01 Staphylococcus

Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Químicas
Químico Farmacéutico Biólogo

Bacteriología y Micología Médica

Protocolo para la identificación de Staphylococcus en exudado

faríngeo.

Equipo:

Eduardo Esparza Huerta

Roberto Tazoty Rodríguez Rodríguez

Katia Guadalupe Contreras Herrera

Maestra: Marcela A. Luna Treviño

7mo Semestre Grupo: 01

San Nicolás de los Garza, Nuevo León.

Índice;

1. Introducción………………………………………………………………2
2. Objetivo…………………………………………………………………...2
3. Definiciones………………………………………………………………2
4. Material……………………………………………………………………3
4.1. Medios de cultivo……………………………………………………3
4.2. Reactivos…………………………………………………………….6
4.2.1. Colorantes…………………………………………………….6
4.3. Equipo………………………………………………………………..7
4.4. Material……………………………………………………………….7
5. Procedimiento…………………………………………………………….7
5.1. Instrucciones…………………………………………………………7
5.2. Toma de la muestra…………………………………………………7
5.3. Proceso de la muestra………………………………………………7
5.3.1. Etiquetado de las placas……………………………………..8
5.3.2. Siembra de la muestra……………………………………….8
5.4. Pruebas Bioquímicas………………………………………………..9
6. Interpretación de resultados……………………………………………..9
7. Equipo de seguridad…………………………………………………….11
8. Residuos………………………………………………………………….11
9. Reporte……………………………………………………………………12
10. Referencias……………………………………………………………….13
11. Anexos…………………………………………………………………….13

1
 1. Introducción:

Es una prueba de laboratorio que se hace para aislar e identificar organismos que
puedan causar una infección en la garganta.
También llamada frotis faríngeo, que es la toma de muestra que se realiza en el
fondo de la garganta (en las amígdalas, generalmente), mediante el uso de un
hisopo estéril, se coloca en un cultivo que permite el crecimiento de las bacterias.
El tipo específico de infección se determina utilizando análisis químicos. Si no hay
crecimiento de bacterias, el cultivo es negativo y la persona no tiene una infección,
ya que si también no se controla el pH del medio de cultivo esto podrá afectar el
crecimiento del microorganismo.

2. Objetivo: Aislar e identificar la presencia de Staphylococcus en una muestra de

exudado faríngeo.

3. Definiciones:

Alcalino: Solución acuosa, es capaz de liberar iones OH–.

Asepsia: Conjunto de procedimiento científicos destinados a preservar de gérmenes
infecciosos el organismo.

Autoclave: Aparato que sirve para esterilizar objetos o sustancias situados en su

interior, por medios diferentes, como vapor, temperatura o radiación.

Esterilización: Es el proceso físico o químico que destruye o remueve completamente

todo tipo de vida microbiana. Incluye eliminación de esporas.

Inhibir: Suspender transitoriamente una función o actividad del organismo mediante

la actividad del organismo mediante la acción de un estímulo adecuado.

Inocular: Consiste en tomar una pequeña porción de la muestra para dispersarla y

que crezca con más facilidad en el medio de cultivo.

Patógeno: Agente biológico externo que se aloja en un ente biológico determinado,

dañando de alguna manera su anatomía, a partir de enfermedades o daños visibles
o no.

pH: El pH es una medida de la acidez o de la alcalinidad de una sustancia, es un

valor numérico que expresa la concentración de iones de hidrógeno.

2
Símbolos y Abreviaturas

Símbolo Significado
µg Microgramo
G Gramo
ml, mL Mililitro
Cm Centímetro
°C grados Celsius
pH potencial de hidrógeno
/ Por
UI Unidad Internacional
BHI Infusión Corazón Cerebro

4. Material:

NOTA: Antes de la esterilización en autoclave los medios en los que sean

necesarios esto debe ser sometido a la medición del pH, para corroborar que el pH
del medio es el óptimo para el crecimiento del microorganismo, este procedimiento
se lleva a cabo por medio de un pH metro el cual debe de ser calibrado antes de su
uso. Una vez medido el pH del medio se registrará en la bitácora y se ajustará
conforme lo etiquetado en el frasco del medio, utilizando para esto NaOH 0.1 M y
HCl 0.1 M según corresponda.

