LA VALIDACIÓN

EN LA INDUSTRIA

Curso on line

Beatriz Soledad
Contenido

INTRODUCCIÓN................................................................................................7

MÉTODOS DE VALIDACIÓN.......................................................................11

MÉTODOS ANALÍTICOS....................................................................................11

Exactitud......................................................................................................13

Precisión......................................................................................................14

Especificidad...............................................................................................14

Límite de detección......................................................................................15

Límite de cuantificación..............................................................................15

Linealidad....................................................................................................15

Rango..........................................................................................................15

Robustez......................................................................................................16

Rudeza.........................................................................................................16
Estudios Colaborativos.............................................................................................................16

MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS.........................................................................18

Ensayos Microbiológicos Cualitativos........................................................21

Características de operación..........................................................................................................22

Exactitud...................................................................................................................................22

Recuperación............................................................................................................................22

Curva de Calibración................................................................................................................22

2
 Linealidad.................................................................................................................................23

Limites de detección.................................................................................................................23

Limite de cuantificación y detección.........................................................................................23

Precisión...................................................................................................................................23

Ensayos Microbiológicos Cuantitativos......................................................29

Características de rendimiento.......................................................................................................30

Exactitud...................................................................................................................................30

Recuperación............................................................................................................................30

Curva de Calibración................................................................................................................30

Linealidad.................................................................................................................................30

Limite de detección...................................................................................................................31

Limites de cuantificación y determinación................................................................................31

Precisión...................................................................................................................................31

PROCESOS DE FABRICACIÓN............................................................................36

Tipos de validación......................................................................................37
Prospectiva....................................................................................................................................38

Concurrente...................................................................................................................................38

Revalidación.................................................................................................................................39

Retrospectiva.................................................................................................................................39

Planificación de los estudios de validación................................................39

Prioridad de los productos y/o sistemas a validar..........................................................................40

Revalidación................................................................................................40

Elementos básicos para organizar con éxito un programa de validación. .41

3
 Implicación de la Dirección...........................................................................................................41

Creación de un Comité de Validación............................................................................................41

Formación de un Equipo de Trabajo Multidisciplinario................................................................41

Etapas en la validación de un producto o un proceso................................41

Plan Maestro de Validación...........................................................................................................42

Calificación del Diseño (DQ)........................................................................................................42

Calificación de la Instalación (IQ).................................................................................................42

Calificación Operacional (OQ)......................................................................................................42

Calificación del Funcionamiento (PQ)..........................................................................................42

Bibliografía.........................................................................................................43

PROLOGO

4
 El e-learning es el aprendizaje asistido por tecnologías de la
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6
 INTRODUCCIÓN

La calidad de los productos de una empresa es de suma importancia

tanto para su prestigio como para su desarrollo económico.

Atendiendo a esta necesidad, diversas instituciones tales como la Food

and Drug Administration (FDA), ISO 9000, las Buenas Prácticas de

7
Manufactura (Good Manufacturing Procedures (GMP´s)) la Food and
Agricultura Organization of the United Nation (FAO) y los Buenos
Procedimientos de Laboratorio (Good Laboratory Procedures (GLP´s)) han
venido formulando diferentes programas y parámetros para lograr el
aseguramiento de la calidad de los distintos productos que elaboran las
empresas.

En tal sentido, el control estadístico de calidad tiene como objetivo

monitorizar de forma continua, mediante técnicas estadísticas, la estabilidad
del proceso, y por medio de los gráficos de control este análisis se efectúa de
forma visual, representando la variabilidad de las mediciones para detectar la
presencia de un exceso de variabilidad no esperable por puro azar, y
probablemente atribuible a alguna causa específica que se podrá investigar y
corregir.

El proceso de validación exige el tratamiento estadístico para el manejo

y análisis de los datos permitiendo juicios con criterio que llevan a una
correcta evaluación. Para hablar de validación, es necesario conocer su
significado:

En 1987, la FDA la define como:

“La evidencia documentada que provee un alto grado de seguridad en

que un proceso especifico producirá en forma consistente, un producto con las
especificaciones y atributos de calidad predeterminados.”

La Agencia Europea para la Evaluación de Productos Medicinales,

2001, la define como

8
 “Es el acto de demostrar y documentar que el procedimiento opera
efectivamente”.

A través de un sistema de validación se recogen y analizan las

evidencias que sustentan la completa eficiencia de un proceso. Esto asegura
que el producto resultante de dicho proceso tecnológico posee los atributos y
características con las que fue diseñado y que estas se mantengan de lote a
lote a través de la producción.

En este punto es necesario comprobar que todos los elementos y

operaciones involucradas en el proceso productivo, han sido diseñados y/o
seleccionados adecuadamente para el fin propuesto.

Es necesario validar todos los recursos operacionales involucrados en

el proceso de manufactura de un producto. En una primera etapa se evalúan
todos los recursos operacionales que pueden introducir variaciones en el
proceso productivo como los materiales, los equipos, los métodos y desde
luego el personal.

En cuanto a los materiales se consideran tanto las materias primas

como los materiales de envase y empaque utilizados en la elaboración. Es por
ello importante verificar que los materiales se encuentran dentro de los límites
establecidos.

