UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MANABÍ

FACULTAD DE INGENERÍA AGRONÓMICA

CARRERA DE AGRONOMIA

TEMA
Efecto de tres medios de cultivo en la micropropagación de (Swietenia
macrophylla King) especie forestal en peligro de extinción.

AUTOR (ES)

BACUSOY RODRIGUEZ JONATHAN GABRIEL

MACÍAS DE LA CRUZ GEMA ANDREA

TUTOR (A) DE TESIS

ING. LILIANA COROZO QUIÑONEZ Mg. Sc.

SANTA ANA – MANABÍ – ECUADOR

2018
 CAPITULO I
1.1 INTRODUCCION

La Caoba, es una especie forestal con alto valor económico en el mundo por la
calidad de la madera, por ello, ha sido objeto de una intensa explotación en Ecuador entre
los años 1980 y 1990. Al momento, las poblaciones de caoba silvestre solo son posibles
de encontrar en comunidades de las provincias de Pastaza y Morona Santiago en la región
Amazónica. Por lo cual, el Ministerio del Ambiente (MAE) acordó brindar apoyo a las
poblaciones que aún la conservan en proyectos de ecoturismo, planes productivos,
inclusión en Socio bosque, así como la opción de manejo de otras especies forestales que
sustituyan la posible explotación de caoba.
En nuestro país, la zona sur de Manabí, tiene una gran variedad de especies
maderables, cuenta aún con bosques primarios, zonas de reserva y a pesar de eso el
hombre no ha respetado la naturaleza, ya que ha deforestado en forma indiscriminada los
bosques para hacer uso de este recurso. Esta especie su propagación tradicional ha sido a
través de regeneración natural.
Una de las estrategias para superar las dificultades de propagación y evitar la
extinción de especies valiosas, es el cultivo in vitro de tejido vegetal (Delgado et al. 2008).
El cultivo in vitro de tejidos vegetales es una técnica que permite la propagación clonal
de especies de interés o de difícil propagación mediante los métodos tradicionales; así
como, variedades que se pretenden someter a protocolos de transformación genética
(Martínez 2014). La propagación in vitro incrementa de forma rápida el número de
individuos, esta etapa es importante en la producción de plántulas a nivel industrial, ya
que permite el establecimiento de un banco de germoplasma con fines de rescate (Uribe
et al. 2008). Además, permite obtener plantas libres de enfermedades, en algunas
ocasiones reduce el tiempo de propagación (Rebolledo et al. 2006).
Se realiza en medios de cultivos artificiales, lo cuales proporcionan los nutrientes
necesarios que la planta toma de la tierra en su habitad natural y precisamente el éxito de
este tipo de cultivo está influenciado grandemente por la naturaleza del medio de cultivo
utilizado y otros factores ambientales.
Los medios de cultivo tienen una serie de componentes generales y específicos
cuya presencia y concentración estará en dependencia del objetivo que se persiga en su
utilización. Están constituidos por sustancias minerales, vitaminas, aminoácidos,
azúcares, reguladores del crecimiento y otros elementos.

¿La caoba (Swietenia macrophylla King), responde al cultivo in vitro de tejidos

vegetales?

1.2 ANTECEDENTES
En el pasado, la actividad agrícola era el resultado de una experiencia empírica,
basada en un cierto equilibrio entre la fertilidad del medio natural, las técnicas conocidas
y las circunstancias económicas y sociales. A fines del siglo XVIII y principios del siglo
XIX, el crecimiento demográfico, el desarrollo de una economía de mercado, el
nacimiento de la industria, los nuevos conocimientos sobre química, han contribuido a
cambiar, la actividad agrícola y los discursos sobre agricultura.
En un principio los investigadores sugerían que las células en las plantas se
diferenciaban al retener sólo aquella parte del genoma necesario para el tipo celular del
órgano al que estaban destinadas. Se pensaba que debía haber factores externos que
provocaban que las células cambiaran tomando gran diversidad de formas y funciones.
Sin embargo, en experimentos realizados por Vochting en 1878 sobre la polaridad
celular, se observó que células de tallos eran capaces de rediferenciarse y formar raíces y
brotes, lo que demostró que la diferenciación no era permanente, sino que estaba dada por
la posición relativa de la célula en la planta (Bhojwani y Razdan 1983, Ferl y Paul 2000).
Ahora se sabe que la diferenciación celular está regulada por la expresión genética y que
no implica la pérdida de material genético (Ferl y Paul 2000)
En investigaciones desarrolladas sobre el tema de diferenciación celular, Gottlieb
Haberlandt en 1898 aisló células y tejidos de plantas superiores y las colocó en soluciones
nutritivas para su crecimiento y estudio, dando origen de esta manera a la técnica de
cultivo de células y tejidos vegetales. Así, Haberlandt fue el pionero en el cultivo in vitro
de células vegetales completamente diferenciadas, habiendo reportado sus estudios y
resultados en 1902, según lo indican Krikorian y Berquam (1969). Haberlandt propuso
que era posible cultivar juntas células vegetativas libres y túbulos de polen adicionando
soluciones nutrientes suplementadas con extractos de ápices vegetativos o con fluidos de
sacos embrionarios. Es por ello que ahora se considera a Haberlandt como el padre de la
técnica de cultivo de células y tejidos vegetales, la cual se ha convertido en el dogma
central de la Biotecnología Vegetal.
 Después de Haberlandt, no fue sino hasta los años 30's que White en Estados
Unidos y Gautheret en Francia, demostraron de forma definitiva la posibilidad de cultivar
células vegetales in vitro. En ese tiempo hubo dos grandes descubrimientos que
repercutieron de manera fundamental sobre el desarrollo de la técnica de cultivo de
células y tejidos vegetales: primero, la identificación de las auxinas como
reguladoras naturales del crecimiento vegetal, y segundo, el reconocimiento de la
importancia de las vitaminas del complejo B en el crecimiento de las plantas.

