Apostila de Aulas Práticas

Introdução à Biologia Molecular

Biomedicina 4º semestre/2017

Profa. Dra. Aline T. Toneto Inocêncio

Metrocamp – Campinas
Objetivos da disciplina:

 Fundamentar os conceitos básicos e elementares da biologia molecular

 Entender a necessidade de estudar genômica e a atividade do nosso genoma

nas células

 Apresentar e inteirar os alunos dos próximos passos da biologia molecular e seu

impacto na sociedade

CONTEÚDO PROGRAMÁTICO

I. Apresentação Biologia Molecular

II. Revisão de Biologia Celular

III. Introdução à estrutura dos ácidos nucléicos

IV. Ciclo celular e Replicação do DNA

V. Transcrição do DNA e processamento de mRNA

VI. Código Genético

VII. Tradução e síntese de proteínas

VIII. Introdução ao controle da expressão gênica

IX. Transferência horizontal de genes, Mutação e recombinação

X. Exposição de métodos elementares em biologia molecular.

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Bibliografia Básica

1. Alberts B. et al. Fundamentos da Biologia Celular. 2ª edição. Porto Alegre:

Artmed, 2006.
2. Griffiths A. J. F. et al. Introdução à Genética. 7ª edição. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2000.
3. De Robertis, E. M. F, et al. Bases da Biologia celular e molecular. 3a edição. Rio
de Janeiro:Guanabara Koogan, 2001.

Bibliografia Complementar
I. Brown, T. A. Genética: um enfoque molecular. 3ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1999.

II. Karp, G. Biologia celular e molecular. Conceitos e experimentos. Ed. Manole, 2005.

III. Junqueira, L.C.U.; Carneiro, J. Biologia celular e molecular. 9ª edição. Ed.

Guanabara Koogan, 2015.

IV. Alberts, B. Biologia molecular da célula. 3ª edição. Editora Artmed, 1997.

V. Zaha, A. Biologia molecular básica. 3ª edição. Porto Alegre: Mercado Aberto, 2003.

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SUMÁRIO

Planejamento em laboratório de biologia molecular........................... pág. 04

Introdução ao laboratório de Biologia Molecular................................. pág. 06

Preparo de Soluções e cálculos em Biologia Molecular.........................pág. 10

Extração de DNA genômico bacteriano..................................................pág. 11

Diagnóstico e Identificação pela técnica de eletroforese.......................pág. 12

Eletroforese de DNA................................................................................pág. 16

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)..................................................pág. 18

Dosagem de DNA por espectrofotômetro...............................................pág. 19

Fases do Ciclo Celular...............................................................................pág. 21

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 Planejamento em laboratório de biologia celular e molecular.

Profa. Aline Toneto Inocencio

A pré-execução e execução de projetos e experimentos.

Alunos sejam bem-vindos ao laboratório de biologia molecular. Seguir determinadas regras

dentro de um laboratório é essencial para minimizar acidentes e assegurar o bom desempenho
do experimento. Antes de iniciar qualquer atividade dentro do laboratório, certifique-se que
está de acordo com as observações a seguir. As mesmas valem para familiarização com o
futuro ambiente de trabalho.

1. O uso de jaleco de manga comprida, calça comprida e sapatos fechados são obrigatórios
dentro do laboratório. Além do uso de outros EPI´s (equipamentos de proteção individual)
como, por exemplo, óculos de proteção (principalmente ao manipular reagentes), usar cabelos
presos, etc. Deve-se evitar levar à bancada mochilas, celulares, tablets. Estes deverão ficar em
sala ou armário indicado. Caderno e caneta para anotação do procedimento (ou algum
material que seja solicitado de acordo com a técnica) é suficiente.

2. Ler com atenção as instruções e roteiros desenvolvidos pelo professor/técnico responsável

antes de realizar qualquer procedimento.

3. Providenciar um plano de uso de equipamentos e cronograma: controle geral da demanda

pela equipe, tempo de execução, etc.