También se incluyen los equipos, instrumentos y aparatos que son

utilizados tanto en el proceso productivo como en los métodos de análisis; a
los cuales es importante evaluar para determinar las variaciones potenciales
que pueden ocurrir durante el proceso de manufactura; además de su
calibración y mantenimiento preventivo periódico.

9
 Con el propósito fundamental de asegurar que el proceso productivo se
encuentra bajo control, es necesario contar con procedimientos escritos para
todas las operaciones que se realizan. Esto incluye tanto las operaciones de
producción, como los procesos de control de calidad.

Finalmente se debe incluir todo el personal involucrado con la ejecución

del proceso productivo, su adecuado entrenamiento, descripción clara de sus
actividades, información detallada sobre vestimenta, equipos de seguridad y
hábitos higiénicos, necesarios para la óptima realización del proceso de
manufactura de un producto en particular.

Una vez que el proceso productivo se encuentra optimizado, es

necesario pasar a una segunda etapa la cual consiste en un sistema
documentado que permite constatar la reproducibilidad de un proceso dado.
Esto es lo que en términos generales se conoce como Validación de un
Proceso.

10
 Métodos de validación
En este capítulo se mostrarán diferentes métodos de validación
utilizados con propósitos distintos los cuales se describen a continuación:

MÉTODOS ANALÍTICOS

La validación de un método analítico es el proceso mediante el cual se

establece por medio de estudios de laboratorio que las características
representativas del método analítico cumplen con las especificaciones para su
aplicación. Señala la Australian Pesticidas and Veterinary Medicines authority
en su Guía para la validación de métodos analíticos para constituyentes
activos, productos químicos para la agricultura y la veterinaria, que el objetivo
de la validación de un método analítico es demostrar que el procedimiento,
cuando se aplica adecuadamente, produce resultados que se ajustan al
propósito del método.

Las características típicas de ejecución que deberían considerarse en la

validación de los tipos de métodos descritos se presentan en la Tabla 1.

11
 Tabla 1.- Características analíticas típicas usadas en métodos de
validación.

Exactitud
Precisión
Especificidad
Límite de detección
Límite de cuantificación
Linealidad
Rango
Robustez
Rudeza

En el caso de métodos compendiados, puede ser necesaria la

revalidación en los siguientes casos: una propuesta de la Farmacopea de los
Estados Unidos (USP) de un método analítico revisado, o el uso de un método
general establecido con un nuevo producto o materia prima.

Según la FAO (1997), en un reporte sobre la validación de métodos

analíticos para el control de alimentos

“Un método validado ideal es aquel que ha progresado completamente

a través de un estudio colaborativo, de acuerdo con los protocolos
internacionales armonizados para el diseño, conducción e interpretación del
funcionamiento de los métodos estudiados”.

Esto usualmente requiere un estudio en el cual se involucre en el diseño

un mínimo de 5 métodos de ensayo, la participación de 8 laboratorios que

12
reporten datos válidos y más frecuentemente incluyan réplicas ciegas que
aseguren los parámetros de repetibilidad de los ensayos entre laboratorios.

Los documentos ICH (International Conference on Harmonization:

Informe de Seguridad de la Conferencia Internacional de Armonización (cuyas
siglas son ICH en inglés y CIARM en español)) dan una guía sobre la
necesidad de revalidación en las siguientes circunstancias: Cambios en la
síntesis de la sustancia o del principio activo, cambios en la composición del
producto o del medicamento y cambios en el procedimiento analítico.

Estas características representativas se expresan en términos de

parámetros analíticos, que son los siguientes:

Exactitud.

Definición: es el acercamiento de los resultados experimentales

obtenidos, al valor verdadero. Se expresa como el porcentaje de recuperación
por el ensayo de cantidades conocidas adicionadas al analito.

Los documentos ICH recomiendan que la exactitud debe ensayarse

usando un mínimo de nueve determinaciones sobre un mínimo de tres niveles
de concentración, cubriendo un rango especificado (esto es, tres
concentraciones y tres réplicas de cada concentración).

Precisión

Definición: La precisión de un método analítico se refiere al grado de

concordancia entre los resultados individuales de la prueba, cuando el
procedimiento se aplica repetitivamente a muestras múltiples o a una muestra
homogénea.

13
 Los documentos IHC recomiendan que la repetibilidad debería
ensayarse usando un mínimo de nueve determinaciones cubriendo el rango
especificado para el procedimiento (esto es tres concentraciones y tres
réplicas de cada concentración o usando un mínimo de seis determinaciones a
100 % de la concentración del análisis).

Especificidad.

Definición: El documento IHC, define especificidad como la habilidad

para evaluar inequívocamente el analito en presencia de los componentes que
se espera que estén presentes, así como impurezas, productos de
degradación, y componentes de la matriz. La falta de especificidad de un
procedimiento analítico puede ser compensada por otro procedimiento
analítico de soporte. Otras autoridades internacionales (IUPAC, AOAC) han
preferido el término “selectividad” reservando “especificidad” para aquellos
procedimientos que son completamente selectivos. Para los métodos de
prueba o ensayo a continuación, la definición anterior tiene las siguientes
implicaciones:

Límite de detección

Es un parámetro de prueba límite. Es la concentración más baja a la

cual puede detectarse el analito, pero no necesariamente cuantificarse, bajo
las condiciones experimentales establecidas.