En 1934, Gautheret cultivó células de cambium de algunas especies en una

solución mineral con glucosa y cloruro de cisteína. Encontró que dichas células
proliferaban por algunos meses y que adicionando vitaminas y ácido indolacético (AIA)
se estimulaba considerablemente su crecimiento. Más tarde, en 1939 White reportó el
establecimiento de cultivos similares, pero a partir de tejidos tumorales de un híbrido
de Nicotiana glauca X N. langsdorffii. Estos investigadores junto con Nobecourt, quien
reportó en ese mismo año el establecimiento de un cultivo similar a partir de zanahoria,
son los tres investigadores considerados los pioneros de la técnica del cultivo de células
y tejidos vegetales (Bhojwani y Razdan 1983, Street 1977).
 1.3 JUSTIFICACION

Los medios de cultivo para la propagación in vitro. Constituyen un elemento

fundamental para el cultivo in vitro de células, tejidos y órganos para lograr el desarrollo
de los mismos in vitro. Ya que estos tienen una serie de componentes generales y
específicos. Los mismos están constituidos por sustancias minerales, vitaminas,
aminoácidos, azúcares, reguladores del crecimiento y otros elementos.
Este se realiza en medios de cultivos artificiales, lo cuales proporcionan los
nutrientes necesarios que la planta toma de la tierra en su habitad natural y precisamente
el éxito de este tipo de cultivo está influenciado grandemente por la naturaleza del medio
de cultivo utilizado y otros factores ambientales.
Para el mismo se requieren un conjunto de herramientas biotecnológicas con
muchas ventajas y aplicaciones, que se basa en la totipotencialidad de las células
vegetales, es decir, que, a partir de una célula en medio de cultivo nutritivo, podemos
crear una nueva planta completa. Entonces, dependiendo de la aplicación de esta
herramienta, será el tejido a emplear, pudiendo obtener explantes a partir de semilla, hoja,
tallo, raíz, anteras, polen, etcétera. Por lo que con cualquier célula vegetal podemos
propagar, producir o desarrollar una nueva planta. Es decir, el cultivo in vitro permite
propagar más cantidad de plantas en menor tiempo y espacio, a partir de cualquier tejido.
En las regiones tropicales y subtropicales hay gran urgencia por encontrar
alternativas nuevas que permitan multiplicar y mantener el acervo genético de especies
amenazadas. Caoba está incluidas en la lista de especies prioritarias de la Convención
para el Comercio Internacional de Especies de Flora y Fauna en Peligro de Extinción
(CITES). Por esta razón, su conservación, estudio de la variabilidad genética,
propagación y uso sostenible cobran gran importancia. Un método de cultivo de tejidos
exitoso significaría una opción alternativa de propagación y ayudaría en los esquemas de
mejoramiento genético para seleccionar clones resistentes a enfermedades o insectos
(Mittal et al. 1989), así como en los programas de conservación de la especie.
 1.4 OBJETIVOS

General
Evaluar el efecto de tres medios de cultivo para la micro propagación de Caoba

Específicos

 Desarrollar un protocolo para el establecimiento in vitro de semillas de caoba

 Determinar la respuesta de la Caoba a los medios de cultivo.
 Enraizar los brotes obtenidos en el laboratorio.

CAPITULO II

2. MARCO REFERENCIAL
Importancia económica
Generalidades de la variedad de caoba
Importancia de la propagación in vitro en Caoba
 CAPITULO III
3.1. DISEÑO METODOLÓGICO

Ubicación
La presente investigación se realizará durante los meses de julio a diciembre del 2018, en
el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ingeniería Agronómica de la
Universidad Técnica de Manabí (UTM). El material vegetal de caoba nativa (Swietenia
macrophylla King), el material vegetal será colectado en el jardín botánico UTM.

3.2 Variables a analizar

Fase de establecimiento
 Tiempo de respuesta
Se registrará el tiempo de respuesta en días, desde el momento del establecimiento hasta
la observación de los brotes. Esta variable se evaluará una sola vez.

