Las Algas: Recordemos su Importancia evolutiva,

ecológica y biotecnológica

Fundamentales en la composición de la atmósfera actual y en el ciclo global

del carbono
Cyanobacteria fueron responsables de transformar la atmósfera original de
la tierra en una atmósfera oxigénica.

A partir de una Cyanobacteria, por endosimbiosis, se originaron y

diversificaron los distintos grupos de algas.

Un ancestro perteneciente a Chlorophyta llevó al origen de las Embriophyta

y de esa manera se logró la conquista y diversificación de las plantas en el
ambiente terrestre.
 Importancia evolutiva, ecológica y biotecnológica

Siendo sólo el 1 % de la biomasa fotosintetizadora del planeta, son

responsables de:

60 % del oxígeno respirable,

50 % del total de la producción primaria del planeta (E
y C reducido para mantener el mundo animal)
sostener el 70 % de la biomasa mundial,

Forman comunidades claves en los diversos ecosistemas, por ej:

Fitoplancton: mantenimiento de cadenas tróficas en

ríos lagos, lagunas, océanos.

Perifiton: sustento de fauna de protozoos y

microinvertebrados

Bosques de macroalgas marinas (Chlorophyta,

Rhodophyta, Phaeophyta): hábitats que permiten
elevada diversidad animal (refugio, alimentación,
desove y cría).
 Importancia evolutiva, ecológica y biotecnológica

Aplicación científica y tecnológica:

Son excelentes Organismos Modelo para investigación (estructura

de flagelo, fotosíntesis, desarrollo celular).

Biomonitores de condiciones ambientales, particularmente de

condiciones de contaminación.

Producción de distintos metabolitos de valor para el desarrollo de

programas biotecnológicos relacionados con acuicultura, industria
farmacéutica, cosmética, alimenticia, combustibles (ej Chlorella,
Dunaliella y Haematococcus)

Macroalgas como alimento (Japón, China y Corea).

Macroalgas son fuente de ficocoloides (alginato: Phaeophyta, agar y

carragenano: Rhodophyta), espesantes en industria farmacéutica,
cosmética, alimenticia, etc (dentífricos, jabones, shampooes,
helados, postres, cremas, etc).
No cabe duda de la importancia de los estudios científicos sobre algas y
de las acciones que lleven a la conservación de su biodiversidad.

Los cultivos de algas constituyen una herramienta importantísima

y casi indispensable para diversos estudios, permitiendo por ej:

Resolver delimitaciones taxonómicas en diferentes grupos,

Conocer y entender el ciclo de vida de muchas especies.
Conocer y entender los casos de polimorfismo,
Estudiar la resistencia a antibióticos y efectos de distintos
tóxicos
Comprender la citología, genética y mutaciones
Estudiar y encontrar aplicaciones: fijación de N2; inducción e
inhibición de crecimiento; vitaminas, pigmentos, ácidos grasos,
etc., evaluación de calidad de aguas e impacto ambiental
La importancia del uso de cultivos llevó a lo largo de
los años a un mejoramiento de las técnicas y al
desarrollo y establecimiento de colecciones de
cultivos.

Las colecciones son fuente de estándares biológicos,

indispensables para muchos estudios taxonómicos,
fisiológicos, ecotoxicológicos y de exploración o
búsqueda de productos químicos útiles o nuevas
aplicaciones.

El desarrollo de colecciones se ha logrado

principalmente con una gran diversidad de microalgas
 Cultivos de algas: del siglo XIX a nuestros días

Famintzin (1871, Rusia): el iniciador. Fisiólogo vegetal

que hizo crecer algas verdes en una solución mineral
diseñada por Knop (en 1965) para plantas vasculares.

Beijerink (Holanda): 1º en aislar Chlorella,

Scenedesmus y presuntamente obtener cultivos
axénicos en 1890 (muy cuestionado).

Miquel (1890, 1898, Francia): aisló diatomeas y

estableció el método de aislamiento con micropipeta.
Además desarrolló 2 soluciones minerales para
enriquecer el agua de mar.
Cultivos de algas: del siglo XIX a nuestros días

Chodat (1900, Suiza): durante más de 30 años estableció

una colección de más de 300 especies en cultivos puros.