Límite de cuantificación

Es un parámetro para ensayos cuantitativos de bajos niveles de

compuestos en matrices de muestras, tales como impurezas en muestras
activas o productos de degradación en productos terminados. Es la

14
concentración de muestra en un analito que puede ser determinada con
precisión y exactitud aceptables, bajo las condiciones experimentales
establecidas.

Linealidad

Es la habilidad del método para obtener resultados en la prueba

proporcionales a la concentración del analito en muestras dentro de un rango
dado que resultan directamente o mediante una transformación matemática
bien definida. Generalmente se expresa en términos alrededor de la pendiente
de regresión lineal, calculada de acuerdo a una relación matemática
establecida de los resultados obtenidos de la prueba al analizar muestras de
concentración variable al analito.

Rango

Es el intervalo entre el nivel más alto y más bajo del analito en el que se
ha demostrado que puede ser determinado con exactitud, precisión y
linealidad, tal y como lo indica el método.

Normalmente se expresa en las mismas unidades que los resultados

de la prueba en el método analítico.

Robustez

Definición: es la medida de la capacidad de un método analítico para

permanecer inalterado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los
parámetros del método y proporciona un índice de su confiabilidad durante su
uso.

15
 Rudeza

Definición: es el grado de reproducibilidad de los resultados de la

prueba obtenidos por el análisis de una misma muestra bajo una variación de
las condiciones normales de prueba, tales como diferentes laboratorios,
analistas, ensayos, temperaturas, lotes de reactivos, días, etc. Es una medida
de la reproducibilidad de los datos de la prueba bajo las condiciones
operacionales normalmente esperadas de laboratorio a laboratorio y de
analista a analista.

La evaluación o no de los parámetros arriba mencionados dependerá

del tipo de información que se quiera obtener de dicha validación, es decir del
objetivo perseguido. Según la Food and Drug Administration (FDA) 2000. en
“Guía para la Industria”, se tienen distintas características de validación para
varios tipos de ensayos.

Estudios Colaborativos

Se realizan estudios colaborativos para evaluar la precisión intermedia

(Ej. equipos diferentes, analistas, días). También se utilizan los estudios
colaborativos para evaluar la variabilidad entre laboratorios (esto es la
reproducibilidad), en este caso un procedimiento analítico es usado en más de
un laboratorio si se compara y evalúa la precisión y exactitud de dos
procedimientos analíticos (Ej. procedimientos analíticos regulatorios y un
procedimiento analítico alternativo).

Al planificar un ensayo colaborativo, se debe considerar un

procedimiento de operación estándar adecuadamente escrito, el número de
variables a ser ensayadas y el número de réplicas requeridas (Standard
methods for the examination of water and wastewater, 1998)

16
 Cuando se realizan estudios colaborativos, deben utilizarse, si es
posible, muestras homogéneas del mismo lote. Deben analizarse
estadísticamente los resultados comparativos, discutirse y explicar cualquier
anormalidad, el número mínimo de laboratorios es de 8 y sólo en casos
especiales en los cuales se utiliza equipos muy costosos pueden conducirse
estudios con un mínimo de 5 laboratorios. En el caso de análisis cualitativos,
es necesario un mínimo de 10 laboratorios (AOAC INTERNATIONAL.
Apéndice D. 2002).

17
 MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

La importancia de la microbiología clínica, de alimentos, de productos

medicinales, de la calidad del agua, entre otros, tiene su fundamento en que
los microorganismos y sus productos, especialmente los componentes de la
pared celular, las enzimas y las toxinas, pueden causar infecciones en
humanos y animales.

Los productos medicinales deben ser particularmente seguros porque

ellos usualmente son suministrados a personas enfermas, débiles y ancianos,
que generalmente tienen el sistema inmune comprometido y no son capaces
de responder a una infección severa.

Los métodos microbiológicos convencionales están basados en el

cultivo y crecimiento sobre un agar, pudiéndose caracterizar a la colonia
después de 24 horas de incubación. Los ensayos de Gram y los ensayos
clásicos de identificación han sido exitosos en los últimos 150 años.

Los métodos encontrados en las farmacopeas consumen generalmente

mucho tiempo; el ensayo de esterilidad toma 14 días, el crecimiento y
detección de Mycoplasma, toma 35 días y el cultivo de la Mycobacterium toma
56 días. Es por ello que se presenta la necesidad de validar métodos
alternativos, por lo general más rápidos, y se hace imprescindible demostrar

18
que el método mida sólo eventos ciertos y no proporcione falsos positivos, por
lo que es preciso plantearse y responder a las siguientes preguntas:

¿Está algo ahí? (Ensayo cualitativo)

¿Cuánto hay ahí? (Ensayo cuantitativo)

¿Qué hay? (Ensayo de identificación)

Otra dificultad surge porque en la USP 26, (2003), en el apartado

(1225) relativo a “Validación de Métodos Alternativos” los documentos usan
términos familiares como linealidad, robustez, límite de detección; sin embargo
la definición de estos términos se relacionan mas con la química analítica, que
con la microbiología. En consecuencia, los datos generados algunas veces
son difíciles de interpretar. (Sutton, S. 2005).

