TECNOLOGIA ENZIMATICA

Agente biológico #ENZIMAS: son catalizadores biológicos,

generalmente proteínas que aceleran en forma muy específica
reacciones de interés (analogía llave-cerradura).

∑S + E → [ES] → ∑ P + E
Producto final
Enzimas
Catalizadores de otros procesos
Empleo industrial de enzimas
El mercado mundial de enzimas en el 2000 ascendía a 1500 millones de
dólares, distribuidos en el uso para procesamiento de alimentos, para
alimentos de animales y otras aplicaciones tecnológicas:
-detergentes
-procesamiento
textil
-de cueros
-de papel
-alcoholes
 Textile processing
4% 10% Grain processing
4% 4%
4% 12%
Food processing
44% 18% Cleaning
Feed enzymes
Diagnostic/pharma

Otras aplicaciones: 4%
Waste management

•Se producen mediante fermentaciones microbianas.

•Su empleo más masivo es para la producción de detergentes
(proteasas, lipasas, amilasas)
•Su purificación frecuentemente requiere complicadas etapas de
separación.
Aplicaciones industriales de las enzimas
Industria Clase de Enzima Aplicación
Detergentes Proteasas Limpiar manchas de proteínas
Amilasas Limpiar manchas de almidón
Lipasas Limpiar manchas de grasas
Celulasas Limpiadores, clarificar colores (algodón)
Almidón y Amilasas Licuefacción del almidón y sacarificación
combustible Amiloglucosidasas sacarificación
Glucosaisomerasa Conversión de glucosa en fructosa
Cyclodextrin-glycosyltransferase Producción de ciclodextrinas
Xylanasas Reducción de la viscosidad
Proteasas Alimentación de levaduras (combustibles)
Alimentos Proteasas Leche, saborizantes
Lipasas Quesos
Lactasas Remoción de lactosa
Pectinasas Productos a base de frutas
Transglutaminasas Modifica las propiedades visco-elásticas
Amilasa Tratamientos de jugos y de cerveza light
Alimentos de Xylanasas Digestibilidad
animales β-Glucanasas Digestibilidad

(Fuente: Kirk et al., 2002)

Industria Clase de Enzima Aplicación
Textil Celulasas Ablandar la tela (algodón), terminaciones
Amilasas Prelavados
Catalasas Eliminar los decolorantes
Lacasas Decoloración
Peroxidasas Eliminar el exceso de colorantes
Papel Lipasas Tratamiento de efluentes
Proteasas Remoción de biofilms
Amilasas Decoloración, mejorar el drenado
Celulasas Decoloración, modificación de las fibras
Grasas y Lipasas Transesterificación
aceites Fosfolipasas Producción de lecitina
Síntesis Lipasas Resolución de alcoholes y amidas quirales
orgánica Acilasas Síntesis de penicilina semisintética
Nitrilasas Síntesis de enantiómeros puros
Cosmética Amiloglucosidasa Antimicrobiano
Glucosaoxidasa Antimicrobiano, decolorante
Peroxidasa Antimicrobiano
Cuero Proteasas
Lipasas

(Fuente: Kirk et al., 2002)

Ejemplo: procesamiento textil
Enzimas empleadas en varias de las operaciones de acondicionamiento
de las telas para producción de jeans
Operaciones de separación/purificación generalmente
empleadas en la producción industrial de enzimas

•Se generan casi siempre como

productos extracelulares.
•La formulación es necesaria
para evitar que se desnaturalice
por T, pH, (auto)hidrólisis, etc.
 Enfriado de un spray Extrudado
Formulación:
Tecnologías
para la
manufactura
de polvos y
agregados de
enzimas
Lecho fluidizado
Granulado en tambor
Polvos y agregados de enzimas obtenidos mediante las
tecnologías mencionadas
Enfriado de un spray Extrudado

