Competencia: Analizar el fundamento de la reacción antígeno‐anticuerpo y su aplicación.

PRÁCTICA 3.

TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS

I. INTRODUCCIÓN

La reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ab) es el resultado de las interacciones no

covalentes (electrostáticas, hidrofóbicas y fuerzas de Van der Waals), por lo tanto es
reversible. Esta reacción se lleva a cabo entre el sitio activo del Ab (parátopo) y su
determinante antigénico específico (epítopo). Los anticuerpos son capaces de expresar
una especificidad notable y pueden distinguir pequeñas diferencias en estructura
primaria, carga eléctrica, configuración óptica y conformación estérica.
La reacción Ag-Ab posee dos características intrínsecas, la afinidad y la avidez. La
afinidad es la fuerza de unión Ag-Ab individual (un sólo sitio de unión y un sólo
determinante antigénico) y es la suma de las fuerzas de atracción y repulsión (número
y clase de interacciones). Figura 1.

Figura 1. Concepto de afinidad en la reacción antígeno-anticuerpo. Como se muestra en la

figura el epítopo de un Ag debe ser complementario con el parátopo del anticuerpo tanto en
estructura como químicamente. En la figura 1 se muestra representativamente un epítopo que
no tiene complementariedad con los parátopos a) y b); con el c) si hay complementariedad
conformacional, pero hay repulsión electrostática y sólo con el d) se muestra
complementariedad conformacional y química, por lo que es con este parátopo con el que
tendrá una mayor afinidad.

La avidez es la fuerza de unión total de un Ag con un Ab, cuando el Ag y el Ab tienen

al menos dos sitios de unión. Por ejemplo, el anticuerpo IgM por ser pentamérico tiene
mayor avidez que el anticuerpo IgG que es monomérico. Figura 2.
Aunque las reacciones Ag-Ab son específicas, existen casos en los que se dan
reacciones cruzadas debido a que dos Ag comparten determinantes antigénicos o
tienen similitud estructural. Figura 3. Aun cuando las reacciones cruzadas pueden
conferir protección contra patógenos a los cuales no se ha estado en contacto
previamente, son causa de falsos positivos en pruebas diagnósticas y también
participan en el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias.

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Figura 2. Concepto de avidez en la reacción antígeno-anticuerpo. Como se muestra en la

figura, cuando el Antígeno tiene varios epítopos y el Anticuerpo más de un parátopo, la avidez
es la fuerza de unión de todos los epítopos y parátopos.

Figura 3. Concepto de reacción cruzada. Como se muestra en la figura, el epítopo de un Ag

puede estar presente en diferentes microorganismos y los anticuerpos generados en contra
del Ag pueden reaccionar con el mismo epítopo presente en otra célula.
,
Se han desarrollado diversas pruebas inmunológicas o inmunoensayos, para detectar
la presencia de anticuerpos o de antígenos, lo cual es de gran utilidad en el
diagnóstico, terapéutica e investigación biomédica. Algunas se basan en reacciones de
precipitación y aglutinación.

Precipitación: Es una reacción Ag-Ab, en la cual el Ag se encuentra soluble y forma

un complejo Ag-Ab insoluble, constituyendo una red tridimensional que precipita
visiblemente en medio líquido o semisólido. Esta reacción requiere una incubación de
48 horas a 37ºC. Figura 4.

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Figura 4. Precipitación en agar. Las flechas muestran las bandas de precipitación formadas por
la reacción Ag-Ab.

Aglutinación: Es una reacción Ag-Ab, en la cual el Ag se encuentra particulado

(eritrocitos, bacterias o partículas sintéticas) formando un complejo Ag-Ab insoluble,
constituyendo una red tridimensional que aglutina visiblemente. Esta reacción es
instantánea y se lleva a cabo a temperatura ambiente. Figura 5.

Figura 5. Aglutinación de eritrocitos. Las flechas muestran los pozos donde hay aglutinación.

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La reacción de un Ab con su Ag homólogo produce complejos Ag-Ab cuando la

concentración es máxima y ambos reactantes están en equivalencia. Esta zona de
equivalencia se observa en las pruebas de precipitación y aglutinación. La formación de
estos inmunocomplejos tiene importancia diagnóstica y clínica. Figura 6.
Precipitado Ag-Ab

Zona de
Zona de Zona de
exceso de Ag
exceso de Ab equivalencia

Prozona Concentración de Ag Postzona

Figura 6. Curva de precipitación. A concentración constante de Ab, en la prozona existe

exceso de Ab y en la postzona existe un exceso de Ag por lo que en ambas zonas no se
forman redes de complejos Ag-Ab. En la zona de equivalencia existe una cantidad equivalente
de Ag-Ab y se forman redes de complejo Ag-Ab que forman bandas de precipitación visibles.