En G-ENAC-04 (2002), se señala que la validación de los métodos de

ensayo debe reflejar las condiciones reales de ensayo. Esto puede
conseguirse utilizando productos contaminados naturalmente o productos
inoculados con un nivel conocido de microorganismos contaminantes. El
analista debe estar consciente de que la inoculación de una matriz con
microorganismos contaminantes imita tan sólo de una manera parcial la
presencia de contaminantes naturales. No obstante, a menudo es la mejor y la
única solución disponible. La extensión de la validación necesaria dependerá
del método y su aplicación.

El laboratorio debe validar los métodos normalizados aplicados a

matrices que no se especifiquen en el procedimiento normalizado.

19
 Los métodos de ensayo microbiológicos cualitativos, tales como
aquellos en los que el resultado se expresa en términos de detectado/no
detectado, y los procedimientos de confirmación e identificación, deben ser
validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad, exactitud
relativa, desviación positiva, desviación negativa, límite de detección, efecto
matricial, repetibilidad y reproducibilidad

En el caso de ensayos microbiológicos cuantitativos, debe considerarse

la especificidad, sensibilidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación
negativa, repetibilidad, reproducibilidad y el límite de cuantificación dentro de
una variabilidad establecida y, en caso necesario, determinar
cuantitativamente estos parámetros. Las diferencias debidas a las matrices
deben tenerse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestras. Los
resultados deben evaluarse utilizando métodos estadísticos apropiados.

Incertidumbre de la medida

Los análisis microbiológicos se encuadran en la categoría de los

ensayos que no permiten realizar un cálculo riguroso, metrológica y
estadísticamente válido de la incertidumbre de medida. En general, puede ser
apropiado basar la estimación de la incertidumbre en datos sobre la
repetibilidad y la reproducibilidad exclusivamente, aunque lo ideal es incluir los
sesgos (p. Ej., los sesgos detectados como resultado de la participación en
ensayos de aptitud). Los distintos componentes individuales de la
incertidumbre deben identificarse y demostrar que están bajo control y evaluar
su contribución a la variabilidad de los resultados. Algunos componentes como
los efectos del pipeteado, el pesado y las diluciones, pueden medirse

20
directamente y evaluarse fácilmente para demostrar que realizan una
contribución insignificante a la incertidumbre global. Otros componentes, como
la estabilidad y preparación de las muestras, no pueden medirse directamente
y su contribución tampoco puede evaluarse por métodos estadísticos, pero
debe considerarse también su importancia en la variabilidad de los resultados.

La AOAC INTERNATIONAL (1999), en Qualitative and Quantitative

Microbiology Guidelines for Methods Validation, y posteriormente en una
comunicación técnica de Feldine, P et al, 2002., sobre una guía para la
validación de métodos de análisis oficiales microbiológicos para alimentos
tanto cualitativos como cuantitativos, se ofrece una guía para los siguientes
ensayos:

Ensayos Microbiológicos Cualitativos

En esta sección se presentan ensayos para la presencia-ausencia de

los métodos de detección de microorganismos en las matrices de alimentos.
Sin embargo puede formar las bases para una matriz no alimenticia como
productos relacionados con drogas, preservación cosmética, eficacia
microbiológica de desinfectantes y equipos de identificación microbiana.

Características de operación

Exactitud

Se define como muestras conocidas que contienen un analito

microbiano que es correctamente identificado por el método ensayado.

21
Pueden utilizarse muestras de referencia inoculadas si están disponibles y son
aplicables.

Recuperación

No puede ser estimada para métodos microbiológicos cualitativos a muy

bajos niveles, porque la cuantificación a estos niveles no es precisa. Por esto
se estima comparando la proporción de recuperación positiva con las
obtenidas en paralelo con un método convencional reconocido, normalmente
un método ilustrativo de la AOAC o con los esperados de varios niveles de
inoculación siguiendo la distribución de la ecuación de Poisson. La
homogeneidad de la muestra es crucial para una adecuada estimación de la
recuperación.

Curva de Calibración

En microbiología cualitativa, la respuesta es típicamente no lineal

(sigmoidal) La respuesta de Poisson o alternativamente la respuesta en la
referencia opcional del método de cultivo puede usarse para la calibración.

Linealidad

No es aplicable.

Limites de detección

Estos términos no son exactamente aplicables

Limite de cuantificación y detección.

22
 Este bajo nivel se conoce como el resultado de alrededor de 40
verdaderos negativos. La interferencia en la microflora de la matriz que es
relativamente resistente a los agentes selectivos usados en el medio de
enriquecimiento, así como a otros factores, pueden afectar los valores
observados.

Precisión

Es definido en términos de repetibilidad, reproducibilidad, y las

consideraciones asociadas a positivo o negativo. Las diferentes matrices y los
diferentes analitos son considerados como fuentes primordiales de variación.

Repetibilidad Intralaboratorio.

