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UNIDADE I 15

INTRODUÇÃO À MICROSCOPIA
O estudo da Histologia depende da utilização da mi- logia deve necessariamente conhecer os fundamentos
croscopia. Na realidade para se conhecer a “anatomia básicos da microscopia.
microscópica” dos tecidos e órgãos, é necessário fa- Assim sendo, passaremos à descrição mais detalha-
zer uso do microscópio. Portanto, o aluno de Histo- da de um microscópio óptico.

1.1 - Microscópio Óptico

Um microscópio óptico pode ser simples ou com- As objetivas (pode haver três, quatro ou cinco) são
posto: o microscópio simples possui uma única lente uma combinação de lentes presas à extremidade in-
e só fornece uma imagem moderadamente aumentada ferior do tubo do microscópio. O valor gravado tal
do objeto que se está estudando; o microscópio com- como 10x indica o aumento da objetiva. Uma objeti-
posto consiste de uma série de lentes e fornece um va 10x usada em combinação com uma ocular 12,5x
aumento muito maior. dá um aumento total de 125x.

As diferentes objetivas atarraxam-se ao revólver,


Partes de um Microscópio Óptico Composto que por sua vez está preso à extremidade inferior
do tubo do microscópio. Troca-se uma objetiva
Um microscópio composto consiste de partes mecâ- por outra pela rotação do revólver, de modo que
nicas e ópticas. quando uma objetiva é substituída outra entra em
seu lugar.
A parte mecânica tem uma base que estabiliza o mi-
croscópio, uma coluna ou canhão que se estende da O condensador é uma combinação de lentes si-
base para cima, e uma platina na qual é colocado o tuada abaixo da platina. Ele projeta um cone de
objeto a ser examinado. luz sobre o objeto que está sendo observado. O
condensador pode ser levantado ou abaixado por
As partes ópticas estão presas à coluna acima e abaixo um mecanismo de cremalheira, de forma que a
da platina, são elas: oculares, objetivas, condensador e luz pode ser focalizada no objeto. A passagem de
espelho. Em muitos microscópios, o espelho e a lâmpada raios marginais no condensador é impedida pelo
estão alojados, com segurança, na base do instrumento. diafragma – íris.

A ocular consiste de uma combinação de lentes que O espelho que está situado abaixo do condensador
estão embutidas na extremidade superior do tubo do reßete os raios luminosos emanados da fonte de luz.
microscópio. O valor gravado tal como 12,5x indica Situado entre o espelho e o condensador, existe um
o aumento da ocular. porta-Þltro móvel.

1.2 - Como Funciona o Microscópio Óptico

O objeto a ser estudado é montado em uma lâmina ocular, os raios luminosos são dirigidos para a pupi-
de vidro, que é colocada na platina do microscópio. O la do olho, após o que eles incidem sobre a retina.
objeto é posto em posição sob a objetiva, seja manu- Se o olho está em repouso, como na visão a longa
almente ou usando a platina mecânica. Faz-se o foco distância, deve-se obter uma clara imagem do objeto
correto do objeto levantando ou abaixando a platina quando a objetiva estiver no foco exato.
e levantando ou abaixando o tubo do microscópio, ao
qual estão atarraxados a ocular e as objetivas. A posição das lentes do microscópio em relação ao ob-
jeto pode ser mudada ajustando os focos Þno e grosso.
Os raios luminosos aqui são deßetidos e conver- A focalização grossa produz movimentos amplos, en-
gem para o objeto. Então passam através das lentes quanto a Þna é um mecanismo delicado que se faz com
da ocular e são novamente deßetidos. Emergindo da pequenos movimentos (pequenos e grandes aumentos).
Um microscópio óptico composto é, assim, um sistema Um microscópio composto produz uma imagem
16 de aumento em dois estágios. Primeiro o objeto é aumen- de cabeça para baixo e invertida lateralmente. A
tado pelas lentes da objetiva e depois novamente pelo se- inversão é facilmente demonstrada: se o espéci-
gundo conjunto de lentes da ocular. O aumento total é o me é movido para um lado, a imagem move-se no
produto dos aumentos da objetiva pelo da ocular. sentido contrário.
UNIDADE II 17

