativas para la detección de aminoácidos utilizando diferentes
soluciones.

Abstract

The proteins are chains of amino acids that is folded acquiring a structure
three-dimensional that les allows carry to out thousands of functions. A study of amino acids
containing casein; took place a conjugated protein from the milk of the phosphoprotein type. To
do so, he had to first do hydrolysis peptide to break up and get protein amino acids, in order to
perform a chromatography paper, using a solution of phenol to 80% as mobile phase and thus
be able to detect the amino acids that are present in casein; in where only a single compound,
this being because arginine was observed that there was a total hydrolysis in practice. On the
other hand, qualitative tests for the detection of amino acids using different solutions were
performed.

INTRODUCCIÓN Las proteínas desempeñan una

variedad de funciones que van desde
Las proteínas son polipéptidos
transporte y almacenamiento de moléculas
formados por la polimerización de
pequeñas, también forman parte de la
aminoácidos unidos por medio de enlaces
organización estructural de células y
peptídicos, es decir, un enlace amida entre
tejidos. Para cumplir una variedad de
el grupo carboxilo de un aminoácido y el
funciones cada tipo de célula en cada
grupo amino de otro. Además del grupo
organismo posee miles de clases de
amino libre N-terminal y el grupo carboxilo
proteínas.
libre C-terminal los polipéptidos poseen
algunos aminoácidos con grupos ionizables Por su parte la leche tiene un alto
en sus cadenas laterales, por lo que son valor nutricional, contiene vitaminas,
excelentes ejemplos de polianfólitos minerales, proteínas (incluyendo todos los
(distintas cargas netas a diferentes pH). [1]
aminoácidos esenciales), carbohidratos y
lípidos. En la misma están presentes tres
tipos de proteínas: caseína, lacto albúminas
y lacto globulinas (proteínas globulares). La
caseína es una proteína conjugada de la
leche del tipo fosfoproteína que se separa de
la leche por acidificación y forma una masa
blanca. La caseína está formada por α (s1),
α (s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína
formando una micela o unidad soluble. Ni
la alfa ni la beta caseína son solubles en la
leche, solas o combinadas. Si se añade la
kappa caseína a las dos anteriores o a cada
una de ellas por separado se forma un
complejo de caseína que es solubilizado en
forma de micela. Esta micela está
estabilizada por la kappa caseína mientras
que las alfa y beta son fosfoproteínas que
precipitan en presencia de iones calcio.En
la caseína la mayoría de los grupos fosfato
están unidos por los grupos hidroxilo de los
aminoácidos serina y treonina, y se
encuentra en la leche en forma de sal
cálcica (caseinato cálcico), representando
cerca del 77% al 82% de las proteínas
presentes en la leche y el 2,7% en
composición de la leche líquida [2].
MATERIALES Y METODOS
 Hidrólisis y separación de
aminoácidos de la caseína
Para la hidrólisis se pesaron 0,5g de
caseína y se colocaron en un matraz para
reflujo de 100mL con 20mL de HCL al 19%,
calentando a reflujo a temperatura
moderada por 35 minutos. Luego se le
adiciono 0,5g de carbón activo a la mezcla
caliente agitando, el resultado de la
hidrólisis se filtró por gravedad en un
matraz Erlenmeyer y a pequeñas porciones
del hidrolizado se le realizaron pruebas de
Biuret para asegurar la hidrolisis completa,
al generar resultados positivos a esta
prueba se hidrolizo por 5minutos mas con
5mL de HCL al 19%, repitiendo este último
paso hasta resultado negativo de dicha
prueba.
Facultad Experimental de Ciencia y Tecnología
La separación de los aminoácidos de
la caseína se logró realizando una
cromatografía en papel, empleando como
fase móvil una solución de Fenol al 80% y
algunos aminoácidos de referencia como:
glicina, tirosina, cisteína, fenilalanina y
arginina. Se colocó en una cámara
cromatografía durante 2 horas. Para el
revelado de los aminoácidos eluidos sobre el
papel se roció con una solución de
ninhidrina formando machas coloreadas,