Kuster (1908): 1º en aislar dinoflagelados y Jacobsen

(1910): 1º aisló Volvocales

Allen (1910, UK): padre de la maricultura algal. 1º que

desarrolló cultivos de microalgas marinas como
alimento animal y sentó las bases para el cultivo de
macroalgas
 Cultivos de algas: del siglo XIX a nuestros días

Pringsheim (1912, Alemania): medio bifásico tierra-

agua. 1º en obtener un cultivo axénico de Cyanophyta.
Construyó grandes colecciones (Universidad en Praga
y las famosa CCAP y SAG).

Mainx (1930, Praga) centrifugación y uso de fototaxis

para aislamiento.

En 1949: impulso de la criobiología (glicerol como

protector de espermatozoides) y comienzan los
intentos de mantenimiento de algas en N2 líquido.
 Algunas de las Colecciones internacionales de mayor
envergadura

CCAP (UK): algas y protozoos (+ 2500 cepas)

UTEX (EEUU): Univ. Texas (3000 cepas)
SAG (Alemania): Univ. Göttingen (+ 2400 cepas)
NCMA (antes CCMP, EEUU): fitoplancton marino (+ 2500 cepas)
ACOI (Portugal): Univ. Coimbra (+ 2000 cepas)
ASIB (Austria): Inst Botánica Insbruck (+ 2000 cepas)
RCC (Francia): Colec cultivos de Roscoff (+ 1300 cepas)
UHCC (Finlandia): Cyanobacteria Univ Helsinski (aprox 1000 cepas)
ATCC (EEUU): Colec americana de cultivos tipo
NIES (Japón): cultivos microbianos Inst Nac de Estudios Ambientales (+ 2500
cepas)
PCC (Francia): cultivos de Cyanobacteria Inst Pasteur (+ 800 cepas)
CSIRO (Australia): Collection of living microalgae (aprox 800 cepas)
 Objetivo de las Colecciones de cultivo
Conservar ex situ y mantener la diversidad
morfológica, fisiológica y genética de las algas

Valor fundamental: constituyen una fuente de

estándares biológicos para distintos estudios

El potencial uso de cultivos para estudios científicos,

determina que su mantenimiento garantice una
correcta preservación de sus propiedades fisiológicas
y bioquímicas.

El desarrollo y crecimiento de las colecciones apuntó

al establecimiento de una metodología de trabajo con
una rutina precisa de preservación, mantenimiento,
almacenamiento y control.
 Importancia de las colecciones de cultivos de algas

Proveen cultivos que son difíciles o imposibles de re-aislar

(especies tipo de descripciones originales, especies de ambientes
extremos, etc)

Proveen un depósito de biodiversidad bien caracterizada para

investigación y/o explotación: fuente de resursos biotecnológicos

Son fuente irremplazable de cultivos derivados de material de

descripciones e identificaciones originales de especies, necesarias
para estudios taxonómicos y filogenéticos

Proveen una base informática sobre cultivos e investigaciones

relacionadas con ellos
 Métodos de mantenimiento

Las colecciones de cultivo internacionales almacenan un número

significativo de cepas de la región o de otras regiones

Método de mantenimiento más común: rutina de subcultivo seriado

(mantener poblaciones saludables y representativas en morfología y
genética).

Desventajas del método de subcultivo:

 Es trabajoso e insume mucho tiempo
 Limita la capacidad de mantener un gran número de cepas (personal
especializado y exclusivo)
 Existe riesgo de contaminación bacteriana
 Existe riesgo de errores de etiquetado o contaminación cruzada
 Puede haber cambios morfológicos o fisiológicos con respecto a la
población nativa. Hay evidencia en distintas microalgas
La estabilidad fenotípica y genética de los cultivos es de
importancia crítica, no sólo para preservar biodiversidad
representativa, sino para la preservación de recursos estables para
estudios científicos y para explotación biotecnológica.

Criopreservación como técnica alternativa para el mantenimiento de

cultivos algales.

Almacenar el organismo a T° ultra-baja (debajo de -130º C), siguiendo un

protocolo de congelamiento y aclimatación con un crioprotector, de
manera tal que sea capaz de sobrevivir luego del descongelamiento.