MÉTODOS DE ESTUDOS HISTOLÓGICOS


Vários são os métodos de estudos dos tecidos, va- O método mais utilizado em Histologia é o prepara-
riando do estudo dos tecidos in vivo até aqueles que do histológico permanente (lâmina histológica), estu-
utilizam os tecidos mortos. dado em microscópio óptico. A seguir, descrevemos
as etapas de produção de uma lâmina histológica:

2.1 - Primeira Etapa: Coleta da Amostra

A primeira etapa de todo o processo de prepara- d) Cirurgias amplas (radicais) – a amostra cor-
ção de uma lâmina histológica consiste em coletar a responde a peças grandes (ex. tumores) ou órgãos
amostra, ou seja, obtê-la e isso pode ser feito de cinco (ex. mama, útero);
diferentes maneiras:
e) Necrópsia – procedimento utilizado para es-
a) Biópsia cirúrgica – obtenção da amostra de teci- tudo anatômico de todos os órgãos ou tecidos, no
do ou órgão através de uma incisão cirúrgica;
animal morto.
b) Biópsia endoscópica – usada para órgãos ocos
(estômago, intestino, etc.) através de endoscopia; As peças cirúrgicas grandes ou de autópsia devem
ser clivadas previamente para reduzir sua espessura
c) Biópsia por agulha – a amostra é obtida pela permitindo a penetração fácil do Þxador. O princípio
punção do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir fundamental de clivagem é que o fragmento possua
a cavidade natural; em torno de 4 mm de espessura.

2.2 - Segunda Etapa: Fixação

A base de uma boa preparação histológica é a Þxação f) Facilitar a subseqüente coloração.


que deve ser completa e adequada. Para tanto, é preci-
so tomar algumas precauções que são obrigatórias: A Þxação pode ser física (utilizando-se o calor ou o
frio) ou química. A Þxação em Histologia é quase ex-
a) O material coletado deve ser imerso rapidamente clusivamente química, em que substâncias (Þxadores)
no Þxador; são utilizadas com a principal função de insolubilizar
as proteínas dos tecidos. Os Þxadores podem agir pre-
b) O volume de Þxador deve ser no mínimo dez ve- cipitando as proteínas ou coagulando-as, assim temos
zes (10x) maior que o volume da peça coletada. como principais Þxadores:

Os principais objetivos da Þxação são: a) Que precipitam as proteínas: cloreto de mercúrio


e ácido pícrico;
a) Inibir ou parar a autólise tecidual;
b) Que coagulam as proteínas: aldeído fórmico (o
b) Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusí- mais utilizado, conhecido como Þxador universal),
veis as substâncias insolúveis; tetróxido de ósmio e o aldeído glutárico.

c) Proteger, por meio de endurecimento, os teci- Com o intuito de se conseguir o Þxador ideal, os
dos moles no manuseio e procedimentos técnicos histologistas elaboraram diversas misturas Þxadoras
posteriores; como o líquido de BOUIN e o líquido de HELLY.