4. É de sua responsabilidade planejar junto à equipe as atividades que serão desenvolvidas

para que não falte reagentes, etc durante a execução do projeto/experimento; uma vez que
tais reagentes já foram previamente separados pelo técnico/professor responsável.

5. A limpeza do laboratório também é seu compromisso. As bancadas utilizadas em Biologia

Molecular devem ser limpas antes e depois de usá-las com papel toalha e álcool 70%.

6. Execute suas atividades com atenção, calma, seriedade e responsabilidade.

7. Atenção e cuidado com a manipulação de reagentes e materiais químicos e biológicos

seguindo sempre protocolos em biologia molecular.

8. O uso de reagentes tóxicos e voláteis deve ser realizado dentro da capela de exaustão.

9. Qualquer material em uso ou previamente preparado deve ser devidamente identificado e

rotulado com nome do reagente/amostra, concentração molar, nome da equipe (ou
responsável pelo preparo) e a data.

10. O uso de equipamentos deve ser realizado com ajuda do professor e/ou técnico
responsável, observando o manual de instruções principalmente quando utilizado pela
primeira vez. Além disso, deve-se evitar a operação de equipamentos elétricos sobre
superfícies úmidas e inadequadas.

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11. Não confiar totalmente na automação de equipamentos, verificando periodicamente o
experimento. Desligar equipamentos após o uso quando este estiver sob sua
responsabilidade.

12. Para sua segurança (em laboratório de aula prática) os reagentes e amostras utilizadas
serão descartadas pelos técnicos ou professor responsável. O descarte inadequado pode ser
perigoso tanto para sua saúde, quanto ao meio ambiente. Antes de ser descartado deve-se
saber se há necessidade de tratamento prévio do material.

13. Avarias e extravios devem ser comunicados ao técnico ou professor.

- A qualidade das amostras utilizadas em biologia molecular depende principalmente de duas

principais variantes: o tempo e a temperatura. O cuidado com as amostras proporciona a
integridade dos ácidos nucléicos e a eficiência no diagnóstico e pesquisa.

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AULA 1 - INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

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Materiais utilizados:

- Pipeta P2

- Pipeta P10

- Pipeta P20

- Pipeta P100

- Pipeta P5000 e/ou P10 mL

- Ponteiras 10 uL, 100 uL, 1 mL, 5 ou 10 mL

- Água

- Béquer e frascos

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 Aula 2- PREPARO DE SOLUÇÕES EM BIOLOGIA MOLECULAR

O conhecimento sobre cálculos básicos na preparação de soluções é de extrema importância

em um laboratório de biologia molecular.

Iremos agora solucionar os problemas a seguir, relembrando os conceitos básicos de

Concentração, Porcentagem e Molaridade.

1) (FUVEST – SP) Se adicionarmos 80 mL de água a 20 mL de uma solução 0,1 M de hidróxido

de potássio, obtivemos uma solução de concentração molar igual a:

a) 0,010

b) 0,020

c) 0,025

d) 0,040

e) 0,050

2) Qual será a concentração em quantidade de matéria de uma solução que foi preparada
dissolvendo-se 120 gramas de hidróxido de sódio em 2 Litros de água? Dados: NaOH (PM
40g/mol).

3) Calcule a quantidade em massa (g) necessária de EDTA 0,5M (PM 372,24) para se preparar
1Litro de solução?

4) Calcule a quantidade em massa (g) necessária de EDTA 1mM (PM 372,24) para se preparar
1Litro de solução?

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AULA 3- EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO

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 AULA 4 – DIAGNÓSTICO E IDENTIFICAÇÃO PELA TÉCNICA DE ELETROFORESE.

Discussão de casos clínicos

1- teste de paternidade I: Identificar a paternidade dos supostos filhos (F1, F2, F3 e F4).

a) Através da corrida eletroforética, identifique os filhos verdadeiros e não verdadeiros se

houver. Explique como chegou a essa conclusão.

2 - Teste de Paternidade II:

a) Através da corrida eletroforética, identifique se o suposto pai é legítimo, ou não. Explique

como chegou a essa conclusão.