Granulado en tambor Lecho fluidizado

 Fermentaciones enzimáticas
Solución
Enzimas
Inmovilizadas
Sistemas con enzimas en solución
Se emplean grandes volúmenes (ton) , deben ser de bajo costo
Su purificación debe ser sencilla o no debe interferir con el producto
Ventajas:
-pueden seleccionarse de alta o baja especificidad
-generan pocos o ningún producto secundario
-actividad óptima en condiciones de reacción muy suaves
Desventajas:
-costo generalmente más alto
-los sustratos poco solubles son difíciles de procesar
-baja estabilidad
-problemas de inhibición
Sistemas con enzimas inmovilizadas
Ventajas:
- se puede reutilizar la enzima
- no requiere proceso de recuperación y separación de la enzima del
producto.
- puede proveer un ambiente más adecuado para la actividad
catalítica de la enzima.
- la pureza del producto generalmente es mejor
- los problemas de disposición de efluentes son menores.

Desventajas:
- puede haber drenado de la enzima a la solución
- limitaciones significativas por restricciones a la transferencia de
masa
- la actividad y la estabilidad de la enzima se puede reducir
- no se pueden controlar las condiciones en el microambiente que
rodea a la enzima
Formas de inmovilizar enzimas

Métodos de
inmovilización:

(a) Union covalente

Químicos
(b) Entrecruzamiento (cross-linking)
(c) Adsorcion
(d) Retencion (entrapment) Físicos
(e) Microencapsulacion
Formas de inmovilizar enzimas
Métodos de inmovilización:
• Inmovilización en superficie
• Inmovilización por retención

Retención: La enzima queda atrapada en un espacio pequeño:

Œ matriz polimérica
Œ membrana (micro-encapsulación)

Matrices poliméricas utilizadas: alginato de Ca; agar;

carragenatos; poliacrilamida y colágeno. Algunas matrices sólidas
también pueden emplearse, adsorbiendo la enzima en la superficie
interna de la matriz: CA; cerámica porosa; tierras diatomeas.
La matriz puede quedar en forma de partícula, membrana o fibra.
Membranas: semipermeables para retener moléculas de alto
peso molecular (enzimas) y dejar pasar moléculas de bajo peso
molecular (substrato y productos);
ej.: nylon, celulosa, polisulfona y poliacrilato.

Microencapsulación: es una forma especial de inmovilización

por membrana # se forman esferas microscópicas encerradas en
una membrana que contiene la solución de enzima. La
membrana puede ser polimérica o una fase interfacial
enriquecida que se forma alrededor de la microgota.
Inmovilización en superficie
• Adsorción
• Unión covalente
Adsorción: unión de la enzima a partículas utilizadas como soporte
por fuerzas de interacción física (débiles) # El sitio activo no se
altera y la actividad catalítica es la misma que en solución pero se
desorbe fácil a la solución # puede estabilizarse por cross-linking
con glutaraldehido si no pierde actividad en el proceso.
Soportes: Al2O3, SiO2, vidrios porosos, CA, cerámicos, tierras
diatomeas, arcillas, celulosa, almidón, resinas de i.i.

Unión covalente: retención de la enzima sobre un soporte sólido

por formación de una unión covalente a través de grupos
funcionales como NH2, COOH, OH, SH. La unión no debe ser en
el sitio activo.
Cross-linking de la moléculas de enzima y/o con glutaraldehido #
forman agregados insolubles que pueden perder considerable
actividad y tener problemas de difusión importantes.

™ Criterios a considerar para elegir el método de

inmovilización:
1) La capacidad de retención de la enzima del soporte, que es
función de su carga, porosidad, grupos funcionales e
hidrofobicidad.
2) La conservación de la actividad y estabilidad de la enzima.
Depende del microambiente que se genere por la
inmovilización.
Algunas opciones para contrarrestar las desventajas de la
inmovilización:
•Utilizar membranas de corte molecular que permita pasar
moléculas de menor PM #reduce el drenado de enzima
•Trabajar con partículas o cápsulas de menor diámetro
#reduce las limitaciones difusionales que pueden ser importantes
fundamentalmente porque algunos sustratos son moléculas
grandes y hay problemas estéricos.

