Purificación de proteínas:

1.- la molécula que buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a

concentraciones muy bajas. En este tema se presenta una visión general de las técnicas más
usuales empleadas para la purificación de proteínas, aunque muchas de ellas son aplicables a
la separación de la mayoría de las moléculas biológicas.

2. Métodos de rotura celular y extracción de proteínas El primer paso en el aislamiento de una

proteína es la rotura celular, para posteriormente poder extraer la proteína con un tampón
adecuado. El método de rotura a elegir depende de las características mecánicas del tejido o
células de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización. Entre los distintos
métodos ellos están:

- Lisis celular. Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales,
pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en suspender las
células en una solución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la
diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento
y rotura.
- Destrucción mécanica. Entre estos métodos se encuentran la homogenización (hacer
pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente);
moler en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas de vidrio, la prensa de
French (que hace pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la
sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido).
- Congelación-descongelación. La rotura se produce al someter las células a un cambio
brusco de temperatura, congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y
pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25 ºC). Tras la rotura o bien, si se
requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extracción para
solubilizar las proteínas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de
tampones específicos para proteínas solubles o bien que contengan además
detergentes si se pretende purificar proteínas asociadas a membranas, si bien en este
caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice. Una vez que la proteína se ha
extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla.
Los cambios bruscos de pH, ácidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la acción
de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos) son los principales
factores que pueden desnaturalizar las proteínas. Para evitar o minimizar estos
factores la manipulación de las proteínas durante el proceso de purificación suele
llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4ºC) y se procura
que el proceso sea lo más corto posible, además en ocasiones es necesarioañadir el
tampón de extracción agentes protectores de grupos funcionales específicos de la
proteína o bien inhibidores de proteasas. El resultado de todos estos tratamientos es
un lisado u homogenado que contiene una mezcla de enzimas, membranas y células
rotas. Esta preparación se somete a centrifugación (10.000 – 15.000 rpm) para
eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las proteínas
solubles, del precipitado que además de restos celulares también contienen proteínas
asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con
detergentes. En cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente) constituye el
extracto crudo donde se encuentra la proteína de interés objeto de la purificación. A la
hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrífuga sea refrigerada,
balancear los tubos y asegurarse siempre que los rotores estén fijos. Para purificar una
 proteína es imprescindible tener un método para detectar cuantitativamente su
presencia. Es deseable que este método sea específico y fácil de llevar a cabo. En este
sentido es mucho más cómodo trabajar con enzimas, pues se detectarían mediante su
ensayo de actividad, en caso de purificar proteínas no enzimáticas, se requieren
métodos de selección más específicos.
- 3. Métodos cromatográficos para separación de proteínas Las separaciones
cromatográficas se basan en las diferencias de carga, tamaño o afinidad de las
diferentes proteínas. Uno de los métodos más habitualmente utilizados para la
separación de proteínas es la cromatografía en columna, aunque también existe la
cromatografía en papel y en placa.
La columna está rellena con un material sólido con las características químicas
adecuadas (fase estacionaria), y una solución tamponada se hace pasar a través de la
columna (fase móvil). El extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y
va poco a poco entrando en la columna con la fase móvil. Cada proteína migrará a
distinta velocidad según su grado de afinidad por la fase estacionaria.
Generalmente estas cromatografías se realizan de una forma semiautomática, la fase
móvil se hace pasar a la columna a través de una bomba peristáltica y un colector de
fracciones va recogiendo el eluyente que sale de columna. Este colector hace que el
tubo vaya cambiando cada cierto número de gotas o de volumen. Después hay que
localizar en que tubo o tubos está la proteína que se pretende purificar. Existen
distintos tipos de cromatografías en tres ellos:
• La filtración o exclusión molecular
• El cromatografía de intercambio iónico
• La cromatografía hidrofóbica
• La cromatografía de afinidad

- Filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular. La fase estacionaria esta

constituida por partículas de polímeros de diferente porosidad. La separación se basa
en el tamaño de las partículas. Las proteínas más grandes que no pueden penetrar en
los poros de las partículas de la matriz de filtración son eluidas con más rapidez que las
proteínas más pequeñas que penetran por los poros de las partículas y siguen un
camino más tortuoso y más largo. El tamaño de los poros internos depende de la
naturaleza del polímero en cuestión, y permite la entrada a proteínas por debajo de un
determinado peso molecular.
- Cromatografía de intercambio iónico. En ella, la columna está rellena con un soporte
al que van unidos grupos cargados positivamente (intercambio aniónico) o
negativamente (intercambio catiónico). Estos grupos cargados normalmente están
neutralizados por iones del tampón. Estos iones son reversiblemente reemplazados
por las proteínas con más tendencia a unirse al soporte. Las proteínas cargadas
pueden por lo tanto unirse a intercambiadores catiónicos o aniónicos dependiendo de
su carga neta. Las proteínas más cargadas se unirán más fuertemente al
intercambiador y por lo tanto serán más difíciles de eluir. La afinidad con la que una
proteína se une a un intercambiador iónico depende de la fuerza iónica del medio,
debido a la competencia entre los grupos cargados de la proteína y los iones de la fase
móvil.
Una vez pegadas las proteínas, para eluirlas (retirarlas) de la columna, se suele ir
subiendo la fuerza iónica de la fase móvil (aumentando la concentración de sal, NaCl),
de esta forma se eluyen primero las proteínas mas débilmente retenidas y cuando la
 fuerza iónica sea mayor saldrán las proteínas más cargadas y por lo tanto más
retenidas
- Cromatografía hidrofóbica. Se trata de un método similar al anterior con la única
diferencia de que la fase estacionaria es apolar (hidrofóbica), es decir, la proteína se
pega al soporte por los resto de aminoácidos apolares, cuanto más residuos de este
tipo tenga en su superficie, más apolar será, más se retendrá en la columna y se eluirá
más tarde. En este caso a elusión se realiza aumentando la apolaridad de fase móvil.
- Cromatografía de afinidad. Muchas proteínas tienen la capacidad de unirse
específicamente a ciertas moléculas, mediante uniones fuertes, pero no covalentes. En
esta técnica la molécula que se une específicamente a la proteína se conoce con el
nombre de ligando y se une covalentemente a una matriz inerte. Cuando el extracto
con la mezcla de proteínas se aplica a la columna, la proteína buscada se unirá al
ligando inmovilizado mientras que las demás saldrán de la columna con el tampón. En
este caso también se utiliza el incremento de fuerza iónica para eluir las proteínas.
Todos estos sistemas pueden automatizarse, en base a sistemas cromatográficos tales
como el FPLC, en el que se hace uso de bombas de alta presión (100-400 bares) y
columnas con materiales que soportan altas presiones. Este sistema reduce
notablemente los tiempos de purificación y utilizan fases estacionarias con mayor
poder de retención, lo que se incrementa los porcentajes y rendimiento de las
purificaciones.
FPLC: Cromatografía líquida de separación rápida de proteínas
- 4. Métodos electroforéticos Para comprobar si la proteína de interés se ha separado
del resto, es decir si la proteína está pura, se requieren las técnicas electroforéticas. La
electroforesis de proteínas se lleva a cabo generalmente en geles de poliacrilamida. Se
trata de geles porosos, cuya porosidad se puede regular en función de la
concentración de acrilamida.
Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migración de las proteínas es un
campo eléctrico, y el gel actúa como filtro molecular, ralentizando la migración de las
proteínas en función de su relación carga/masa. A diferencia de lo que ocurría en la
cromatografía de filtración, en las electroforesis las proteínas mayores son retardadas
y se mueven más lentamente a través del gel, ay que las va frenando el tamaño del
poro y las proteínas más pequeñas avanzan más rápidamente.
En la figura vemos un típico aparato de electroforesis. El gel se encuentra entre dos
placas (normalmente de vidrio). La colocación de un peine de electroforesis en la parte
superior antes de que la acrilamida gelifique permite la formación de unos pocillos,
donde se colocarán posteriormente y una vez retirado el peine, las muestras, que se
desplazarán por calles paralelas al aplicar el campo eléctrico.
Las muestras de proteína se disuelven en una pequeña cantidad de una solución
tampón, que contiene glicerol, que hace que la muestra se sitúe en el fondo del pocillo
y un colorante azul (azul de bromofenol) de pequeño peso molecular que nos indica
migración del frente. El tampón de electroforesis cierra el circuito entre el cátodo (+) y
el ánodo (-). El sistema se conecta a una fuente de alimentación y las proteínas migran
hacia el polo positivo, situado en la base del gel.
Después el gel se saca del recipiente que lo contiene y se incuba en presencia del
colorante adecuado (azul de Coomassie), que tiñe por completo el gel. A continuación
se destiñe con una disolución de etanol/acético y el gel queda transparente y las
bandas de proteínas quedan teñidas de color azul.
Existen dos tipos principales de electroforesis, en condiciones Nativas las proteínas se
separan en función de su carga/masa; y en condiciones desnaturalizantes la
electroforesis se realiza en presencia de un detergente, el SDS (dodecil sulfato sódico).
El SDS es un detergente aniónico, que se une a todas las proteínas en la misma
proporción formando una especie de micela cargada negativamente. La gran carga
negativa del SDS enmascara la carga intrínseca de las proteínas, con lo que éstas se
separan solo en función de su masa e independientemente de su carga. El único
inconveniente de esta técnica es que el SDS desnaturaliza las proteínas y las proteínas
multiméricas se separan en sus subunidades. Las electroforesis en SDS además de
permitir calcular el peso molecular de las cadenas polipeptídicas, nos indican las
distintas subunidades que posee la proteína.
Generalmente la proteína interés se analizan incluyendo calles con marcadores
moleculares, que son proteínas de peso molecular conocido que nos permiten
determinar el peso molecular de la cadena polipeptídica, como se muestra en la
siguiente figura.
En la calle 1 se encuentran los patrones de peso molecular conocido, en la calle 2 se
encuentra la proteína sujeta a estudio, de tal manera que se puede hacer una relación
lineal entre el Log del peso molecular de las proteínas y la distancia que recorren en el
gel (Rf=distancia de la banda/distancia del frente).
La siguiente figura nuestra la diferencia entre las electroforesis nativa (NATIVAPAGE) y
la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE). Como se aprecia en la figura una banda
en la Nativa, puede dividirse en varias en SDS, si la proteína tiene varias subunidades
de distinto peso molecular, o bien en una banda de menor peso molecular, si las
subunidades poseen el mismo peso molecular. De la figura se deduce que, la proteína
está pura (pues solo aparece un banda) y que además posee 2 subunidades de 15000
g/mol (o lo que es lo mismo 15 kDa ) cada una.
CROMATOGRAFÍA:
Definición:

La cromatografía es un método físico de separación en el que los

componentes que se han de separar se distribuyen entre dos fases, una de
las cuales está en reposo (fase estacionaria, F.E.) mientras que la otra
(fase móvil, F.M.) se mueve en una dirección definida.

Hay 3 métodos principales de cromatografía: frontal, de desplazamiento y

de elución. Sólo consideraremos este último, que es el más habitual, al
menos en Bioquímica y Biología Molecular.

Clasificación de las técnicas cromatográficas

1. De acuerdo con la forma del lecho cromatográfico:

1.1 Cromatografía plana

Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en capa fina”
o “en capa delgada” porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y
rígido.

Disposiciones
experimentales para
Cromatografía ascendente en realizar una
capa fina cromatografía en papel
descendente (izqda.) y
ascendente (dcha.).
 Cromatografía ascendente en
capa fina: colocación de una
muestra (con 3 componentes),
desarrollo de la cromatografía
y revelado del cromatograma.
Rf es el factor de retardo o
retraso, que mide la movilidad
relativa de cada componente
con respecto al máximo
posible, la distancia recorrida
por el frente de fase móvil.
Componente 1: Rf = a / D
Componente 2: Rf = b / D
Componente 3: Rf = c / D
1: aplicación de la muestra
2: se sumerge el extremo
inferior en la fase móvil
3 a 5: la fase móvil asciende
por capilaridad y se va
produciendo la separación de
los componentes
6: se marca el frente de
avance del disolvente y se
deja secar la placa
7: revelado de los
componentes ya separados y
medida de su avance

1.2 Cromatografía en columna

F.M. líquida, F.E. sólida: columnas de varios mm de diámetro

y varios cm de longitud.
F.M. gas, F.E. sólida: columnas de unos 5 mm de diámetro y
1-20 m de longitud.
F.M. gas, F.E. líquida: columnas “capilares”, con menor
diámetro y 30-100 m (incluso más) de longitud.

Puede verse una animación del avance de las moléculas por la

columna.