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3- (Unicamp) Testes de paternidade comparando o DNA presente em amostras biológicas são
cada vez mais comuns e são considerados praticamente infalíveis, já que apresentam 99,99%
de acerto. Nesses testes podem ser comparados fragmentos do DNA do pai e da mãe com o do
filho. Um teste de DNA foi solicitado por uma mulher que queria confirmar a paternidade dos
filhos. Ela levou ao laboratório amostras de cabelos dela, do marido, dos dois filhos e de um
outro homem que poderia ser o pai. Os resultados obtidos estão mostrados na figura a seguir:

a) Que resultado a análise mostrou em relação à paternidade do filho 1? E do filho 2?

Justifique.
b) Num teste de paternidade, poderia ser utilizado apenas o DNA mitocondrial? Por quê?

4- (Ufu) Dentre as aplicações atuais da genética molecular, temos os testes de identificação de

pessoas por meio do DNA. Essa técnica, que pode ser usada para identificar suspeitos em
investigações policiais, consiste em detectar e comparar sequências repetitivas ao longo de
trechos da molécula de DNA, regiões conhecidas como VNTR (número variável de repetições
em sequência). A figura a seguir ilustra os padrões de VNTRs de quatro pessoas envolvidas (
uma vítima (V) e 3 suspeitos (S1, S2 e S3) em uma investigação policial e de uma prova (P)
coletada no local do crime:

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Considerando as afirmações e a figura acima apresentada, responda: a) A qual dos suspeitos
(S1, S2 ou S3) pertence a prova (P)? Justifique a sua resposta. b) Que tipo de material pode ser
coletado e servir de prova em um caso como esse? c) Por que os resultados desse tipo de
análise têm alto grau de confiabilidade?

5- (Fuvest) TESTE DE DNA CONFIRMA PATERNIDADE DE BEBÊ PERDIDO NO TSUNAMI- Um casal

do Sri Lanka que alegava ser os pais de um bebê encontrado após o tsunami que atingiu a Ásia,
em dezembro, obteve a confirmação do fato através de um exame de DNA. O menino, que
ficou conhecido como "Bebê 81" por ser o 81º sobrevivente a dar entrada no hospital de
Kalmunai, era reivindicado por nove casais diferentes. Algumas regiões do DNA são sequências
curtas de bases nitrogenadas que se repetem no genoma, e o número de repetições dessas
regiões varia entre as pessoas. Existem procedimentos que permitem visualizar essa
variabilidade, revelando padrões de fragmentos de DNA que são "uma impressão digital
molecular". Não existem duas pessoas com o mesmo padrão de fragmentos com exceção dos
gêmeos monozigóticos. Metade dos fragmentos de DNA de uma pessoa é herdada de sua mãe
e metade, de seu pai. Com base nos padrões de fragmentos de DNA representados a seguir,
qual dos casais pode ser considerado como pais biológicos do Bebê 81?

6- (Pucmg) A anemia falciforme é uma das doenças hereditárias mais comuns no Brasil,
afetando igualmente homens e mulheres. A primeira pista sobre a natureza da alteração
molecular da hemoglobina falcêmica (HbS) foi obtida por Linus Pauling e colaboradores, que
usaram eletroforese (processo de separação de proteínas diferentes) para comparar HbS com
a hemoglobina de adulto normal, a Hb A. Uma eletroforese foi executada com cinco amostras
de sangue (I, II, III, IV e V), retiradas de diferentes pelo casal.

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Sabendo que a amostra I pertence ao pai, é correto afirmar, EXCETO:

a) A mostra de sangue III certamente pertence a uma das filhas do casal.

b) A filha adotada pode ser heterozigota desde que a mãe adotiva seja homozigota.

c) Se a mãe for heterozigota para os alelos que determinam a anemia falciforme, a amostra V
pertence à filha adotada.

d) Se a amostra V foi retirada da mãe, a amostra III só pode ter sido retirada da filha adotada.

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 Aula 5 – ELETROFORESE DE DNA

Objetivos: Aprender sobre a técnica de corrida eletroforética. Analisar fragmento de DNA em

gel de agarose para inferir tamanho e concentração.