Cada nivel en el cual se agregan cepas (al menos 3, pero

preferiblemente 5) debe ensayarse al menos en pentuplicado y
preferiblemente con 10 replicas por nivel. Si en un estudio preliminar del
Protocolo de validación (PVM) se obtiene un status OMA (Método oficial), el
número de replicas por nivel debe incrementarse a 20 con tres niveles de
inclusión de cepas (bajo, alto y sin pinchar)

Reproducibilidad Interlaboratorios.

Debe validarse en un mínimo de dos laboratorios, preferiblemente con

diferentes lotes de cada matriz. Cada nivel en el que se agregan cepas ( al
menos 3, pero preferiblemente 5) debe ensayarse al menos en pentuplicado y
preferiblemente con 10 replicas por nivel

La variabilidad de la matriz del lote es importante debido al potencial

competitivo de la microflora de lote a lote.

23
 Falsos negativos y falso positivos

Siguiendo el método oficial de procedimiento de estudio

precolaborativo, la siguiente tabla está basada en la asignación de la
respuesta del método a la presencia o ausencia del analito determinada por
inoculación o la metodología de referencia.

Sensitividad

Para las condiciones de ensayo especificadas, la sensitividad

representa la proporción de las muestras de ensayo que contiene el analito y
responde positivamente al ensayo.

Especificidad.

Para condiciones de ensayo determinadas, la especificidad es la

proporción de las muestras de ensayo que no contienen el analito, y
responden negativamente al ensayo.

Ensayo de Rudeza

Se deja a discreción el estudio del efecto de pequeños cambios en el

medioambiente sobre un método de ensayo microbiológico (Ej. Temperatura
de incubación).

Comparación con métodos de referencia existentes.

Opcionalmente, los resultados del método de estudio pueden

compararse con los resultados obtenidos por un método de cultivo
convencional usando muestras analíticas de la misma porción .
Alternativamente, es preferible incrementar el alcance de las matrices y/o lotes
de cada tipo de matriz que va a ser examinado por el método de ensayo.

24
Cuando se tiene una matriz particularmente difícil, vale la pena utilizar el
método de comparación.

Parámetros adicionales para métodos cualitativos

microbiológicos.

Matrices de muestra.

Se refiere a los métodos microbiológicos recomendados para alimentos

y grupos de alimentos. Debe escogerse matrices donde el microorganismo
crezca. Se requieren una o mas matrices diferentes por categoría de
alimentos. En un método oficial de estudio cualitativo precolaborativo, se
requieren 20 matrices si la aplicabilidad se atribuye para todos los alimentos y
5 matrices si la aplicabilidad es para una sola categoría de alimento. Se
requiere un número intermedio de matrices si la aplicabilidad es menor a todos
los alimentos pero mayor a una categoría de alimentos.

Microorganismos analitos.

En estudios precolaborativos oficiales, se usan diferentes cepas para

diferentes matrices. El analista debería investigar previamente las cepas
candidatas, bien empíricamente o bien sobre las bases de los datos de la
literatura. Generalmente, como en los estudios precolaborativos de métodos
oficiales, no se recomienda el añadir cepas con mezclas debido a las
interacciones potenciales entre cepas. Idealmente deberían ensayarse una
variedad de cepas (serotipos, etc.) de los microorganismos analitos. Cada
matriz debería ser ensayada con al menos una cepa aislada de la matriz, esto
es uno de sus contaminantes naturales. Se ha sugerido que una amplia
selección de serotipos sea estudiada.

25
 Estado de estrés del microorganismo analito

La cepa puede ser usada sin estrés o estresada, según sea lo

apropiado. Los tratamientos de estrés deberían ser descritos cuantitativamente
en términos de parámetros medioambientales, tiempo de exposición, fracción
sobreviviente de la población estresada, y la fracción de sobrevivientes
exhibiendo un nivel de injuria operacionalmente definido. Pueden utilizarse
células del analito, en muestras naturalmente contaminadas, pero el grado de
estrés generalmente será desconocido. En estudios precolaborativos de
métodos oficiales, en las muestras almacenadas “a condición” se simula el
estrés al cual los microorganismos pueden estar sujetos en una matriz
particular; para alimentos secos se usan inóculos secos y se usan inóculos
húmedos para alimentos húmedos. Se recomienda que cuando se cuenta un
inóculo sobre un medio no selectivo, se debe hacer un recuento paralelo sobre
un medio selectivo apropiado para estimar el posible estrés entre la población
del inoculo.

Niveles de agregado de microorganismos

Cada cepa es usada a un mínimo de 3 niveles por muestra analítica (25

g/mL): 1–10 ufc (unidades formadoras de colonias); 10–50 ufc ; blanco: sin
adición. Pero pueden usarse más niveles al igual que en estudios
precolaborativos no oficiales.