En teoría permite mantener algas indefinidamente en un estado

metabólicamente inactivo, y evita o disminuye los riesgos asociados al
mantenimiento por subcultivo seriado.
 Ventajas del método de
criopreservación

Da estabilidad contra cambios genéticos debidos a

la presión de selección de las condiciones de
cultivo o debidos a la deriva génica

Protege las cepas de contaminación microbiana,

errores de manipulación, errores de etiquetado,
fallas mecánicas de los equipos de cultivo

Necesita un espacio de almacenamiento mínimo

(volúmenes de cripreservación de 1-2 ml)
 Desventajas del método de criopreservación
Inversión inicial para entrenamiento y equipo especializado
Necesidad de un resguardo de equipos de alta confiabilidad
 Aporte regular de N2 líq y freezer de Tº ultra-baja (- 150º C)
Se necesitan 2 a 3 semanas para obtener un volumen adecuado de
cultivo en activo crecimiento a partir de los viales congelados

No puede aplicarse a todas las algas (sin éxito en Dino, Crypto, Synuro
y Rhaphidophyta).

Distintos protocolos de congelamiento influyen en la calidad del

material preservado y puede llevar a mutaciones

Riesgo de selección de subpoblaciones resistentes y de alteraciones

genéticas. Puede inducir estrés vía formación de cristales intracelulares,
shock osmótico y/o toxicidad del crioprotector (PVP, glicerol, DMSO,
MeOH). Ej: Muller et al. (2007) diferencias genómicas luego de
criopreservación en 14 de 28 cepas de Chlorophyta.
Proyecto COBRA (Conservación de recursos biotecnológicos y
científicos europeos en microalgas y cianobacterias)
Discutir e impulsar investigaciones relacionadas con los problemas
asociados a las colecciones de cultivos.

Objetivos principales:
Aplicar criopreservación a especies “reacias”
Monitorear por técnicas moleculares la ocurrencia de cambios en
cultivos post-descongelamiento
Testear los protocolos de congelamiento y establecer pautas de
validación y control de calidad

Lineamientos establecidos:
Se recomienda evitar el uso de protocolos de congelamiento subóptimos
(menor número de pasos, crioprotectores menos confiables)
Se establecieron los niveles mínimos aceptables de viabilidad post
descongelado en un 10 a 60 %
Pero se recomiendan viabilidades mayores al 60 % como estándares, ya
que ello, junto con el congelar grandes poblaciones, minimiza el riesgo de
seleccionar variantes genéticamente tolerantes al congelamiento.
Aumento del número de cepas criopreservadas dentro del proyecto COBRA:
1500 cepas nuevas del 2002 al 2005.

CCAP (UK): algas y protozoos (+ 2500 cepas)

UTEX (EEUU): Univ. Texas (3000 cepas)
SAG (Alemania): Univ. Göttingen (+ 2400 cepas)
NCMA (EEUU): fitoplancton marino (+ 2500 cepas)
ACOI (Portugal): Univ Coimbra (+ 2000 cepas)
ASIB (Austria): Inst Botánica Insbruck (+ 2000 cepas)
RCC (Francia): Colec cultivos de Roscoff (+ 1300 cepas)
UHCC (Finlandia): Cyanobacteria Univ Helsinski (aprox 1000 cepas)
ATCC (EEUU): Colec americana de cultivos tipo
NIES (Japón): cultivos microbianos Inst Nac de Estudios Ambientales (+
2500 cepas)
PCC (Francia): Cyanobacteria Inst Pasteur (+ 800 cepas)
CSIRO (Australia): Collection of living microalgae (aprox 800 cepas)
Colec Cultivos Univ. Leningrado (Rusia): (aprox 700 cepas)
 Cultivos en nuestro país
Algunas iniciativas de desarrollo de cultivos de algas
 Colección de cultivos del Laboratorio de Microalgas de la Facultad
de Ciencias Naturales Sede Trelelew – Chubut (Univ. Nacional de la
Patagonia San Juan Bosco) (Prof. Isabel Albarracín).

 Colección de cultivos de microalgas del Laboratorio de Ficología

(DBBE, FCE-N, UBA) (Dr. Vélez)

 Cultivos de Euglenophyta y microalgas verdes de agua dulce,

incluyendo Volvocales (Lab. Protistas, DBBE, FCE-N, UBA) (Dres.
Conforti, Solari, Juárez)

 Cultivos de cepas marinas y de agua dulce del Lab. Estudios

Básicos y Biotecnológicos en Algas y Hongos y Lab. Ficología y
Micología, Dto. Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad
Nacional del Sur, Bahía Blanca (Dra. Leonardi y Dr. Cáceres)

Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Cs. Exactas de la Universidad