Material:

- Proveta de 500 mL e 100 mL.

- Pipeta automática entre 1-50 uL

- Microtubos de 1,5 mL

- Agarose

- Balança, espátula e recipiente para pesagem

- Erlenmeyer

- Cuba para corrida e sistema de confecção de gel (mini)

- Microondas

- Fonte de voltagem

- Tampão TAE

- Tampão de amostra

- Loading dye (Xyleno Cianol)

- Marcador de peso molecular

- Água miliQ

Método:

- Preparo do gel de agarose.

1) Para confecção de um gel de 0,8%, deve-se pesar 0,8 g de agarose ultra pura em um
erlenmeyer e misturar em 100 mL de tampão TAE 1X.

2) Aquecer por 1 minuto no micro-ondas até a solução tornar-se homogênea e translúcida.

3) Verter a agarose ainda quente no sistema de confecção de gel e aguardar a solidificação (em
torno de 30 minutos).

4) Colocar o gel na cuba para corrida e completar a mesma com tampão TAE 1X até cobrir o gel
( 1 mm acima do gel).

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- Preparo das amostras e início da corrida.

1) Para cada 1 uL de loading dye usar 5 uL de amostra e misturá-los dentro de um microtubo

ou sob um parafilm.

2) Aplicar 5 uL de amostras no gel e do marcador de peso molecular.

3) Fechar o sistema com a tampa e plugar os cabos de energia na saída da fonte (observar o
pólo positivo e o negativo).

4) Configurar para que a corrida ocorra a 100 V durante 45 minutos.

5) Fotografar o gel de agarose sob a luz UV em 302 nm.

- Interpretação e análises de uma corrida eletroforética de DNA em gel de agarose. Utilizando

as referências do marcador de DNA (#SM0403) da empresa Invitrogen cujo é disponibilizado
on line, analise o perfil de migração das moléculas no gel e estime sua concentração e
tamanho.

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 Aula 7 – DOSAGEM DO DNA POR ESPECTROFOTÔMETRO

Objetivos: Quantificar a amostra de DNA e analisar a pureza.

Materiais

- Água Milli Q ou destilada.

- Amostras de DNA.

- Eppendorfs

- Pipetas (1-10uL, 20-100 uL e 100-1000 uL)

- Ponteiras de 10 uL, 200 uL e 1 mL)

- Cubeta de quartzo

- Espectrofotômetro.

Metodologia

1) Ligar o equipamento e aguardar a estabilização da lâmpada.

2) Configurar o comprimento de onda para 260 nm.

3) Quantificar o Branco (B).

4) Quantificar a amostra de DNA. Para a leitura da mesma, é necessário que esta esteja diluída
previamente (1/100) no mesmo tampão usado para a leitura do Branco. Após a quantificação,
anotar o valor de absorbância.

5) Ajustar o comprimento de onda agora para 280 nm.

6) Quantificar o Branco novamente (para calibração).

7) Quantificar a amostra de DNA, agora com 280 nm. Anotar o valor de absorbância.

Calcular a concentração de DNA

- Todas as amostras de DNA obtidas no laboratório podem ser avaliadas quanto à sua
concentração e à sua pureza por meio da análise da densidade óptica (DO) em
espectrofotômetro. O DNA absorve luz no comprimento de onda de 260 nm e as proteínas, de
280 nm. Diluições das amostras de DNA são preparadas com água ultrapura. A concentração
pode ser obtida pelo seguinte cálculo:

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 DNA (ng/uL) = (leitura da DO 260nm X 50 X fator de diluição).

Calcular a pureza do DNA

- A razão entre a quantidade de DNA e de proteína é usada como parâmetro para avaliação da
qualidade do DNA extraído e, desse modo, a razão DO260/DO280 pode ser usada para esse fim.
Amostras cujos valores dessa razão são inferiores a 1,8 apresentam contaminação com
proteínas.

Utilize o espaço para anotar os resultados obtidos:

Amostra DO260 DO280 Razão Concentração

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AULA 6 – REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

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AULA 8 – AS FASES DO CICLO CELULAR

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