Propiedades que se modifican con la inmovilización:

•Actividad específica
•pH óptimo
•Coeficiente de afinidad, Km
•Selectividad
•Estabilidad
Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilización
de microorganismos es tan común como la de enzimas.
Ventajas sobre los cultivos con células en solución:
•Proveen una alta concentración de células
•Las células se usan en forma continua y se eliminan costosos
procesos de recuperación y reciclo de células
•Se eliminan el problema del “washout” a altas velocidades de
dilución
•Se pueden lograr altas productividades
•Se puede lograr un medio local favorable que conduce a mayores
rendimientos y una mejor performance del biocatalizador
•En algunos casos mejora la estabilidad genética
•En algunos casos disminuye el daño por abrasión de las células
Sistemas con microorganismos inmovilizados
Desventajas respecto de los cultivos en solución:
•El problema más grave es que no se pueden emplear para
productos que no sean excretados de las células
•La inmovilización generalmente conduce a problemas de
limitaciones por transferencia de masa
•El sistema se torna muy heterogéneo por las limitaciones de
transporte y es difícil de controlar
•Si las células están vivas, el crecimiento y la evolución de gases
ocasiona problemas y puede conducir a ruptura del soporte.

Los métodos de inmovilización son similares a los que se utilizan

para enzimas. Se complica con las células vivas.
 Activa: captura o unión de células por
Inmovilización métodos físicos o químicos
Pasiva: formación de biofilms, crecimiento
de múltiples capas de células sobre un
soporte sólido

•También se pueden emplear reactores de membrana, generalmente

tubulares (la estructura se asemeja a un intercambiador de calor de
carcasa y tubos). Los tubos son de una membrana semipermeable.
Las células se inoculan en la carcasa y el sustrato se bombea por
los tubos, a los cuales difunde el producto.
•Un buen soporte debe ser rígido y químicamente inerte; debe
contener a las células firmemente y tener alta capacidad.
Inmovilización pasiva (biofilms):
Los biofilms son grupos de células que crecen en multicapas sobre
soportes sólidos.
•El soporte puede ser inerte o biológicamente activo.
•La formación de biofilms es común en equipos de fermentación
industriales (ej: tratamiento de efluentes y fermentaciones de hongos).
La interacción entre las células y el soporte puede ser muy compleja.
•Los biofilms presentan ventajas y desventajas similares a las de los
sistemas de microorganismos inmovilizados en forma activa.
•Las condiciones dentro de un biofilm grueso varían con la posición y
afectan la fisiología de las células porque los nutrientes difunden
hacia el interior del film y los productos hacia fuera.
•El espesor del biofilm afecta la performance: biofilms muy finos van
a dar baja velocidad de crecimiento por la baja concentración de
biomasa y los muy gruesos tienen problemas difusionales, que pueden
ser o no un inconveniente, dependiendo de lo que se quiera lograr.
Normalmente existe un espesor de film optimo para el crecimiento de
biomasa y otro para la formación de productos.
Fermentadores o biorreactores con enzimas:
- Similares a los empleados con células y microorganismos.
- Su diseño es equivalente al de un reactor químico catalítico
(homogéneo/heterogéneo) #se emplea toda la información
existente y en desarrollo sobre reactores químicos
convencionales. La ecuacion de diseno resulta del balance de
masa para sustrato o producto, considerando la cinetica de
Mikaelis-Menten.
- Diferencia con catalizadores químicos: el catalizador (la enzima)
se desactiva fácilmente con la T.
- En reactores con enzimas o microorganismos inmovilizados, se
debe tener en cuenta el efecto de las limitaciones al transporte (a
través de un factor de efectividad en la expresión cinética) y de la
distribución de las fases (modelos fluidodinámicos para describir
el movimiento del sólido).
Fermentadores: Equipos comúnmente empleados
•Tanques agitados
•Columnas de burbujeo
•Air-lift o reactor de arrastre
•Lechos rellenos
H/D~3–6
Esquema de un tanque agitado