Nacional de La Plata, laboratorio dirigido por la Dra. Gianuzzi y el Dr. Andrinolo,
 Trabajo Práctico:
Técnicas de Cultivo de
Microalgas
 Técnicas de cultivos en microalgas
• Muchos estudios necesitarán desarrollar cultivos de
microalgas a escala de laboratorio.
• Normalmente se busca optimizar su crecimiento
(estudio de requerimientos de la especie utilizada).
• El tipo de estudio a realizar condiciona el medio de
cultivo a utilizar y el tipo de cultivo a desarrollar.
• El primer paso para el desarrollo de cultivos es el
aislamiento

• DE ESO NOS OCUPAREMOS EN EL TP

 Técnicas de cultivos en microalgas
Macronutrientes (Mg, Ca, K, Na, S, N, P, C)
Micronutrientes (Fe, Zn, Cu, Mn, Mo, Co, Vn)
Minerales definidos
Quelante (EDTA, ác. Nitrilotriacético)
Medios de cultivo

Sistema Buffer ( (Tris, Hepes, KH2PO4 - K2HPO4)

Provisión de CO2

No definidos Con extracto de levadura, peptona o medio tierra agua

Minerales definidos con

(tiamina, cianocobalamina, biotina,
agregado de glucosa, acetato)
compuestos orgánicos

Se utilizan líquidos o sólidos (agar 1,5-2%), esterilizados

 MEDIOS DE CULTIVO DE USO GENERALlZADO

SW tindalizado (Tierra-agua) (Prinsgheim): Buen crecimiento

de filamentosas (Zygnematales), Volvocales (más CaC03-y B12),
Euglenoideos (más arveja ó cebada, B12).

SW autoclavado (Tierra-agua): mismos grupos anteriores y

permite el crecimiento de Oedogoniales.

BBM (Bold's basal medium): medio mineral para algas sin

requerimientos especiales; de uso generalizado principalmente para
cultivos axénicos. Crecen muy bien las Chlorococcales.

BBMSW: BBM + sobrenadante de tierra-agua: Indicado para

algas de agua dulce en general. Bueno para Chlorococcales y microalgas
de suelo. También algunas diatomeas
 MEDIOS DE CULTIVO DE USO GENERALlZADO

JM (Jaworsky's medium): medio mineral con 3 vitaminas (B12,

tiamina, biotina).Buno para Desmideáceas, algunas Volvocales y
Diatomeas (agregar Na2Si03).

Medios minerales con fuente orgánica de carbono

(acetato de Na ó glucosa): buenos para aumentar el rendimiento de
biomasa de muchas Chlorococcales. Solo para cepas axénicas.

 Medios minerales con componentes orgánicos (peptona y

extracto de levadura): bueno para el crecimiento de Euglenoideos. Solo
para cepas axénicas.
 MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

Autoclavado (calor húmedo): 20 min. A 121ºC y 1,5

atm de presión)
Tindalizado (calor húmedo a 100ºC y presión normal):
1 hora 3 días seguidos
Filtración: membranas de 0,22 mm de poro
Radiación: sólo para material plástico (gama, UVC)
Óxido de etileno: material de plástico descartable
Estufa (calor seco): 2 horas a 170-180ºC. Sólo
material de vidrio
Métodos de aislamiento
 PURIFICACIÓN A AXENICIDAD

 Irradiación UV

 Tratamiento con antibióticos (penicilina,

cloranfenicol, NO estreptomicina)

 Tratamiento con detergente de alto peso

molecular
 TIPOS DE CULTIVOS EN MEDIO LíQUIDO A ESCALA DE LABORATORIO

 Cultivos en lote (batch): una o más especies suspendidas en un medio

acuoso. Obtención de grandes cantidades de material (Crecimiento,
bioquímica, fisiológicos,dinámica de fitoplancton y bioensayos).

 Cultivos sincrónicos: Todas las células en igual estado fisiológico

dividiéndose simultáneamente. Inducción por ciclos L -O, cambios de Tº,
niveles de nutrientes, o selección de tamaño. (÷ celular, ciclo reproductivo, vías
metabólicas).

 Cultivos continuos: Siempre en el mismo punto de la curva, rinde altas

cantidades de material homogéneo por períodos largos. (máx. producción
de biomasa o de metabolitos, estudios a largo plazo de respuesta de los
cultivos a cambios ambientales rigurosamente establecidos (luz, Tº, pH,
niveles de nutrientes, acción de inhibidores y sust. tóxicas). Puede
lograrse por renovación periódica del medio de cultivo y cosecha periódica
de células.

Importante: mantener agitación, principalmente en cocoides