4.1. Medios de cultivo:

Agar sangre: Pesar en balanza granataría o analítica dependiendo de la cantidad,

en este caso 40g del polvo en un matraz Erlenmeyer de 1L, utilizar agua destilada
(1L) que se haya sometido a controles periódicos que establezcan su calidad:
conductividad, pH, contaminación microbiana, libre de sustancias bactericidas,
inhibidoras o interferentes. Dejar reposar 5 minutos y mezclar perfectamente hasta
obtener una suspensión homogénea. Calentar con agitación frecuente y hervir 1
minuto, midiendo el pH antes y después de esterilizar, esterilizar en autoclave por
calor húmedo a 121°C a 15 psi de presión durante 20min, enfriar a 45-50°C agregar
sangre desfibrinada al 5%, homogenizar y distribuir en placan, todo en condiciones
de esterilidad.
Formula:

Infusión de musculo de corazón 375g

Peptona 10g
Cloruro de sodio 5g
Agar 15 g

3
PH final: 7.3 +/- 0.

Características del medio

Medio preparado: ámbar.

Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza

Almacenamiento

Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

Medio preparado: a 2-8 ºC.

Agar S110: Pesar en balanza granataría o analítica dependiendo de la cantidad en

este caso 149g del polvo(que es agar s110) en un matraz Erlenmeyer de 1L, utilizar
agua destilada (1L) que se haya sometido a controles periódicos que establezcan
su calidad: conductividad, pH, contaminación microbiana, libre de sustancias
bactericidas, inhibidoras o interferentes. Dejar reposar 5 minutos y mezclar
perfectamente hasta obtener una suspensión homogénea. Calentar con agitación
frecuente y hervir 1 minuto, midiendo el pH (poner cual debe ser) antes y después
de esterilizar, esterilizar en autoclave por calor húmedo a 121°C a 15 psi de presión
durante 20min, enfriar a 45-50°C verter en placas y mezclar para dispersar el
precipitado.
Formula:
Extracto de levadura 2.5g
Trpteina 10g
Gelatina 30g
Lactosa 2g
D-manitol 10g
Cloruro de sodio 75g
Agar 15g
PH: 7.0 +/- 0.2

Características del medio

Medio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

4
Agar Nutritivo: Pesar en balanza granataría o analítica dependiendo de la cantidad
en este caso 31g del polvo en un matraz Erlenmeyer de 1L, utilizar agua destilada
(1L) que se haya sometido a controles periódicos que establezcan su calidad:
conductividad, pH, contaminación microbiana, libre de sustancias bactericidas,
inhibidoras o interferentes. Dejar reposar 5 minutos y mezclar perfectamente hasta
obtener una suspensión homogénea. Calentar con agitación frecuente y hervir 1
minuto, midiendo el pH antes y después de esterilizar, esterilizar en autoclave por
calor húmedo a 121°C a 15 psi de presión durante 20min, enfriar a 45-50°C verter
en placas y mezclar para dispersar el precipitado.
Formula:
Pluripeptona 5g
Extracto de carne 3g
Cloruro de sodio 8g
Agar 15g
PH final: 7.3 +/- 0.2

Características del medio

Medio preparado: ámbar claro a medio ligeramente opalescente.