Funcionamie
nto de una
columna,
mostrando la
carga de la
muestra y
diversos
momentos a
lo largo de la
elución:

1. Muestra
depositad
a sobre el
lecho
cromatog
ráfico
2. La
muestra
penetra
en el
lecho
3. Se añade
fase
móvil
4. Comienza
la
separació
n de los
compone
ntes de la
muestra

7. Eluye el
primer
compone
nte

9. Eluye el
segundo
 compone
nte

2. De acuerdo con el estado físico de las fases

fase móvil
líquida gaseosa
“cromatografía “cromatografía
líquida” de gases”
Cromatografía Cromatografía
sólida
fase líquido-sólido gas-sólido
estacionaria Cromatografía Cromatografía
líquida
líquido-líquido gas-líquido

2.1 Cromatografía de gases

Con fase móvil gaseosa.

 Cromatografía gas-líquido
 Cromatografía gas-sólido

2.2 Cromatografía líquida

Con fase móvil líquida.

 Cromatografía líquido-líquido
 Cromatografía líquido-sólido

2.2.1 HPLC

Cromatografía líquida de alta presión o de alta eficacia

(cuando se emplean particulas de fase estacionaria muy
pequeñas y una presión de entrada relativamente alta).
[HPLC, de High Pressure Liquid Chromatography / High
Performance Liquid Chromatography]

3. De acuerdo con el mecanismo de

separación
Nota: Ésta es una clasificación conceptual; en la práctica, el
mecanismo que rige la separación puede ser mixto; p.ej.,
adsorción+reparto.
3.1 Cromatografía de adsorción

(atención: es adsorción, no absorción)

Diferente afinidad de adsorción de los componentes de la

muestra sobre la superficie de un sólido activo. La adsorción
es la capacidad de las superficies para fijar moléculas.

La F.E. es siempre sólida. Ejemplos: alúmina, gel de sílice,

carbón activo, fosfato cálcico, hidroxiapatito...

3.2 Cromatografía de reparto

Diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la
fase estacionaria (caso de la cromatografía de gases), o
diferentes solubilidades de los componentes en las fases
móvil y estacionaria (caso de la cromatografía líquida).

Ejemplos: en cromatografía plana, la F.E. es el agua o

disolvente asociados a la celulosa (papel) o al soporte sólido
que forma la capa fina; en columna, como F.E. se usan tierra
de diatomeas, gel de sílice, celulosa en polvo...

3.3 Cromatografía de intercambio iónico

Diferente afinidad de los componentes de la muestra para el
intercambio de iones. ¿Qué significa intercambio de iones? La
F.E. posee carga eléctrica y por ello interacciona con los
componentes de la muestra que tienen carga opuesta.

 Intercambio aniónico: F.E. con carga positiva,

une aniones, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de
la muestra (de ahí la palabra intercambio).
 Intercambio catiónico: F.E. con carga negativa,
une cationes, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de
la muestra.

Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos

covalentemente a la F.E. sólida):

intercambiadores intercambiadores
catiónicos aniónicos
 carboxilato
dietilaminoetilo (DEAE)
sulfonato
dietil-(2-
fosforilo
hidroxipropil)aminoetilo
carboximetilo (CM)
polietilenimina
sulfopropilo (SP)

La F.E. suele llamarse “resina” (de intercambio iónico).

Puede verse una animación de una cromatografía de

intercambio aniónico.

Las biomoléculas poseen frecuentemente varios grupos

ionizables, de modo que su carga eléctrica neta depende del
pH del medio en el que se encuentran (es decir, la F.M.).

3.4 Cromatografía de exclusión

También se llama de exclusión molecular. Estrictamente, se
basa en diferencias de tamaño, forma o carga entre las
moléculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo
más habitual es aprovechar las diferencias de forma y
tamaño. En este caso, se la llama también cromatografía de
exclusión por tamaño, de filtración en gel, de permeación en
gel o de tamiz molecular.

Esquema
de la
separació
n de
moléculas
de
distinto
tamaño
durante
una
cromatog
rafía de
exclusión.

Pulsando entrada de fase

sobre la móvil
detector
imagen
 de la columna
cromatográfica
columna con
a la relleno poroso
derecha señal
se
mostrará
el aspecto
en detalle
del
relleno,
que
ilustra el
diferente
acceso de
las
moléculas
a los
poros
dependie
ndo del
tamaño
de
aquéllas.

Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía

de exclusión.

Ejemplos: para la separación de proteínas y polisacáridos se

usan como F.E. polímeros lineales entrecruzados (es decir,
que forman enlaces transversales). Los más comunes son
dextranos (marca comercial: Sephadex), agarosa
(Sepharosa y Biogel A) y poliacrilamida (Biogel P). Estos
materiales, en forma de pequeñas esferas, se expanden o
hinchan al sumergirlos en disoluciones acuosas, generando un
retículo o matriz tridimensional, con poros de tamaño
definido.