La cepa debería cuantificarse al momento de la inoculación por el

número mas probable (NMP) o por el conteo de colonias de suspensiones
inoculantes de bajo nivel las cuales pueden realizarse con mas exactitud si las
replicas son suficientemente altas, por ejemplo 50 – 100 ufc. En contraste, el
conteo de NMP en 3 y 5 tubos tienen un amplio límite de confianza

26
 Microflora Interferente

Opcionalmente, la mayor variable lote a lote de la matriz alimenticia,

puede ser ensayada con un competidor a un nivel que de justo un efecto
adverso medible con el medio de cultivo selectivo convencional. El analista
debería preensayar candidatos competitivos adecuados para escoger un solo
competidor competitivo por la microflora. No se recomienda el uso de una
mezcla de cepas, típicamente con habilidades competitivas no caracterizadas.
Para distinguir los efectos de los competidores a partir de los efectos de la
microflora de la matriz incurrida, el ensayo de competición debe ser corrido en
ausencia de una matriz alimenticia o con una matriz esterilizada, tan lejos
como las consideraciones puedan ser hechas para cualquier sustancia
inhibitoria inducida por el proceso de esterilización. La matriz de microflora
natural puede ser de valor en la evaluación competitiva tan lejos como la
porción de microflora que es verdaderamente competitiva sea estimada por
conteo de placas sobre un medio sólido hecha de un medio selectivo
proanalito usado en la metodología del ensayo. Pero esta porción debería
representar solamente la población potencial competidora porque esta no
toma en cuenta las velocidades de crecimiento de sus constituyentes
individuales.

Criterios de aceptación.

Deben establecerse criterios para establecer el punto de partida de una

matriz tipo dada. A niveles bajos del inóculo, (<2 ufc por tamaño de muestra
del analito), las relaciones de verdadero negativo pueden ir de < 10 a 100 %
debido a las falla al inocular o la siembra como se definió en la distribución de
Poisson. Así cuando se declara un falso negativo, el nivel del inoculo debe
también ser declarado para que se hagan las asignaciones para este. Por

27
ejemplo, un método da un valor de 21 % de falso negativo a 0.08 ufc/g de
muestra de carne podría probablemente no ser aceptada para la carne en
estudios precolaborativos, sin embargo podría aceptarse bajo esta guía
porque ellos están haciendo asignaciones para la falla estadística para fijar
este nivel de siembra. Esta asignación es hecha automáticamente por el
método de 50 % del punto final (con 95 % de limite de confianza).

Los resultados por este método pueden compararse con el máximo

teórico de 1 ufc por muestra analítica (usualmente 25 g) con un
correspondiente punto final de 0.04 ufc/g. El punto final de 50 %, calculado
según los estudios de los Métodos Oficiales, que típicamente caen en los
rangos de 0.01 – 0.10 ufc/g. Este rango, siguiendo los límites de confianza,
podría ser una base para idear un criterio de aceptación de punto de partida.

Ensayos Microbiológicos Cuantitativos.

En este apartado se describe el estudio de los métodos de conteo de

células, incluyendo los conteos de UFC y NMP. No se incluyen los ensayos
microbiológicos de antibióticos, ensayos microbiológicos de nutrientes, ni los
ensayos de toxina.

28
 Características de rendimiento

Exactitud

Usualmente se determina comparando el resultado del método del

ensayo del conteo con los de un Método Oficial o un método convencional si
no existe método oficial., en el rango de conteo aplicable.

Recuperación

Esta es la fracción del analito microbiano añadido a una muestra de

ensayo (fortificado o muestra sembrada) antes del análisis, que es medido
(recuperado) por el método ensayado. Este puede, en teoría ser corregido por
cualquier contaminante natural, presente en el analito en la muestra sin
fortificar. Con el microorganismo incurrido, la recuperación es la fracción del
analito microbiano contado por un método estándar.

Curva de Calibración.

29
 Generalmente no es aplicable.

Linealidad

En general, los métodos de conteo microbianos conducen a resultados

proporcionales a la concentración del analito, si las muestras son
cuantitativamente diluidas a una concentración en el rango apropiado. Este
rango es para dar 20–30 a 200–300 ufc por placa cultivada en un medio de
cultivo sólido.

Sujeto a unos bordes estadísticos mas amplios del método, aplica la

linealidad del método de NMP.

Limite de detección.

El contenido más bajo que puede ser medido es 10 - 100 ufc/g en

métodos de placa para matrices de alimentos. Algunas veces el tamaño de las
partículas de alimentos pueden interferir con la visibilidad de las colonias. En
el método de NMP, es de 0.03 ufc/g o menor, dependiendo del número de
tubos y el tamaño mayor de la muestra cultivada pero los límites de confianza
son amplios en el método de 3 a 5 tubos.

Limites de cuantificación y determinación.

Es la menor cantidad de analito en la muestra que puede ser

determinada con adecuada precisión y exactitud. En el método de plaqueo
convencional es de 2000 a 3000 ufc/g de alimento porque cerca de 0.01 g de
alimento puede ser plaqueado sin dificultad de detección de colonias.

El límite de determinación, que se define como el más bajo contenido

de analito que estando presente, debería ser detectado y a la vez identificado,

30
es cercano a 100 ufc/g en la metodología del plaqueo y tan bajo como 0.01
ufc/g en la metodología de NMP

Precisión

Repetibilidad Intralaboratorio

Los ensayos deben ser realizados al menos por lotes duplicados de

tipos de productos específicos, con un mínimo de 5 replicas por lote por nivel
microbiano. Para estudios precolaborativos de Métodos Oficiales, se requieren
4 niveles (control, bajo, medio y alto).