finalmente se tomaron las medidas de las
distancias recorridas por cada aminoácido
de referencia, los de la caseína y del
solvente.
 Prueba de Biuret
En tubos de ensayo se colocó 1mL
de soluciones de Biuret, Caseína
hidrolizada, Urea y Agua; a cada tubo se le
adicionó 1mL de NaOH al 10% y 0,5mL de
CuSO4 al 0,5%.
 Prueba de Sakaguchi
En tubos de ensayo se colocó 1mL
de soluciones de Arginina, Caseína
hidrolizada, Tirosina y agua; a cada tubo se
le adicionó 0,25mL de NaOH al 10% y
0,25mL de α-naftol al 0,05%, se dejó
reposar por 5 minutos y luego se le
adicionó 5 gotas de Hipobromito de sodio.
 Prueba Xantoproteica
En tubos de ensayo se colocó 1mL
de soluciones de Fenilalnina, Caseína
hidrolizada, Tirosina y agua; a cada tubo se
le adicionó 0,5mL de HNO3 y 2mL de
NaOH 8M.
Prueba de Acreé – Rosenheim
En tubos de ensayo se colocó 1mL
de soluciones de Triptófano, Caseína
hidrolizada, Cisteina y agua; a cada tubo se
le adicionó 0,5mL de Formaldehido y 1mL
de H2SO4 (C), y luego se colocaron los tubos
en un baño e agua hirviente.
Prueba de Sulfidación
En tubos de ensayo se colocó 1mL
de soluciones de Cisteina, Caseína
hidrolizada, Arginina y agua; a cada tubo
se le adicionó 1mL de NaOH al 10% y
0,25mL de PbNO3 al 1%, y luego se
2
colocaron los tubos en un baño e agua
hirviente.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La hidrólisis peptídica es la ruptura
de la secuencia de una proteína que
termina por fragmentarla en aminoácidos,
el método general consiste en calentarlos en
un ácido mineral fuerte (normalmente HCl
6M) [1], tal como se realizó en esta práctica
(procedimiento descrito en materiales y
métodos).
Figura 1. Hidrólisis del enlace peptídico
La hidrolisis puede ser parcial,
donde se obtienen fragmentos de péptidos y
aminoácidos aislados o total donde se
obtienen aminoácidos llamados
aminoácidos proteicos [3], se buscaba una
hidrolisis total, sin embargo no se logró
evidenciando este hecho al realizar la
prueba de Biuret (Figura 2). La hidrolisis
puede catalizarse de distintas maneras, en
medio ácido, básico o mediante enzimas
proteolíticas.
F.B. Armstrong [4] Indica que la
hidrólisis ácida supone, usualmente el
tratamiento de un polipéptido con HCl 6N a
110°C durante 24 horas, siendo estas unas
condiciones más fuertes que las empleadas
en la práctica (descritas en materiales y
métodos) y que proporcionan el tiempo para
que la hidrólisis sea efectiva.
Experimentalmente se observó en la
cromatografía en papel un solo compuesto
(una mancha morada) para el hidrolizado
de caseína, esta presencia de color es
causada por la reacción de la ninhidrina
que ocurre debido a una oxidación y
reducción intramolecular de la ninhidrina
en presencia de amoníaco [4] (figura 2).
Debido principalmente a que no hubo una
Facultad Experimental de Ciencia y Tecnología
hidrólisis total de la caseína, es posible que
solo se obtuvieran algunos aminoácidos
totalmente separados, cabe destacar que no
se contó con la mayoría de aminoácidos de
referencia y de los utilizados solo uno se
acerca al eluido en la muestra de caseína,
la Arginina, como se observa en la tabla
2.1.
Figura 2. Reacción de la Ninhidrina
Tabla 2.1 Factor de retención de
aminoácidos analizados e identificación de
aminoácido separado de la caseína
hidrolizada
Sustancia Rf (Rf ± ΔRf)
Gly 0,400 ± 0,009
Tyr 0,500 ± 0,009
Cys 0,10 ± 0,01
Phe 0,70 ± 0,01
Arg 0,300 ± 0,009
Caseína 0,300 ± 0,008
En esta práctica también se
realizaron pruebas cualitativas para
determinación de aminoácidos, una de
estas pruebas fue la de Biuret, que es una
reacción general para la identificación de
péptidos y/o proteínas. Se fundamenta en la
formación de un compuesto azul violeta por
la reacción del ión cúprico con el péptido o
proteína en medio alcalino. Este ión forma
un enlace covalente coordinado con los
enlaces peptídicos [5]. Experimentalmente
se realizó esta prueba al hidrolizado de
Caseína, que genero un resultado positivo
con coloración morada indicando la
presencia de enlaces peptídicos debido a la
reacción que se muestra en la figura 2.
3