Almacenamiento

Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

Medio preparado: a 2-8 ºC

Agar Manitol: Pesar en balanza granataría o analítica dependiendo de la cantidad

en este caso 111g del polvo en un matraz Erlenmeyer de 1L, utilizar agua destilada
(1L) que se haya sometido a controles periódicos que establezcan su calidad:
conductividad, pH, contaminación microbiana, libre de sustancias bactericidas,
inhibidoras o interferentes. Dejar reposar 5 minutos y mezclar perfectamente hasta
obtener una suspensión homogénea. Calentar con agitación frecuente y hervir 1
minuto, midiendo el pH antes y después de esterilizar, esterilizar en autoclave por
calor húmedo a 121°C a 15 psi de presión durante 20min, enfriar a 45-50°C verter
en placas y mezclar para dispersar el precipitado.
Formula:
Extracto de carne 1g
Pluripeptona 10g
D-manitol 10g
Cloruro de sodio 75g
Agar 15g

5
Rojo de fenol 0.025g
PH final: 7.4 +/- 0.2

Características del medio

Medio preparado: rojo

Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

4.2. Reactivos:
4.2.1. Colorantes:

Cristal violeta:
Agua Cristal violeta.................................... 1 g
Agua destilada.............................. 100 ml.
Preparación: Disolver el colorante en el agua.
Almacenar la solución en una botella oscura y con tapón de vidrio (que debe decir
la etiqueta).

Lugol:
Yodo: …………………………. 20 grs.
Hidróxido de sodio 1M: ……… 100 ml.
Preparación: Disolver el yodo en 100 ml. de hidróxido de sodio 1M, agregar agua
destilada y llevar a un volumen de 1 litro. Guardar en frasco de vidrio color ámbar.

Alcohol
Etanol 95%................................... 500 ml.
Acetona....................................... 300 ml.
Preparación: Mezclar los ingredientes respectivos de cada combinación para su
uso, Almacenar la solución en una botella oscura y con tapón de vidrio.

Safranina
Safranina (pureza del colorante, 90%....... 0,25 g
Etanol (95%)....................................... 10 ml.
Agua destilada............................................ 1000 ml.
Preparación: Disolver el colorante en 10 ml de etanol. Agregar el agua destilada.
Filtrar y Almacenar en frasco de vidrio color ámbar (poner que se debe aforar a un
litro).

6
Agua destilada: sometido a controles periódicos que establezcan su calidad:
conductividad, pH, contaminación microbiana, libre de sustancias bactericidas,
inhibidoras o interferentes.

Etiqueta de reactivos debe contener: nombre, composición, identificación del

peligro o riego, fecha de caducidad.

4.3. Equipo:
Campana de flujo laminar
Balanza analítica
Autoclave
Refrigeradora a 6-8ºC
Incubadora a 35-37ºC
Microscopio con objetivo de 40x y 100x

4.4. Material:
Hisopo estéril
Marcadores indelebles
Guantes y mascarillas
Gradillas
Portaobjetos
Pinzas
Contenedores de cloro al 5% para desechar el material contaminante.
Mechero tipo bunsen

5. Procedimiento:

5.1. Instrucciones: Se le indica al paciente no consumir alimentos por alrededor

de 12 horas, y por la mañana tomar la primera orina del día descartando la
primera micción y así tomando la micción intermedia también habrá que
descartar la última micción.

No haber tenido relaciones sexuales 24 horas previas al análisis

5.2. Toma de la muestra el paciente debe traer la muestra recolectada en frasco

estéril máximo 2 horas antes del análisis

La muestra no debe estar en temperatura ambiente, debe estar en previa

refrigeración.

5.3. Proceso de la muestra:

7
 5.3.1. Etiquetado de las placas

Datos:
Nombre del paciente
Fecha y hora
Nombre del medio
Nombre de la muestra

5.3.2. Siembra de la muestra:

Placas:

Las tomas deben de ser sembradas enseguida y con medio de transporte adecuado;
no se ha de tardar más de 4-5 horas. Se prosigue a sembrar en medios de cultivo:

 Estriar directamente con el hisopo.