Esquema de una
columna de burbujeo
H/D~1–2
Tanque agitado de
escala laboratorio
 Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2-20 litros)

Global Medical Instrumentation – http://www.gmi-inc.com

Fermentadores de escala banco-piloto (V ~ 15-75 litros)
Fermentadores de
escala piloto
V ~ 100-1000 litros
Esquema de un tanque
agitado de mayor escala
Variables que se controlan en un biorreactor industrial
Esquema de un fermentador
tipo tanque agitado de escala
industrial (100m3).

H ~ 15 m de alto
D ~ 4,2 m de diámetro

Tiene líneas de vapor

para realizar la
esterilización in situ de
las válvulas, cañerías y
sellos. Se debe esterilizar
también el aire que
ingresa por filtración o
por calentamiento.
Reactor tanque agitado: tipos de turbinas empleadas y efectos en la
agitación que inducen

Agitación inducida por turbinas Agitación inducida por turbinas

radiales del tipo Rushton axiales
Reactor tanque agitado: efecto de los baffles
Los baffles mejoran notablemente la turbulencia, rompen los vórtices
que se forman por la agitación. Se los ubica levemente desplazados
de la pared para disminuir la formación de zonas estancas.
Reactor tanque agitado: efecto de los baffles en un reactor de 2L
400rpm – sin baffles 400rpm – con baffles

vórtice
Reactor tanque agitado:
Problemas ocasionados por
la evolución de espuma:
-peligro de contaminación
-complica la circulación de
gases vórtice
-complica el mezclado
-cambian las velocidades
de transferencia masa y de
calor
Configuraciones comunes de fermentadores: columnas de burbujeo
Columna de burbujeo de escala banco: V~10L
Configuraciones comunes de fermentadores
Configuraciones de recirculación interna inducida por el flujo de
aire “Air-lift”

Air-lift con Air-lift con inserción

inserción de de aire en el anillo y
aire en el Air-lift con inserción de aire en
mezclado en el tubo
tubo central el tubo central y recirculación
central
inducida
 Reactor air-lift de
laboratorio con entrada de
aire en el anillo circular
Fermentaciones en fase sólida: Son fermentaciones sobre sustratos
sólidos con muy bajo nivel de humedad ,baja actividad de agua.
El contenido de agua varía entre 40 y 80%, mientras que para una
fermentación en solución, es del 95%.
Son muy apropiadas para cultivos de hongos, muchas de ellas para
producción de antibióticos. Como las bacterias y levaduras no
toleran la baja actividad de agua, este método evita contaminaciones
Se usan mucho en Asia para fermentaciones de alimentos
(producción de salsa de soja o de mijo; producción de enzimas).
Ventajas:
•Menor volumen de los reactores, que implica menores costos
•Menor probabilidad de contaminación por bajo contenido de agua
•Fácil separación del producto
•Alta eficiencia energética
•Permite la formación de estructuras totalmente diferenciadas.
Fermentaciones en fase sólida
Desventajas:
•Naturaleza altamente heterogénea del sistema por el mezclado que
es pobre o nulo
•Son difíciles de controlar (pH, CO2, T)
•Si se mezclan (continua o intermitentemente) para atenuar los items
anteriores, se pueden dañar las micelas, especialmente para altas
velocidades de agitación

Sustratos empleados: granos o subproductos agroindustriales, como

bagazo de caña de azúcar, salvado, paja o cáscara de trigo, de arroz,
de maíz, de soja; mosto del prensado de aceites; aserrín; harina de
trigo o de maíz; arroz o almidón parcialmente gelatinizados con
vapor; residuos celulósicos; etc. La selección del sustrato depende
fundamentalmente de su costo y disponibilidad y de su capacidad de
retener el cultivo. Pueden requerir un pretratamiento químico o
mecánico para facilitar el crecimiento de los microorganismos.