Otros ensayos inmunológicos no basados en reacciones de precipitación y

aglutinación, pero si en reacciones Ag-Ab, son: ELISA, radioinmunoanálisis,
inmunofluorescencia, citometría de flujo y western blot.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA): Es una técnica en la cual uno

de los reactantes, el Ab o el Ag, se fija a un soporte sólido previamente a su interacción
con la muestra biológica. Esta reacción se evidencia con un Ab secundario acoplado a
una enzima que posteriormente reacciona con su sustrato y produce una reacción
colorida. La concentración del Ag o Ab problema es directamente proporcional a la
intensidad del color. Bajo este mismo principio funcionan otras técnicas inmunológicas
como el radioinmunoanálisis (RIA) y la prueba radioalergoabsorbente (RAST). Figura 7.

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Figura 7. Placa para ensayo de ELISA. Marcado en líneas punteadas se muestra el cambio de
color resultado de la reacción Ag-Ab.

Inmunofluorescencia: Técnica basada en la reacción Ag-Ab donde el Ab esta

acoplado a una molécula fluorescente. Se utiliza para la detección de Ag microbianos o
celulares en cortes histológicos y para la detección de inmunocomplejos en las lesiones
que acompañan a muchas enfermedades autoinmunitarias e infecciosas. Figura 8.

Figura 8. Microscopia de fluorescencia. La imagen muestra en color verde los inmuno-

complejos localizados en la membrana glomerular, marcados previamente con un Ab
fluoresceinado.

Citofluorometría de flujo (FACS): Esta técnica se basa en la determinación de varias

características celulares en forma simultánea y permite cuantificar en una mezcla en
suspensión diferentes poblaciones celulares a través el uso de anticuerpos
monoclonales acoplados a fluorocromos. Una aplicación de esta técnica es cuantificar
los linfocitos T CD4+ y T CD8+, de utilidad en el seguimiento de la infección por el virus
de inmunodeficiencia humana (VIH), así como en el diagnóstico de leucemias e
inmunodeficiencias primarias, secundarias y perfil inmunológico. Figura 9.

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Figura 9. Gráfica de citometría flujo. Se observan las poblaciones de leucocitos de sangre

periférica distribuidas por su tamaño y granularidad. A partir de los leucocitos de morfología
linfoide, se analizan los CD3+(T) productores de IL-2.

Western-blot (WB): Es una técnica que permite la identificación de proteínas en una

muestra biológica. Consiste en tres etapas: en la primera se utiliza una electroforesis
para separar las proteínas (Ag) de acuerdo a su peso molecular. La segunda es la
transferencia de las proteínas a una membrana de soporte (PVDF) y la última consiste
en la identificación de Ag con el uso de Ab acoplados a una enzima, la cual al
reaccionar con su sustrato cambia de color. Es una técnica empleada para el
diagnóstico confirmatorio de la presencia de la infección por VIH entre otras. Figura 10.

Figura 10. Membrana de WB. Carril 1: Control positivo (proteínas de cápside de VIH). Carril 2:
control negativo. Carriles A, B y C muestras problema para confirmación de infección por VIH.
A: Negativo. C Positivo.

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Pruebas inmunológicas rápidas: Estas incluyen a la inmunocromatografía que

permite realizar la detección de un Ag o Ab de forma semicuantitativa a través de la
acumulación de la muestra en oro coloidal conjugado con Ab o Ag adsorbidos en zonas
específicas de una membrana de nitrocelulosa. Cuando se agrega una muestra
biológica, en caso de que contenga el Ag de interés ocurrirá la reacción Ag-Ab y se
observará una banda colorida. Figura 11.

Figura 11. Principio de la reacción de Inmunocromatografía.

Uno de los estudios que permiten evaluar el estado inmunológico de un paciente es la

linfoproliferación.

Linfoproliferación
En el caso de que además de evaluar el porcentaje y concentración en sangre
periférica de linfocitos T CD3+, Th CD3+CD4+, Tc CD3+CD8+, B CD19+ y NK
CD16+56+ por citometría de flujo, el médico especialista requiera determinar la
funcionalidad de los linfocitos T, al menos en lo que respecta a la capacidad de hacer
proliferación clonal y producción de citocinas, existen pruebas especiales que permiten
simular in vitro la activación del TCR. Para estas pruebas se toma una muestra de
sangre periférica, de la cual se purifican las células mononucleares (linfocitos y
monocitos), estas se cultivan en condiciones de esterilidad y son estimuladas con
diferentes activadores o mitógenos policlonales, los cuales son proteínas de origen
vegetal que se unen a carbohidratos (lectinas), los más comúnmente utilizados son
fitohemaglutinina (PHA) y concanvalina-A (ConA). Estas lectinas se unen
específicamente a ciertos azúcares situados en las glucoproteínas de la superficie del
linfocito T, como las proteínas TCR y CD3 y por ello simula la activación antígeno
específica, induciendo que estas células proliferen. Dado que un linfocito T tarde
aproximadamente 12 h en hacer una mitosis, es necesario dejar el cultivo entre 3 a 5
días para poder apreciar la proliferación. En general, en la muestra de un individuo
sano se obtiene un 30% del total de linfocitos T cultivados y es importante mencionar
que esta proliferación no es antígeno específica.