Reproducibilidad Interlaboratorio.

Se requiere un mínimo de 2 laboratorios. Las muestras estudiadas por

diferentes laboratorios necesitan ser preparadas centralmente o incluso ser
del mismo lote, a pesar de que se requieren estadísticas de verdadera
reproducibilidad. Se compara el promedio del conteo logarítmico (en base 10)
y los valores sr obtenidos por cada laboratorio para cada matriz de lote
ensayada. Se compara los respectivos valores de DERr (CVr)

Falsos positivos y falsos negativos

Tiene que tenerse en cuenta la presencia de sustancias interferentes en

un alimento para evitar los falsos positivos o los falsos negativos.

Sensitividad

Es usualmente medida en términos de parámetros previamente

definidos tales como recuperación y exactitud.

Especificidad

Es la capacidad de un método para medir solo lo que tiene que medir.

31
 Ensayo de Rudeza

La variabilidad inherente del método de conteo de microorganismos

generalmente anula el efecto de pequeños cambios en las condiciones de
operación y del medioambiente, tales como la temperatura de incubación. El
estudio de cada cambio es dejado a la experticia y discreción del laboratorio
primario.

Comparación con los métodos de referencia existentes.

Es obligatoria la comparación con los Métodos Oficiales.

Parámetros adicionales para métodos microbiológicos

cuantitativos.

Matrices

Se requiere una matriz cuantitativa para cada categoría de alimentos.

En un estudio precolaborativo cuantitativo de métodos oficiales, se requieren
20 matrices si la aplicabilidad es para todos los alimentos, y 5 matrices si la
aplicabilidad es para una sola categoría de alimentos, tales como carnes,
productos diarios, o vegetales. Se requiere un número apropiado intermedio
de matrices si la aplicabilidad es menor que todos los alimentos pero mayor a
una categoría de alimentos.

Cepas de analito microbiológico.

El ensayo puede ser realizado con una célula inoculada viable y/o con
células con un contaminante natural. Se ha recomendado que 10 cepas

32
diferentes de microorganismos relevantes sean estudiadas como cantidades
agregadas o como analitos incurridos. Sin embargo si solo una cepa particular
o serotipo es el analito de interés, puede ser suficiente una cantidad menor (p.
Ej. 5). Pero es preferible que el laboratorio que conduce el estudio tenga cepas
apropiadas para las matrices involucradas, que sean pocas para ser
estudiadas en profundidad y que, preferiblemente, se use solo una cepa por
matriz. Deben evitarse cepas mezcladas a pesar de que un método de amplia
categoría esté involucrado tal como para el conteo de mohos y levaduras,
bacterias coliformes o bacterias gram negativas. Cuando los segmentos de
inclusividad/exclusividad son realizados en los Métodos Oficiales de estudios
precolaborativos, se recomiendan 30 – 40 cepas de analitos y 10 -20 cepas de
no analito

Niveles.

Se requieren tres o más niveles de agregación de microorganismos en

la matriz para representar el rango establecido del método. Cada nivel (sin
agregar, bajo medio y alto) debería analizarse al menos 5 veces por matriz.
Debe usarse el analito en al menos 15 muestras por matriz cubriendo el rango
atribuido. En estudios precolaborativos cuantitativos de métodos oficiales, son
necesarias de 20 a 30 matrices diferentes. Los ensayos estadísticos aplicables
son la regresión, la correlación y el ensayo t-apareado.

Microorganismos interferentes

Las matrices, generalmente tienen una microflora natural. Si una

microflora natural interfiere con el método, la matriz debe ser removida de la
lista de matrices aplicables. Se usan matrices con altos y bajos niveles de

33
microflora. Idealmente la microflora debería exceder los microorganismos
indicadores en al menos 2 a 3 logaritmos en las muestras con alto nivel de
microflora.

Criterios de aceptación.

Debe establecerse la concordancia entre ensayos y los métodos

convencionales a un nivel de p = 0.05. Corrientemente no hay criterios
impresos para la aceptación de un método sobre las bases de tipos de datos
estadísticos (regresión, correlación, y ensayo t-apareado), que son
desarrollados en estudios precolaborativos de los métodos oficiales.

34
 PROCESOS DE FABRICACIÓN.

El control de calidad se efectúa en distintas etapas del proceso de

fabricación sin embargo, estos controles no aseguran la calidad de lote a lote,
con el consiguiente perjuicio para los usuarios y/o los fabricantes de un
producto en particular. Los métodos de control de calidad son técnicas
estadísticas que han sido desarrolladas para demostrar si existen o no
tendencias dependientes del tiempo en los resultados, y son ampliamente
utilizadas en el seguimiento de procesos industriales (Millar, J y Millar, J.
2002). Con el diseño e implementación de los sistemas de validación, se
puede garantizar y asegurar que el producto que se obtiene, a través de un
proceso validado, reúne las características y atributos de calidad con lo que
fue diseñado y que la probabilidad de error es mínima.