d) Preservar os vários componentes celulares e tis- O formol a 10% para microscopia óptica e o aldeí-
sulares; do glutárico em solução de 2 a 6% para microscopia
eletrônica são os Þxadores simples mais comumente
e) Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos; utilizados.
O tempo de Þxação varia de acordo com o tamanho mm) com serra adequada, antes da fixação. De-
18 da peça, constituição do tecido, poder de Þxação do pois de completada a fixação, coloca-se o mate-
Þxador, objetivos a pesquisar e temperatura ambien- rial na solução descalcificadora. Geralmente, são
te. No entanto, de forma geral, tendo o fragmento a empregados como agentes descalcificadores os
ser Þxado uma espessura de 4 mm, o tempo mínimo seguintes ácidos: nítrico, fórmico, tricloacético,
de Þxação é de doze (12) horas. clorídrico, pícrico, EDTA, sulfossalicílico. Não
existe uma solução descalcificadora ideal. A úni-
Observação: Para que se possa examinar o tecido ca diferença entre as várias soluções é que umas
ósseo ou tecido com áreas de calciÞcação, deve-se
agem mais rapidamente do que as outras. O ácido
antes de processá-lo, incluí-lo e cortá-lo, proceder a
usado deve ser completamente removido do te-
descalciÞcação, que consiste na remoção dos sais de
cálcio que se encontram depositados nos tecidos or- cido depois de terminada a descalcificação. Isso
gânicos sem alteração da sua estrutura celular. é feito pela lavagem abundante e cuidadosa em
água corrente ou álcool, conforme o descalcifica-
Os ossos ou outros materiais calcificados devem dor empregado. Essa lavagem deve ser no mínimo
ser cortados em pequenos pedaços (cerca de 4 por quatro horas.

2.3 - Terceira Etapa: Processamento


Após a preservação do tecido, a etapa seguinte con- meio de sustentação que manterá juntas as células e
siste em prepará-lo para o exame microscópico. as estruturas intercelulares. Os materiais de sustenta-
ção usados são denominados materiais de inclusão.
Com a Þnalidade de permitir que a luz o atravesse,
cortes muito delgados de tecido têm que ser feitos. In- Certos materiais de inclusão, tais como “Carbowax”
felizmente, embora o processo de Þxação endureça o e a gelatina, são solúveis em água e os tecidos não
tecido, o material não se torna suÞcientemente Þrme precisam ser desidratados antes do uso. Os materiais
ou coeso para permitir cortes delgados perfeitos. mais comumente usados são substâncias semelhantes
à paraÞna que não são miscíveis com água. Quando
Para que esse grau de Þrmeza seja atingido, o teci- essas substâncias forem utilizadas, os tecidos terão
do deve ser completamente impregnado com algum que ser desidratados antes da inclusão.

2.4 - Quarta Etapa: Desidratação


Antes que um material de inclusão, tal como a para- estruturais da célula de caráter irreversível. O álcool
Þna, possa penetrar no tecido, seu conteúdo em água tem a vantagem de endurecer mais o tecido. O volu-
deve ser removido. me de álcool deverá ser 10 a 20 vezes maior que o
volume da peça.
A desidratação é levada a efeito imergindo a amos-
tra de tecido em concentrações crescentes de álcool Várias são as substâncias utilizadas como agentes
etílico. O álcool é o agente mais comumente utilizado de desidratação: álcoois etílico, butílico, metílico e
nesse processo, sendo empregado numa série cres- isopropílico, a acetona, o éter, o clorofórmio e o óxi-
cente (70% - 80% - 90% - 100%) para se evitar a do propileno. O álcool etílico é o mais utilizado em
retração pronunciada do tecido, ocasionando lesões técnica de rotina.

2.5 - Quinta Etapa: Diafanização (Clarificação)


A impregnação do tecido como meio de inclusão é im- tempo desalcolizante. A paraÞna não se mistura com
possível nesse estágio porque as substâncias semelhantes água e nem com álcool. Ambos devem ser completa-
à paraÞna usadas para a inclusão não se misturam com o mente removidos para que a paraÞna possa penetrar
álcool. O tecido deve, portanto, ser imerso em um produ- eÞcientemente no tecido.
to químico em que o álcool e a paraÞna sejam solúveis.
O xilol é comumente utilizado. Tal produto quí-
Assim a diafanização consiste na inÞltração do te- mico é muitas vezes chamado de agente clarifica-
cido por um solvente da paraÞna que seja ao mesmo dor porque torna o tecido semitranslúcido, quase
transparente. Entre os reagentes mais utilizados na A quantidade de xilol (substância mais empregada)
fase de diafanização, podemos citar ainda: toluol, utilizada deve ser 10 a 20 vezes o volume da peça. 19
clorofórmio, óleo de cedro, benzol e salicilato de A duração da clariÞcação varia com as dimensões, a
metila. constituição do material e a temperatura.