 Hacer un inoculo y con el asa bacteriológica estriar.
 Hacer un inoculo.
 Quemar el hisopo.
 Esterilizar el asa.
 Dejar que el asa se atempere.
 Estriar con el asa en las cajas.
 Después de terminar de estriar se esteriliza el asa.
 Etiquetar las cajas
 Colocarlos en pila de monedas con la tapa hacia abajo.
 Llevarlos a incubar a 37ºC.

Frotis:
 Utilizar el portaobjetos limpio y seco y enumerar
 Marcar con marcador en el portaobjetos del número de las colonias.
 Colocar 1-2 gotas de agua destilada en todos los portaobjetos.
 Tomar la mitad de la colonia a observar.
 Fijar el frotis al calor, tomar el frotis, pasar por la flama del mechero hasta que
ya no quede la gota sobre el portaobjetos.
 Llevar a teñir.

Tinción al gram:
 Colocar el frotis sobre el soporte
 Cubrir totalmente con cristal violeta 1min. Desechar la solución, enjuagar con
agua y escurrir.
 Cubrir con lugol 1min. Desechar la solución, enjuagar y escurrir.

8
 Cubrir con alcohol 30seg. Desechar la solución, enjuagar y escurrir.
 Cubrir con safranina 30seg. Desechar la solución, enjuagar con agua y escurrir.
 Tomar el papel filtro y limpiar la parte de abajo del portaobjetos, dejar secar el
frotis a temperatura ambiente y cerca del mechero si aún esta encendido.

5.4. Pruebas Bioquímicas;

Catalasa: Se coloca una gota de solución de hidrogeno H2O2 al 3% sobre un

portaobjetos. Sobre esa solución se vierte una pequeña cantidad de la colonia
seleccionada. La formación de burbujas indica una prueba positiva.
Coagulasa: Se coloca una parte de la colonia en una gota de plasma y se mezcla.
Debe balancearse el portaobjetos antes de 3 min. Se puede presentar coagulo.
Una prueba positiva, formación de una capa gruesa, espesa, mucosa, es el
coagulo. Los testigos negativos, deben ser confirmados por pruebas en tubo.

Oxidasa: Poner un trozo de papel filtro sobre una de las tapaderas de una placa
petri. Añadir una gota del reactivo de oxidasa. Depositar sobre el reactivo una
masa bacteriana (actuar de forma rápida y con un asa de platino). La reacción
positiva la indica un color azul-violeta intenso antes de 10 segundos.

Prueba de manitol (movilidad): En el medio de cultivo de manitol en tubo 16x150,

Se siembra en picadura recta con el microorganismo a identificar. Se incuba 24
horas y se procede a la lectura de los resultados.

6. Interpretación de resultados;
6.1. Agares:

Agar sangre: se observan unas pequeñas colonias abundantes con una beta
hemolisis, lo que indica que las bacterias sintetizan una hemolisina que origina
una zona de lisis transparente alrededor de las mismas. (Ver anexo. Figura1).

9
Agar S110: se presentan pequeñas colonias blancas abundantes una prueba
positiva (halo transparente alrededor de las colonias) y un resultado negativo
(ausencia de halo transparente en las colonias) (ver anexo figura 2)

Agar Nutritivo: Hemólisis alfa: lisis parcial de los glóbulos rojos. Se observa un
halo de color verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a la oxidación
de la hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color verdoso) por el
peróxido de hidrógeno generado por los microorganismos.

Hemólisis beta: lisis total de los glóbulos rojos. Se observa un halo claro, brillante
alrededor de la colonia en estudio.

Hemólisis gamma: ausencia de lisis de los glóbulos rojos. El medio de cultivo no

presenta modificaciones de color y aspecto alrededor de la colonia en estudio
(ver anexo figura 3).

Agar manitol: Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se

visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas,
rodeadas de una zona del mismo color o púrpura (ver anexo figura)

6.2. Frotis:

Al observar en el microscopio y para identificarlas se debe observar unos cocos

en racimos en forma de uvas de color blanco-amarillas lisas y convexas (ver
anexo figura 5).