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Además de estas lectinas se puede conseguir el mismo efecto si las células son
tratadas con agentes farmacológicos tales como el PMA, el cual activa la vía de la
PKC.
a b c

Figura 12. Linfoproliferación. a) Se aprecia la muestra de sangre total centrifugada sobre Ficoll-
hypaque, lo cual permite la purificación de células mononucleares de sangre periférica. b)
cultivo de estas células y adición de los mitógenos policlonales. c) Posterior a 5d de la adición
de los mitógenos policlonales se muestra un 30% de linfocitos proliferantes.

Como ejemplo de una prueba inmunológica rápida, está la determinación de Ag

prostático específico (PSA) por inmunocromatografía. Esta prueba tiene un rango de
detección de 2 a 20 ng/mL. Un resultado positivo está relacionado con diferentes
patologías infecciosas, inflamatorias, hiperplasias y neoplasias.

II. OBJETIVOS

1. Conocer las características de la reacción Ag-Ab

2. Entender el fundamento y aplicación de las técnicas inmunológicas como
auxiliares en el diagnóstico.
3. Evidenciar la reacción Ag-Ab en una prueba rápida por inmunocromatografía.

III. MATERIAL Y MÉTODOS

Material Reactivos Muestra biológica

- Kit de prueba rápida inmunológica: PSA - 1 mL de suero
- Pipeta de Pasteur

IV. PROCEDIMIENTO

1. Con la pipeta Pasteur deposite 1 gota de suero en el cassette en el pozo marcado

como “S”.
2. Esperar 15 segundos para la absorción de la muestra y colocar 3 gotas de solución
amortiguadora en el mismo pozo.
3. Incubar durante 7 minutos a temperatura ambiente e interpretar el resultado. Prueba
inválida después de 15 minutos de incubación.

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Lectura de Resultados

POSITIVO

A) Si las 3 líneas están presentes C, R y T y la intensidad de la línea T es menor

que de la línea R, la concentración de PSA es mayor de 2 y menor de 4 ng/mL.

(
C

B) Si las 3 líneas están presentes C y la intensidad de la línea R y T es igual la

concentración de PSA es igual a 4 ng/mL.

C) Si las 3 líneas están presentes C, R y T y la intensidad de la línea T es mayor

que de la línea R, la concentración de PSA es mayor de 4 y menor de 10 ng/mL.

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NEGATIVO

- Sólo se observan las bandas de C y R.

PRUEBA NO VÁLIDA

- Se pueden observar las líneas R y/o T, pero no se observa la línea C. En este caso, la
prueba no es interpretable y se tiene que repetir.

V. RESULTADOS

1. Interpretar el resultado de la muestra problema.

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VI. CUESTIONARIO

1. Respecto a las pruebas diagnósticas ¿A qué se refieren los términos sensibilidad y

especificidad?
2. Respecto a las pruebas de detección de HIV, ¿Qué detecta la prueba de ELISA de
cuarta generación?
3. En un paciente que se confirma la infección por HIV a parte del estudio clínico, es
necesario completar la historia del paciente con un conteo de linfocito T CD4 y la
determinación de la carga viral. Al respecto de esta prueba:
a) ¿A través de qué técnica se realiza este estudio?
b) ¿Qué muestra biológica se requiere?
c) ¿Cuál es el resultado que se provee este estudio?
4. Mencione algún antígeno que se compartan entre un microorganismo y las células de
humano y que los anticuerpos den reacción cruzada.
5. La siguiente imagen es el resultado del estudio inmunofenotípico de linfocitos de
sangre periférica en un paciente con sospecha de una inmunodeficiencia primaria. ¿A
qué población linfocitaria pertenecen las células de las regiones R-4, R-5 y R-6?

CD-56 PE

CD-3 FITC

VII. BIBLIOGRAFÍA

1. Parham P. El sistema inmune. 4ª ed. México: Manual Moderno., 2016. 600 p. ISBN:
9786074485646.
2. Pavón L, Jiménez MC, Garcés ME. Inmunología (molecular, celular y
traslacional). 1° ed. Wolters Kluwer., 2016. 700 p. ISNB: 9788416004867.
3. Abbas A, Lichtman A, Pillai S. Inmunología Celular y Molecular. 8ª ed. España:
Elsevier., 2015. 537 p. ISBN: 9788490228944.

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