Figura 3. Reacción de Biuret
Otras sustancias analizadas con
esta prueba fueron Biuret, Urea y agua,
donde no se observó cambios. Se podría
pensar que la Urea daría positivo para esta
prueba sin embargo al no poseer varios
enlaces peptídicos no se forma el enlace
covalente coordinado y por tanto no se
presenta el cambio de color.
Figura 4. Estructura de la Urea
La reacción de Biuret con el compuesto
Biuret (H2N-CO-NH-CO-NH2), un
compuesto formado por dos moléculas de
urea, al tener dos enlaces peptídico (figura
4) da positivo a esta prueba [5], sin embargo
experimentalmente no se observó cambios,
uno de los factores que pudo afectar fue el
pH.
Figura 5. Estructura del compuesto Biuret
La reacción de Sakaguchi es
específica para la identificación del grupo
guanidino. Se fundamenta en la
condensación del grupo guanidino con α-
naftol en un medio altamente oxidante, con
la posterior producción de un compuesto de
color rojo intenso. Esta prueba da positiva
frente a la arginina así como a las proteínas
Facultad Experimental de Ciencia y Tecnología
que contienen este aminoácido [5]. Esta
prueba se le realizó a la Tirosina y al agua
que dieron negativas ya que el aminoácido
no posee el grupo guanidino y el agua
destilada está exenta de aminoácidos y
proteínas, la prueba a la Arginina dio
positiva como era de esperarse con una
coloración roja, debido a la siguiente
reacción:
Figura 6. Reacción de Sakaguchi
Al realizar la prueba a la Caseína
hidrolizada se observó una coloración
naranja intenso, siendo este un resultado
positivo, además que comprueba que el
aminoácido identificado por cromatografía
en papel es arginina.
Otra de las pruebas realizadas fue
la Xantoproteica que permite identificar
aminoácidos que tienen anillo bencénico en
su estructura, tales como la fenilalanina o
la tirosina. En esta reacción el aminoácido
reacciona con ácido nítrico concentrado,
ocurriendo la nitración del anillo aromático
Como productos finales de la reacción se
forman nitroderivados de color amarillo. [5]
Esta prueba dio positivo para la
fenilalanina, Caseína hidrolizada y tirosina
con una coloración amarillo, ocurre de
acuerdo a la siguiente reacción:
Figura 7. Reacción Xantoproteica
La prueba de Acreé-Rosenheim se le
realizo al triptófano, Caseína hidrolizada,
cisteína y agua, y solo dio positiva para el
triptófano con la aparición de un anillo
purpura, debido a que esta reacción es
específica para él y las proteínas que las
4
contienen, se da de acuerdo a la siguiente
reacción
Figura 8. Reacción de Acreé - Rosenheim
Finalmente se realizó la prueba de
sulfidación que identifica aminoácidos
azufrados como la cisteína, metionina,
lantionina, cistina. Esta prueba se le
realizó a la cisteína que dio positiva dando
una coloración gris, positiva para esta
reacción, también se le realizo a la Caseína
hidrolizada, Arginina y agua donde no se
observó ningún cambio.
Figura 9. Reacción de Sulfidación
CONCLUSIONES
 El único aminoácido presente en la
caseína que se pudo identificar por
cromatografía en papel fue la
arginina.
 Para que la hidrolisis sea efectiva,
es recomendable dejar el
tratamiento del polipéptido con HCl
Facultad Experimental de Ciencia y Tecnología
6N por más tiempo en el equipo de
reflujo.
 Mediante pruebas cualitativas, se
puede identificar algunos
aminoácidos que estén presentes en
las proteínas por medio de las
reacciones que ocurren en cada caso
de acuerdo al radical o al grupo
presente que caracteriza al
aminoácido.
BIBLIOGRAFÍA
[1] Mathews, Christopher K. Bioquimica.
Madrid : PEARSON EDUCACION , 2002.
ISBN: 978848322690.
[2] Practica 3, Extracción de la caseina y
determinación del punto isoelectrico. [En
línea] [Citado el: 10 de Enero de 2017.]
https:/www.upo.es/depa/webdex/quimfis/doc
encia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf.
[3] [En línea] [Citado el: 8 de Marzo de
2017.]
https://es.scribd.com/doc/305009933/Hidroli
sis-de-Una-Proteina.
[4] F.B. Armstrong, Thomas Peter Bennett.
Bioquímica. s.l. : Reverte, 1982.
[5] [En línea] [Citado el: 10 de Enero de
2017.]
http/:www.fcv.luz.edu.ve/images/stories/cat
edras/bioquimica/05_reacciones_aminoácido
s_proteínas.pdf.
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Facultad Experimental de Ciencia y Tecnología
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