Las Buenas Prácticas de Manufactura: Inspección y Auditoria, 1986.,

definen la validación de procesos como:

“Conjunto de estudios para comprobar de forma amplia y completa y

con bases científicas la efectividad y capacidad de las operaciones unitarias y
el proceso para producir en forma continuada y sostenida formas
farmacéuticas dosificadas consistentemente uniformes dentro de un lote, y
entre lotes, que satisfacen las especificaciones y sus tolerancias y con
productividad óptima”

35
 La FDA (1983) la define como:

“La Validación de procesos es un programa documentado que

proporciona un alto grado de seguridad de que un proceso especifico
producirá una forma farmacéutica que satisface las especificaciones y
atributos de calidad predeterminados”

La Agencia Europea para la Evaluación de Productos Medicinales,

(2001) define la validación de un proceso como:

“La validación de un proceso es el medio de asegurar y proporcionar

evidencia documentada de que el proceso (dentro de los parámetros del
diseño especificados) es capaz de producir consistentemente un producto
terminado de la calidad requerida”

Tipos de validación

Para validar un proceso, es indispensable disponer de un diseño

experimental apropiado, de una metodología adecuada y de un tratamiento
estadístico apropiado de los datos obtenidos experimentalmente. Esta

36
metodología debe ser aplicada a cada uno de los factores críticos
contemplados dentro del proceso productivo

Prospectiva

Esta se lleva a cabo durante el proceso de desarrollo y es el resultado

de un análisis del riesgo en el proceso de producción. Se basa en una
planificación o Plan Maestro, en donde se detallan y estudian todos los pasos
a realizar, desde los lotes de producción a escala piloto, hasta el primer lote de
fabricación industrial.

La validación prospectiva de un proceso, conlleva, previamente a

asegurar formalmente que ciertas operaciones y procedimientos han sido
terminados satisfactoriamente.

Concurrente

Se define como el establecimiento de un programa documentado que

proporciona un alto grado de seguridad de que un proceso específico
producirá consistentemente una forma farmacéutica que lleva las
especificaciones predeterminadas y los atributos de calidad y que se sustenta
en datos o información obtenidos a partir de un proceso que se encuentra en
marcha, o en el cual se ha introducido alguna variación.

Se realiza cuando un producto se fabrica industrialmente para su salida

comercial.

37
 Revalidación

Se puede dividir en dos categorías:

a) Debida a cambios significativos sobre la calidad del producto

b) Periódica: se efectúa a intervalos programados de tiempo

Retrospectiva

Es la que se realiza para un producto que ya se viene fabricando

habitualmente, cuyo proceso no ha sufrido cambios que obliguen su
revalidación y que se efectúa a través del estudio y análisis de datos históricos
del producto y del proceso

Planificación de los estudios de validación

El cumplir las Normas de Correcta Fabricación es un requisito que

debe satisfacerse para alcanzar la calidad y productividad deseadas en toda
empresa.

En la planificación anual del Área de Fabricación debe estar

contemplada la aplicación de la validación/revalidación para las mejoras de la
calidad y productividad de cada una de las especialidades que se fabrican en
la planta industrial

El comité de validación hará responsable al equipo de validación a

través de su coordinador, de la planificación anual de validación de los nuevos
proyectos de procesos, productos y sistemas del Área de Fabricación.

38
 Prioridad de los productos y/o sistemas a validar

Se deben de tener en cuenta ciertos factores tales como:

- Los nuevos productos que han de salir al mercado. Estos tendrán una
prioridad absoluta, la cual viene dada por imposición legal. Se hará una
validación de tipo prospectiva.

- Productos y/o sistemas que no han sido validados. Se debe tener en

cuenta la complejidad del proceso de fabricación, así como la posible toxicidad
que pudiera existir en caso de incidencias.

- Productos que presentan a menudo incidencias. Se hará en todos los

casos una validación concurrente.

- Productos y/o sistemas validados.

Revalidación

Se lleva a cabo cuando existen cambios, por componentes críticos,

instalaciones, piezas críticas del equipo, tamaño del lote y desviaciones del
lote que no cumplen especificaciones. Si estas no se cumplen la revalidación
ha de ser prioritaria igual que los nuevos productos que han de salir al
mercado.

Revalidación periódica: Según las normativas de la FDA aquellos

productos y/o sistemas validados que no presenten variaciones de sus límites
específicos o cambios con el tiempo, se han de revalidar; la cual en general

39
podrá ser más sencilla que una validación prospectiva. La periodicidad de esta
revalidación estará determinada por la experiencia de cada proceso o sistema.

Elementos básicos para organizar con éxito un

programa de validación

Implicación de la Dirección

Creación de un Comité de Validación

Formación de un Equipo de Trabajo

Multidisciplinario

Etapas en la validación de un producto o un proceso

Las etapas contempladas dentro de un proceso de validación son las

siguientes:

40
 Plan Maestro de Validación

Calificación del Diseño (DQ)

Calificación de la Instalación (IQ)

Calificación Operacional (OQ)

Calificación del Funcionamiento (PQ)

A continuación los resultados del informe de PQ se añadirán a la

documentación del Plan Maestro de Validación, en donde, se resumen todos
los resultados obtenidos a lo largo del Proceso de Validación. Finalmente se
incluirá en esta última edición del Plan Maestro el informe y el certificado final
de aceptación de la validación.

41
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