La infancia de la señal: Estimulación transducción-GTP de cAMP Synthesis.

A finales de la década de 1960, el estudio de la acción de las hormonas floreció tras el

descubrimiento de que el monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) funcionaba como un
segundo mensajero, acoplando la activación mediada por hormonas de un receptor a una
respuesta celular. Al establecer un sistema experimental para investigar la síntesis de cAMP
inducida por hormonas, Martin Rodbell descubrió un importante nuevo jugador en la
señalización intracelular: el trifosfato de guanosina (GTP).
Fondo
El descubrimiento del papel de GTP en la regulación de la transducción de señales
Comenzó con estudios sobre cómo el glucagón y otras hormonas envían una señal a través
de la membrana plasmática que eventualmente evoca una respuesta celular. Al comienzo de
los estudios de Rodbell, se sabía que la unión del glucagón a proteínas receptoras específicas
incrustadas en la membrana estimula la producción de cAMP. La formación de cAMP de
ATP es catalizada por una enzima unida a la membrana llamada adenil ciclasa. Se había
propuesto que la acción del glucagón y otras hormonas estimulantes de cAMP dependía de
componentes moleculares adicionales que acoplan la activación del receptor a la producción
de cAMP. Sin embargo, en estudios con membranas celulares de grasa aisladas conocidas
como "fantasmas", Rodbell y sus colegas no pudieron proporcionar ninguna información
adicional sobre cómo la unión del glucagón conduce a un aumento en la producción de
cAMP. A continuación, Rodbell comenzó una serie de estudios con un sistema libre de
células recientemente desarrollado, membranas de hígado de rata purificadas, que
conservaban tanto proteínas unidas a la membrana como proteínas asociadas a la membrana.
Estos experimentos finalmente condujeron al descubrimiento de que se requiere GTP para la
estimulación de adenil ciclasa inducida por glucagón.
El experimento
Uno de los primeros objetivos de Rodbell fue caracterizar la unión del glucagón al receptor
de glucagón en el sistema de membrana hepática de rata libre de células. Primero, las
membranas de hígado de rata purificadas se incubaron con glucagón marcado con el isótopo
radiactivo de yodo (125I). Las membranas se separaron a continuación del glucagón [125I]
no unido mediante centrifugación. Una vez que se estableció que el glucagón marcado se
uniría efectivamente a las membranas celulares de hígado de rata purificadas, el estudio
continuó para determinar si esta unión conducía directamente a la activación de la adenil
ciclasa y a la producción de cAMP en las membranas celulares de hígado de rata purificadas.
La producción de cAMP en el sistema libre de células requirió la adición de ATP, el sustrato
para la adenil ciclasa, Mg2, y un sistema de regeneración de ATP que consiste en creatina
quinasa y fosfocreatina. Sorprendentemente, cuando se repitió el experimento de unión al
glucagón en presencia de estos factores adicionales, Rodbell observó una disminución del 50
por ciento en la unión del glucagón. La unión completa podría restaurarse solo cuando se
haya omitido ATP de la reacción. Esta observación inspiró una investigación del efecto de
los nucleótidos trifosfatos en la unión del glucagón a su receptor. Se demostró que
concentraciones relativamente altas (es decir, milimolares) no solo de ATP sino también de
uridina trifosfato (UTP) y citidina trifosfato (CTP) reducen la unión del glucagón marcado.
Por el contrario, la reducción de la unión del glucagón en presencia de GTP se produjo a
concentraciones mucho más bajas (micromolar). Además, se encontraron concentraciones
bajas de GTP para estimular la disociación del glucagón unido del receptor. Tomados en
conjunto, estos estudios sugieren que GTP altera el receptor de glucagón de una manera que
disminuye su afinidad por el glucagón. Esta afinidad disminuida afecta tanto a la capacidad
del glucagón para unirse al receptor como a la disociación del glucagón unido. La
observación de que GTP estuvo involucrado en la acción del glucagón llevó a una segunda
pregunta clave: ¿puede el GTP también afectar la adenil ciclasa? Para abordar esta cuestión
experimentalmente, se requirió la adición de ATP, como sustrato para la adenil ciclasa, y
GTP, como el factor que se está examinando, a las membranas hepáticas de rata purificadas.
Sin embargo, el estudio anterior había demostrado que la concentración de ATP requerida
como sustrato para la adenil ciclasa podría afectar la unión del glucagón. ¿Podría también
estimular la adenil ciclasa? La concentración de ATP utilizada en el experimento no se pudo
reducir, porque el ATP se hidrolizó fácilmente por ATPasas presentes en la membrana del
hígado de rata. Para evitar este dilema, Rodbell reemplazó ATP con un análogo de AMP, 5'-
adenil-imidodifosfato (AMP-PNP), que puede convertirse a cAMP por la adenil ciclasa,
aunque es resistente a la hidrólisis por las ATPasas de membrana. El experimento crítico
ahora podría realizarse. Las membranas de hígado de rata purificadas se trataron con
glucagón tanto en presencia como en ausencia de GTP, y se midió la producción de cAMP a
partir de AMPPNP. La adición de GTP estimuló claramente la producción de cAMP en
comparación con el glucagón solo (véase la figura 20.1), lo que indica que GTP promueve
no solo la unión del glucagón a su receptor, sino también la activación de la adenil ciclasa.
Discusión
Dos factores clave llevaron a Rodbell y sus colegas a detectar el papel del GTP en la
transducción de señales, mientras que los estudios previos no lo hicieron. En primer lugar, al
pasar de los fantasmas de células grasas al sistema de membrana de hígado de rata, los
investigadores de Rodbell evitaron la contaminación de su sistema libre de células con GTP,
un problema asociado con el procedimiento para aislar fantasmas. Tal contaminación
enmascararía los efectos de GTP sobre la unión del glucagón y la activación de la adenil
ciclasa. En segundo lugar, cuando se mostró por primera vez que el ATP influía en la unión
del glucagón, Rodbell no simplemente aceptó la explicación plausible de que el ATP, el
sustrato de la adenil ciclasa, también afecta la unión del glucagón. En cambio, eligió probar
los efectos sobre la unión de los otros nucleósidos trifosfatos comunes. Rodbell luego notó
que sabía que las preparaciones comerciales de ATP a menudo están contaminadas con bajas
concentraciones de otros nucleótidos trifosfatos. La posibilidad de contaminación le sugirió
que pequeñas concentraciones de GTP podrían ejercer grandes efectos sobre la unión del
glucagón y la estimulación de la adenil ciclasa.
Esta serie de experimentos críticos estimuló una gran cantidad de estudios sobre el papel del
GTP en la acción de las hormonas, lo que finalmente condujo al descubrimiento de proteínas
G, las proteínas de unión a GTP que acoplan ciertos receptores a la adenil ciclasa.
Posteriormente, una familia enorme de receptores que requieren proteínas G para transducir
sus señales se identificaron en eucariotas de levadura a hombre. Estos receptores acoplados
a la proteína G están implicados en la acción de muchas hormonas, así como en una serie de
otras actividades biológicas, incluida la neurotransmisión y la respuesta inmune. Ahora se
sabe que la unión de ligandos a sus receptores acoplados a proteínas G afines estimula las
proteínas G asociadas para unirse a GTP. Esta unión provoca la transducción de una señal
que estimula la adenil ciclasa para producir cAMP y también la desensibilización del
receptor, que luego libera su ligando. Ambos efectos se observaron en los experimentos de
Rodbell sobre la acción del glucagón. Por las observaciones fundamentales, Rodbell recibió
el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1994.