Aplicaciones:

 Para la purificación de una proteína (al igual que otras

técnicas cromatográficas).
  Se puede establecer una correlación entre el tamaño
molecular y la movilidad en la columna de exclusión, por
lo que esta técnica se emplea para determinar masas
moleculares. Dicha correlación es aproximadamente
lineal pero sólo dentro del llamado “intervalo de
fraccionamiento” o “intervalo de resolución” propio del
tipo de F.E. empleado.
 Para eliminar sustancias de pequeño tamaño molecular
de una muestra proteica (p.ej., las sales inorgánicas en
un “desalado” de la muestra, eliminación del exceso de
reactivos tras tratar una proteína en el laboratorio,
eliminación de inhibidores enzimáticos,...). El resultado
es similar a una diálisis, pero más rápido.
 (más aplicaciones en Freifelder, 1991)

3.5 Cromatografía de afinidad

Variedad particular de cromatografía en la que la separación
se basa en la especificidad biológica singular de interacción
entre un componente de la muestra y otra molécula unida a
la F.E.; los ejemplos más comunes son las interacciones
enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo y ligando-receptor.

F.E.: un soporte inerte (microesferas de vidrio o plástico, gel

de agarosa, ...) al que se une covalentemente el ligando de
afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o
cofactor de una enzima, anticuerpo, antígeno, hapteno,
sustancia transportada, hormona, oligosacáridos, lectinas
(proteínas con afinidad por oligosacáridos)...

Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía

de afinidad.

4. Algunas técnicas especiales

4.1 Cromatografías de fase normal y de fase invertida

Fase normal: cuando la F.E. es más polar que la F.M.

Fase invertida: cuando es más polar la F.M.

[Nota: se suele ver el término "fase reversa", expresión
incorrecta que debe evitarse (la normativa IUPAC indica que
en inglés debe decirse Reversed Phase y no Reverse Phase).]

4.2 Análisis isocrático

La composición de la fase móvil permanece constante a lo
largo del proceso de elución.

4.3 Elución con gradiente

La composición de la fase móvil se cambia, de forma continua
o en etapas, a lo largo del proceso de elución
(respectivamente, gradiente continuo y gradiente escalonado
o en etapas).

4.4 Cromatografía bidimensional

Una vez separados los componentes de la muestra, parte de

ellos o todos se someten a etapas adicionales de separación
bajo diferentes condiciones, en otra columna o, en el caso de
la cromatografía plana, en dirección perpendicular.

Ejemplo: Huellas dactilares estudio de proteínas (Freifelder-

193ss)

Etapas en la realización de una

cromatografía
Cromatografía plana
Cromatografía en columna
(papel o capa fina)
1.- Preparación del
1.- Preparación del soporte y fase
soporte y fase
estacionaria.
estacionaria.
1.1.- Equilibrado de la columna.
2.- Aplicación de la
2.- Aplicación de la muestra. muestra.
Secado.
3.- Elución: 3.- Desarrollo de la
a) Lavado de componentes no cromatografía.
 retenidos.
b) Liberación, desplazamiento o
elución propiamente dicha de los
componentes retenidos.
4.- Recolección de fracciones o 4.- Secado de la
análisis del efluente en continuo. placa.
5.- Revelado y
5.- Análisis, cuantificación o
cuantificación en su
revelado.
caso.
6.- Regeneración de la fase
estacionaria.

Recogida del efluente

El efluente de una columna se suele
recoger en forma de pequeñas
porciones o fracciones, comúnmente
con la ayuda de un dispositivo
mecánico llamado colector
de fracciones.

Esquema de un colector de fracciones.

En cada tubo cae un número
determinado de gotas o un cierto
volumen. A continuación el soporte
gira, de modo que el tubo siguiente
queda colocado bajo la salida del
efluente. Las gotas se detectan
mediante una célula fotoeléctrica;
cada gota interrumpe el haz de luz y
así se cuenta.

Detección
Los componentes de la muestra separados se detectan en el
efluente:

a. Mediante su análisis en continuo. Por ejemplo:

o midiendo absorbancia a 280 nm para proteínas
o midiendo absorbancia a 260 nm para ácidos
nucleicos
 o midiendo radiactividad
b. O bien mediante el análisis de las fracciones una vez
recogidas.
o cualquier tipo de análisis (absorbancia,
radiactividad, ensayo enzimático, ensayo
biológico...)