2.6 - Sexta Etapa: Inclusão (Impregnação)

A Þnalidade da impregnação é eliminar completa- manecerá imersa na paraÞna fundida (em estufa) duran-
mente o xilol contido no material e a total penetração da te o tempo necessário para a completa impregnação.
paraÞna nos vazios deixados pela água e gordura, antes
existentes no tecido. Esse processo serve também para Posteriormente, serão retirados da estufa e deixados
preparar o material para os cortes, removendo o clari- à temperatura ambiente até que a paraÞna endureça,
Þcante e endurecendo-o suÞcientemente e dando-lhe a após isso, o bloco de paraÞna com o tecido será reti-
consistência adequada para que possa ser cortado.
rado da forma e conduzido ao corte.
O tecido é passado em duas trocas de paraÞna para as-
segurar a substituição de todo o agente clariÞcador pela Pode-se citar ainda como agentes de impregnação:
paraÞna. Emprega-se a paraÞna a uma temperatura de celoidina, goma arábica, paraÞna plástica, polietileno
56 a 60ºC (paraÞna fundida). A amostra de tecido per- glicol e paraÞna esteriÞcada.

2.7 - Sétima Etapa: Microtomia

Para se obter cortes de material incluído em paraÞna ser regulada à vontade. Essa medida tem como unida-
ou por congelação é necessário um instrumento espe- de o micrômetro, que corresponde à milésima parte
cial: o micrótomo. Os micrótomos variam de acordo do milímetro.
com os fabricantes e têm como fundamento duas pe-
ças principais: o suporte ou mandril (onde é Þxada a Normalmente, um micrótomo faz cortes cuja espes-
peça a cortar) e a navalha. sura varia de 1 a 50 micrômetros, mas a espessura
mais utilizada em microscopia óptica é de 4 a 6 mi-
O suporte é sempre encaixado a um parafuso micro- crômetros. Há vários tipos de micrótomos: rotativo,
métrico ou a uma espiral metálica que o faz adiantar tipo Minot, de congelação e o destinado a trabalhos
segundo seu eixo, em medida conhecida e que pode de microscopia eletrônica.

2.8 - Oitava Etapa: Colagem do Corte à Lâmina

As Þtas de cortes de paraÞna são estiradas cuidado- e o corte de paraÞna é colocado em banho-maria (água
samente e os cortes individuais são separados por um morna) de forma que as dobras provocadas pelo corte
bisturi. Na superfície de uma lâmina de vidro, é feito um no tecido desapareçam, após o corte é “pescado” com a
ponto de aderência (normalmente com albumina de ovo) lâmina, preparada com albumina, na qual se adere.