 Porcentaje de contaminación

Se evaluará el número de brotes contaminados por bacterias y hongos. Las evaluaciones

tendrán una duración 15 días. Se realizarán a los 7 DDS y 15 DDS a partir de la siembra.

Fase de multiplicación in vitro

 Número promedio de brotes emitidos

Se contabilizará por tratamiento y repetición, el número de nuevos brotes emitidos, esta

actividad se realizará a cuarta semana después de la siembra (DDS), cada cuatro semanas
hasta el final del periodo de multiplicación

 Longitud de brotes

Por cada tratamiento se medirá la longitud de 5 brotes de las 3 repeticiones, dando un

total de 15 brotes tomados al azar. Dichas evaluaciones se realizarán cada cuatro semanas
DDS. Esta variable se medirá con un calibrador y en condicione de cámara de flujo.

 Diámetro de brotes

Al mismo momento que se mide la longitud de brotes se medirá el diámetro o sea a las
cuatro semanas DDS, de quince (15) brotes por tratamiento.

3.3 FACTORES EN ESTUDIO

 Caoba
 Medios de Cultivo
 4. Metodología
Selección y preparación del material de campo

Se utilizarán semillas de frutos de caoba se colocarán en un vaso de precipitado y

se lavarán con jabón líquido durante 4 minutos y se procederá a enjuagar con
abundante agua esterilizada que nos permitirá obtener semillas libres de impureza.
Enseguida la semilla será colocada en un otro vaso de precipitación y se llevará a
condiciones de asepsia (cámara de flujo laminar) para la desinfección, con una
solución de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 5% y gotas de Tween-20 durante 20
minutos, luego de este lapso se enjuagarán por tres ocasiones con agua
esterilizada.
 Introducción de los brotes
Con la finalidad de seleccionar los brotes libres de contaminación, previo a la siembra en
los tratamientos en estudio los brotes serán colocados en un medio Murashige y Skoog
(1962) básico en tubos de ensayo tapados y sellado con plástico de embalaje. Se evaluará
el porcentaje de contaminación y sobrevivencia a las 6, 8, 10 semanas, después de la
introducción.

Evaluación de la mejor respuesta del medio de cultivo para el desarrollo de los

brotes in vitro
 Multiplicación de brotes.
Los brotes serán transferidos a los medios de multiplicación. Los subcultivos de los
pequeños brotes producidos se efectuarán cada 10 semanas, colocándolos para
propagarlos en un nuevo medio de cultivo. En cada una de las fases del cultivo, realizada
la siembra, el material vegetativo se mantendrá en cuarto de crecimiento con un
fotoperiodo de 16 horas luz y 8 de oscuridad y una temperatura de 26 + 2 grados
centígrados.

Para el desarrollo de las fases in vitro se utilizará la cámara de flujo laminar, autoclave,
refrigerador, balanza analítica, planchas de agitación, marcador, pinza, bisturí, beakers,
erlenmeyer, tubos de ensayo, goteros, mechero, soluciones buffer, papel aluminio, papel
craf, material de vidrio y plástico, alcohol (70º y 90º), hipoclorito de sodio (cloro
comercial), sales minerales, vitaminas, fuente de carbono y Fito reguladores del
crecimiento, entre otros insumos.

Determinación de la respuesta del mejor medio de cultivo para la

micropropagación de Caoba

La determinación de la respuesta del mejor medio se evaluará con base al número de

brotes promedio a los tratamientos
PRESUPUESTO

ITEMS VALOR CANTIDAD VALOR VALOR

UNITARIO TOTAL

Copias 400 $ 0,02 $ 8,00

Internet / horas 100 $ 1,25 $ 125,00

Libros, revistas 5 $ 50,00 $ 250,00

científicas

Transporte Global $ 15,00 $ 150,00

Alimentación Global $ 10,00 $ 100,00

Cámara digital 1 $ 35’,00 $ 350,00

Materiales de Global $ 480,00 $ 480,00

Laboratorio

Copias de la tesis 600 $ 0,02 $ 12,00

Impresión de la 150 $ 0,15 $ 22,50

tesis

Imprevistos Global $ 500,00 $ 500,00

TOTAL $ 2,000,00 $ 2,000.00

 IV. RESULTADOS ESPERADOS

En el marco de este proyecto, se sentará las bases científicas para determinar la mejor
respuesta de auxinas y citoquininas para la multiplicación in vitro de brotes de Caoba
(Swietenia macrophylla King), en el laboratorio de Biotecnología de la Facultad de
Ingeniería Agronómica.
Cronograma de actividades

Actividades Meses / Semanas

Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Establecimiento de ápices de caoba en
laboratorio
Colecta de material en campo
Reducción de tamaño de explantes
Desinfección del material en laboratorio
Siembra de ápices
Multiplicación de brotes in vitro
Micropropagación de los explantes
Determinación de la mejor
concentración de citoquinas y auxinas
para el desarrollo de los brotes in vitro
Registros de datos
I. BIBLIOGRAFIA