6.3. Bioquímicas

Para diferenciar entre las distintas especies de Staphylococcus (ver anexo

figura 10)
Catalasa: cuando es positivo; al agregarle el peróxido de hidrogeno se observa
el burbujeo (liberación del oxígeno) en el portaobjetos (ver anexo figura 6).

10
 Coagulasa: Una prueba positiva, formación de una capa gruesa, espesa,
mucosa, es el coagulo. Los testigos negativos, deben ser confirmados por
pruebas en tubo (ver anexo figura 7).

Oxidasa: La reacción positiva la indica un color azul-violeta intenso antes de 10

segundos (ver anexo figura 8).

Manitol: se considera negativo si no hay cambio de color (rojo) y positivo si el

medio cambia a color amarillo. Se considera que hay movilidad si se observa
crecimiento más allá de la picadura, mientras que el resultado sería negativo en
caso de que el crecimiento se limitase a la zona de la picadura (ver anexo figura
9).

7. Equipo de seguridad:

 Soluciones antisépticas: Para una gran proporción de las muestras se debe

realizar una limpieza previa de la zona, con la finalidad de disminuir la obtención
de microorganismos de la flora normal, las más adecuadas los antisépticos que
contienen yodo, alcohol y gluconato de clorhexidina.

 Guantes estériles y no estériles: Se requerirán alguno de los dos tipos de

guantes dependiendo el tipo de muestra que se realice.

 Gasas estériles: Verificar que se encuentre el empaque en buen estado con

cinta testigo y sin datos de violación del empaque. No se recomienda el uso de
torundas de algodón ya que son fuente frecuente de contaminación (bacilos
gramnegativos y positivos).

 Batas y campos estériles: Se requerirán alguno de los dos tipos de protectores

dependiendo del tipo de muestra que se realice y si el paciente cuenta con
medidas de protección especiales.

 Cubre bocas: Como parte de las medidas de protección estándar se

recomienda la utilización de cubre bocas en todo procedimiento.

8. Residuos:

 Sangre:

11
 Líquidos, recipientes herméticos y de color rojo.

 Cultivo y cepas de agentes infecciosos:

Sólidos, en bolsa de polietilieno de color rojo.

 Patológicos:
Sólidos, en bolsa de polietilieno de color rojo.
Líquidos, en recipientes de polietilieno de color amarillo.

 Residuos No anatómicos:
Sólidos, en bolsa de polietilieno de color rojo.
Líquidos, en recipientes de polietilieno de color rojo.

 Objetos Punzocortantes:
Sólidos, en recipientes rígidos de polipropileno de color rojo.

Clasificación respecto a: NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002,

Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos
- Clasificación y especificaciones de manejo.

9. Reporte:

TazKatEdu Lab
Nombre de laboratorio: _______________________

Nombre_______________________________
Edad:
Sexo:

Código de muestra: ___________________

Fecha de recepción de la muestra__________________________

12
Frotis:
10. Referencias:

Libros:

 Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn

WC. "Diagnóstico Microbiológico". 5ª ed. Ed. Médica Panamericana SA.
Buenos Aires, 1999.
 Mims CA, Playfair JHL, Roitt IM, Wakelin D, Willians R. "Microbiologia
Médica". 2ª ed. Ed. Harcourt Brace. Madrid, 1999.
 Murray PR, Rosenthal KS, Kobayashi GS, Pfaller MA. "Microbiologia
Médica". 4ª ed. Ed. Mosby. Elsevier Science. Madrid, 2002.
 Walker T.S. "Microbiologia". Ed. McGraw-Hill Interamericana. Mexico D.F.,
20

11. Anexos

Figura 1 : Agar sangre Figura 2: S110

Figura 3: Agar nutritivo Figura 4: Agar manitol

Figura 5: frotis Figura 6: prueba de catalasa

13
Figura 7:Coagulasa Figura 8: Oxidasa Figura 9: Manitol

14
Figura 10: especies de staphylo

15