2.9 - Nona Etapa: Coloração


É a técnica tintorial empregada para facilitar o estu- Quanto à cromatização, ou seja, de acordo com o
do dos tecidos sob microscopia. número de cores conferidas às estruturas pelas co-
lorações simples ou combinadas, estas tomam a de-
A coloração é de importância fundamental em his- nominação de colorações monocrômicas (uma cor),
tologia, pois os tecidos não tratados têm pouca dife- bicrômicas (duas cores), tricrômicas (três cores) e
renciação óptica. As colorações de um modo geral se policrômicas (mais de três cores).
efetuam por processos físico-químicos ou puramente
físicos e podem ser consideradas, segundo a moda- Para se corar convenientemente a célula, deve-se re-
lidade, a ação, o caráter, o grau de ação, o tempo, o correr a um método de coloração sucessiva do núcleo
número de corantes e a cromatização. e do citoplasma.
A combinação mais comum de corantes usada em Histo- O azul-de-metileno, o azul-de-toluidina e a tioni-
20 logia e Histopatologia é a Hematoxilina e Eosina (HE). na são exemplos de corantes simples que exibem
A hematoxilina é um corante natural obtido da casca de metacromasia. Com os corantes azuis, a cor muda
pau campeche. Ela não é realmente um corante e deve para vermelho. A coloração dos mastócitos com o
ser oxidada em hemateína a Þm de tornar-se um corante. azul-de-metileno constitui um bom exemplo. Os
Ademais, o corante que resulta (hematoxilina-hemateína) grânulos do citoplasma coram-se em vermelho-
não tem aÞnidade para os tecidos. Deve ser usado um púrpura, enquanto o resto do tecido Þca azul. A
mordente, como o alumínio ou o ferro, juntamente com causa da metacromasia não é totalmente compre-
a mistura de hematoxilina antes que ela possa corar os endida, porém tem sido sugerido que é devido à
tecidos. A mistura cora em azul-púrpura. A eosina é um polimerização das moléculas do corante. Julga-se
corante sintético e produz uma coloração vermelha. que a presença de macromoléculas com radicais
eletronegativos no tecido facilita a polimerização
Nas células coradas com HE, os ácidos nucléicos e provoca a mudança de cor.
presentes no núcleo são corados pela hematoxilina,
dando ao núcleo um tom azul-púrpura. A eosina é
atraída pelos elementos básicos da proteína do cito- Antes que o corte seja corado, a paraÞna em que ele
plasma da célula, corando-o de róseo a vermelho. foi incluído deve ser removida. O corte, que já foi
aderido à lâmina de vidro (pescagem em banho-ma-
Os componentes dos tecidos que se coram prontamen- ria), é banhado no xilol para dissolver a paraÞna.
te com os corantes básicos são chamados basóÞlos; os
que têm aÞnidade pelos corantes ácidos são chamados Devido ao fato de muitos corantes serem solúveis
acidóÞlos. A hematoxilina comporta-se como um co- em água, torna-se necessário remover o xilol do te-
rante básico e, portanto, cora o núcleo de modo basóÞ- cido e substituí-lo por água (hidratação). O corte é
lo. A eosina é um corante ácido e cora os elementos bá- imerso em uma série de concentrações decrescentes
sicos da proteína do citoplasma de maneira acidóÞla. de álcool etílico até que esteja hidratado. Depois que
o corte estiver hidratado, procede-se à coloração pro-
Certos corantes reagem com os componentes do te- priamente dita. No caso da HE, o tecido é imerso pri-
cido e os coram com uma cor diferente da cor da so- meiramente em hematoxilina, lavado com água para
lução corante. A mudança de cor do corante chama-se retirada de excedente, depois imerso em eosina e,
metacromasia. após isso, também se faz lavagem do tecido.

2.10 - Décima Etapa: Montagem

Depois que o corte tiver sido corado com a solução bálsamo de Canadá). Uma gota do meio de montagem
apropriada, ele é passado através de concentrações é colocada sobre o corte e a lamínula é posicionada
crescentes de álcool para remover, de novo, a água sobre o corte de forma delicada, de uma forma tal que
(desidratação). Objetiva-se com essa desidratação au- o meio de montagem cubra completamente o corte.
mentar a sobrevida do preparado histológico. Depois, a lamínula é comprimida com Þrmeza sobre
o corte e o meio de montagem se espalha formando
Finalmente, o corte é banhado em xilol antes de ser uma delgada película entre a lâmina e a lamínula, que
montado em um meio solúvel em xilol, que é o meio posteriormente vão estar Þrmemente aderidas uma à
de montagem (para os cortes de paraÞna, é usado o outra pela estabilização do meio de montagem.